树突状细胞对小鼠实验性自身免疫性甲状腺炎的作用①
作者：王胜军 许化溪 刘恭植 柳龙图②
单位：王胜军 许化溪 刘恭植 柳龙图 镇江医学院免疫学研究室，镇江212001；江淑芳 南京81医院，南京210002
关键词：树突状细胞；自身免疫；甲状腺炎；小鼠
中国免疫学杂志990703 中国图书分类号 R392.12
摘 要 目的：研究树突状细胞(DC)对小鼠实验性自身免疫性甲状腺炎(EAT)的作用。方法：体外检测TgAb、Tg刺激的淋巴细胞增殖能力、IL-1、TNF水平， 并对甲状腺进行病理学检查。结果：DC注射组早期TgAb、Tg刺激的淋巴细胞增殖能力以及IL-1的水平均显著高于DC不注射组，但TNF水平在两者间无明显差异；经DC 单抗处理组的上述指标均低于DC注射组；病理学检查表明DC注射组甲状腺局部病变较其它各组严重。结论：DC对小鼠EAT具有明显促进作用。
, 百拇医药
The effects of dendritic cell in murine experimental autoimmune thyroiditis
WANG Sheng-Jun,XU Hua-Xi,LIU Gong-Zhi et al.
Department of Immunology,Zhenjiang Medical College, Zhenjiang 212001
Abstract Objective：To investigate the function of dendritic cell in murine experimental autoimmune thyroiditis.Methods:Levels of thyroglobulin antibody , interleukin-1 and tumor necrosis factor, proliferation of lymphocyte to thyroglobulin stimulation were detected in vitro. The histological pictures of thyroid were assessed.Results:The levels of TgAb ( early phase) and IL-1, proliferation of lymphocyte to thyroglobulin stimulation in the DC group were higher than that in the non-DC group(P<0.01),but the levels of TNF weren't significantly different between two groups(P>0.05).These data in monoclonal antibody(33D1) group were markedly decreased.In addition,the pathologic pictures showed that the damage of thyroid was heavy in DC group.Conclusion:These suggested that the DC could improve the progress of murine experimental autoimmune thyroiditis.
, 百拇医药
Key words Dendritic cell Autoimmune Thyroiditis Mice
树突状细胞(Dendritic cell,DC)是一类重要的抗原递呈细胞， 其以抗原非内在化的方式递呈外来抗原或自身抗原而引发免疫应答，既可排除抗原异物，亦可导致自身免疫反应，使局部组织出现免疫病理损伤。小鼠EAT 是用来研究人类桥本氏甲状腺炎(HT)的动物模型，其甲状腺病理变化主要表现为淋巴细胞浸润为主的慢性炎症反应[1]。本文对DC在EAT中的作用进行了初步的研究，旨在进一步探讨DC与自身免疫性疾病的关系。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 小鼠甲状腺球蛋白(Tg，本室自制)，HRP-羊抗小鼠IgG(华美生物工程公司)，MTT(Fluka公司)，ConA( Sigma 公司)， 小鼠 DC 单克隆抗体 33D1 (美国Rockefeller大学Steinman教授惠赠)，其余均为国产分析纯试剂。
, http://www.100md.com
1.2 动物与细胞株 CBA小鼠，雌性，8周龄，20 g左右；WEHI 164细胞株由北医大免疫学系提供。
1.3 小鼠模型建立及分组 DC分离和模型建立分别参照文献[2，3]。设置①EAT组；②DC注射组，采用新鲜分离的脾DC(1.0×106 ml-1)，加入Tg(100 μg/ml)，37℃、5%CO2孵育18 h，洗涤3次，作为Tg预刺激DC，在Tg+CFA注射后3 d，皮下注射Tg预刺激DC，每只0.5 ml(含5×105 DC)；③33D1注射组，注射DC同时，每只小鼠尾静脉注射33D1单抗；④正常对照组，未作任何处理。以上各组动物分别于免疫后第6周和第12周检测各项指标。
1.4 小鼠血清TgAb检测 采用常规间接ELISA法，结果以OD490表示。
1.5 体外Tg刺激的淋巴细胞增殖试验 分离小鼠脾脏单个核细胞，配制细胞浓度为1.0×107 ml-1，加入96 孔细胞培养板中，加入Tg(20 μg/ml)，37℃、5%CO2孵育72 h， 在终止培养前6 h ， 加入 MTT(5 μg/ml)，继续培养6 h，加入酸化异丙醇，振荡10 min，待完全溶解后检测OD570值。
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1.6 小鼠血清IL-1检测 采用C3H/HeJ小鼠胸腺细胞增殖试验，结果以OD570值表示。
1.7 TNF的诱生及检测 分离小鼠脾脏单个核细胞，配制细胞浓度为1.0×107 ml-1，加入ConA(5 μg/ml)，37℃、5%CO2孵育48 h，收集上清。TNF活性检测参见文献[4]，结果以细胞毒性(%)表示。
1.8 病理学检查 取小鼠甲状腺组织，作常规病理形态观察。
2 结果
2.1 小鼠血清TgAb水平 经Tg+CFA初次免疫后第6周，EAT组和DC组小鼠血清中TgAb均较正常对照组有明显升高，尤以DC组为著；至第12周，EAT组和DC组小鼠血清中TgAb 较正常对照组升高4倍以上，但EAT组和DC组之间无显著性差异，经33D1单克隆抗体处理组小鼠血清中TgAb水平较DC组有明显下降，结果见表1。
, 百拇医药
表1 小鼠血清TgAb水平(n=5)
Tab.1 The level of thyroglobulin antibody (TgAb) in serum(n=5) Groups
6 weeks
12 weeks
Control
0.21±0.05
0.31±0.08
EAT
0.44±0.071)
1.36±0.121)
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DC
0.67±0.101)2)
1.47±0.181)
33D1
NT
0.68±0.063)
Note:1)compared with control:P<0.01;2)compared with EAT:P<0.01;3)compared with DC:P<0.01; 4)NT:not tested
2.2 体外Tg刺激的淋巴细胞增殖试验 无论在初次免疫后第6周还是第12周，EAT组和DC组经Tg刺激的淋巴细胞增殖能力均强于正常对照组,并且DC组的增殖能力亦均高于EAT组，经33D1单克隆抗体处理的增殖能力明显低于DC组，结果见表2。
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表2 不同组别小鼠体外Tg刺激的淋巴细胞增殖能力比较(n=5)
Tab.2 The comlparison of lymphocyte proliferation to Tg in different groups(n=5) Groups
6 weeks
12 weeks
Control
0.36±0.05
0.42±0.05
EAT
0.49±0.041)
, http://www.100md.com
0.67±0.061)
DC
0.69±0.041)2)
1.79±0.021)3)
33D1
NT
0.57±0.084)
Note:1)compared with control:P<0.01; 2)compared with EAT:P<0.01;3)compared with EAT:P<0.05;4)compared with DC:P<0.01; 5)NT:not tested
, 百拇医药
2.3 不同组别小鼠IL-1和TNF水平 各组小鼠经初次免疫后第12周时IL-1和TNF水平见表3，结果显示EAT组和DC 组IL-1水平均高于正常对照组，且DC组的IL-1水平高于EAT组，但经33D1 单克隆抗体处理组小鼠的IL-1水平明显低于DC组；EAT组和DC组小鼠TNF水平高于正常对照组，但DC组和EAT组之间无显著性差异，经33D1单克隆抗体处理组小鼠TNF水平明显低于DC组。
表3 不同组别小鼠IL-1和TNF水平(n=5)
Tab.3 The levels of IL-1 and TNF in different groups(n=5) Groups
IL-1(OD570)
TNF(%)
Control
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0.93±0.08
20.62±2.62
EAT
1.27±0.201)
39.13±8.264)
DC
1.53±0.091)2)
41.29±5.104)
33D1
1.07±0.143)
, http://www.100md.com 22.55±8.865)
Note:1)compared with control:P<0.01;2)compared with EAT:P<0.01;3)compared with DC:P<0.01;4)compared with control:P<0.05;5)compared with DC:P<0.05
2.4 病理学观察 EAT组和DC组小鼠甲状腺组织在光镜下可见有较多淋巴细胞浸润，部分甲状腺滤泡出现萎缩现象，尤以DC注射组表现最为明显，而正常对照组未见上述病变。
3 讨论
HT是一类针对自身抗原(如Tg、TPO)产生免疫应答导致甲状腺功能损害的自身免疫病。APC是启动和调节自身免疫应答过程中的一个重要因素，Mφ和DC是两类主要的抗原递呈细胞，但DC递呈可溶性抗原诱导免疫应答的能力强于Mφ[5]，因此针对Tg和TPO的自身免疫应答中DC可能起着极其重要的作用。
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在诱导小鼠EAT的同时，我们应用新鲜血分离的DC或DC单抗注射小鼠体内，同时以EAT组和正常小鼠作为对照，研究DC在小鼠EAT发生发展中的作用，结果显示：经DC注射的小鼠，早期(6 w)产生TgAb的能力显著增加，体外Tg 刺激的淋巴细胞增殖能力无论是在早期(6 w)还是晚期(12 w)，DC注射组的增殖能力均明显高于其它各组，而经DC单抗处理的小鼠的TgAb水平及体外Tg刺激的淋巴细胞增殖能力均较DC注射组有显著下降，由此看来，DC参与了EAT的启动和延续的整个过程，DC 通过其树突状表面以膜结合方式捕获自身抗原后[6]，可将其递呈给局部浸润淋巴细胞， 触发自身免疫反应的发生而导致局部组织功能受损，病理形态学检查也证实DC注射组小鼠甲状腺内淋巴细胞数目较多，形成淋巴细胞浸润灶，并且甲状腺滤泡萎缩现象严重。
细胞因子与自身免疫性疾病有着密切的关系，特别是IL-1和TNF是一对具有多种生物学效应的细胞因子，是炎症反应中引起局部组织损伤最重要的炎症介质，我们的结果表明，DC注射组小鼠血清IL-1的水平明显高于EAT组，DC注射组小鼠 TNF 的水平仅略高于EAT组，二者间无显著性差异。DC作为抗原递呈细胞将抗原信号递呈并活化TH细胞的过程中能促进IL-1的产生，正向调节免疫应答的发生，并且IL-1本身亦能显著增强DC的抗原递呈能力[7]。提示DC促进小鼠EAT的发生可能与IL-1的升高有较为密切的关系。
, 百拇医药
总之，本实验采用Tg预刺激的DC注射同源小鼠诱导EAT的发生，证实DC 在小鼠EAT的发生发展中具有一定的促进作用。关于小鼠EAT甲状腺局部组织炎症细胞浸润灶中DC的分布情况以及IFN-r、NO等炎症介导因子在EAT中的作用等尚待进一步研究。
①本课题受国家自然科学基金(39370364)和江苏省教委自然科学基金(JW970002)资助
②本院内分泌室
作者简介：王胜军，男，30岁，讲师；
刘恭植，教授，中国免疫学会名誉理事
4 参考文献
1 Utiger R D. The pathogensis of autoimmune thyroid disease. N Engl J Med,1991;325:278
, http://www.100md.com
2 许化溪，刘恭植.小鼠脾脏树突状细胞的分离与鉴定.上海免疫学杂志,1991;11(3):129
3 王胜军，许化溪，刘恭植 et al.小鼠实验性自身免疫性甲状腺炎的初步研究.镇江医学院学报，1997;7(1):7
4 章卫平，曹雪涛.WEHI164-C1细胞株检测TNF的MTS/PMS比色法的建立.免疫学杂志，1994;10(4):263
5 王胜军,许化溪，刘恭植.小鼠树突状细胞对不同抗原递呈作用的体外研究.中国实验临床免疫学杂志，1996;8(2):1
6 King P D,Katz D R.Mechanisms of dendritic cell function. Immunology Today,1990;11(6):206
7 Inaba K,Witmer-M D,Inaba M et al.The function of Ia+ dendritic cells and Ia- dendritic cells precursors in thymocyte mitogenesis to lectin and lectin plus interleukin 1. J Exp Med,1988;167(1):149
收稿1997-05-21 修回1998-11-11, http://www.100md.com
单位：王胜军 许化溪 刘恭植 柳龙图 镇江医学院免疫学研究室，镇江212001；江淑芳 南京81医院，南京210002
关键词：树突状细胞；自身免疫；甲状腺炎；小鼠
中国免疫学杂志990703 中国图书分类号 R392.12
摘 要 目的：研究树突状细胞(DC)对小鼠实验性自身免疫性甲状腺炎(EAT)的作用。方法：体外检测TgAb、Tg刺激的淋巴细胞增殖能力、IL-1、TNF水平， 并对甲状腺进行病理学检查。结果：DC注射组早期TgAb、Tg刺激的淋巴细胞增殖能力以及IL-1的水平均显著高于DC不注射组，但TNF水平在两者间无明显差异；经DC 单抗处理组的上述指标均低于DC注射组；病理学检查表明DC注射组甲状腺局部病变较其它各组严重。结论：DC对小鼠EAT具有明显促进作用。
, 百拇医药
The effects of dendritic cell in murine experimental autoimmune thyroiditis
WANG Sheng-Jun,XU Hua-Xi,LIU Gong-Zhi et al.
Department of Immunology,Zhenjiang Medical College, Zhenjiang 212001
Abstract Objective：To investigate the function of dendritic cell in murine experimental autoimmune thyroiditis.Methods:Levels of thyroglobulin antibody , interleukin-1 and tumor necrosis factor, proliferation of lymphocyte to thyroglobulin stimulation were detected in vitro. The histological pictures of thyroid were assessed.Results:The levels of TgAb ( early phase) and IL-1, proliferation of lymphocyte to thyroglobulin stimulation in the DC group were higher than that in the non-DC group(P<0.01),but the levels of TNF weren't significantly different between two groups(P>0.05).These data in monoclonal antibody(33D1) group were markedly decreased.In addition,the pathologic pictures showed that the damage of thyroid was heavy in DC group.Conclusion:These suggested that the DC could improve the progress of murine experimental autoimmune thyroiditis.
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Key words Dendritic cell Autoimmune Thyroiditis Mice
树突状细胞(Dendritic cell,DC)是一类重要的抗原递呈细胞， 其以抗原非内在化的方式递呈外来抗原或自身抗原而引发免疫应答，既可排除抗原异物，亦可导致自身免疫反应，使局部组织出现免疫病理损伤。小鼠EAT 是用来研究人类桥本氏甲状腺炎(HT)的动物模型，其甲状腺病理变化主要表现为淋巴细胞浸润为主的慢性炎症反应[1]。本文对DC在EAT中的作用进行了初步的研究，旨在进一步探讨DC与自身免疫性疾病的关系。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 小鼠甲状腺球蛋白(Tg，本室自制)，HRP-羊抗小鼠IgG(华美生物工程公司)，MTT(Fluka公司)，ConA( Sigma 公司)， 小鼠 DC 单克隆抗体 33D1 (美国Rockefeller大学Steinman教授惠赠)，其余均为国产分析纯试剂。
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1.2 动物与细胞株 CBA小鼠，雌性，8周龄，20 g左右；WEHI 164细胞株由北医大免疫学系提供。
1.3 小鼠模型建立及分组 DC分离和模型建立分别参照文献[2，3]。设置①EAT组；②DC注射组，采用新鲜分离的脾DC(1.0×106 ml-1)，加入Tg(100 μg/ml)，37℃、5%CO2孵育18 h，洗涤3次，作为Tg预刺激DC，在Tg+CFA注射后3 d，皮下注射Tg预刺激DC，每只0.5 ml(含5×105 DC)；③33D1注射组，注射DC同时，每只小鼠尾静脉注射33D1单抗；④正常对照组，未作任何处理。以上各组动物分别于免疫后第6周和第12周检测各项指标。
1.4 小鼠血清TgAb检测 采用常规间接ELISA法，结果以OD490表示。
1.5 体外Tg刺激的淋巴细胞增殖试验 分离小鼠脾脏单个核细胞，配制细胞浓度为1.0×107 ml-1，加入96 孔细胞培养板中，加入Tg(20 μg/ml)，37℃、5%CO2孵育72 h， 在终止培养前6 h ， 加入 MTT(5 μg/ml)，继续培养6 h，加入酸化异丙醇，振荡10 min，待完全溶解后检测OD570值。
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1.6 小鼠血清IL-1检测 采用C3H/HeJ小鼠胸腺细胞增殖试验，结果以OD570值表示。
1.7 TNF的诱生及检测 分离小鼠脾脏单个核细胞，配制细胞浓度为1.0×107 ml-1，加入ConA(5 μg/ml)，37℃、5%CO2孵育48 h，收集上清。TNF活性检测参见文献[4]，结果以细胞毒性(%)表示。
1.8 病理学检查 取小鼠甲状腺组织，作常规病理形态观察。
2 结果
2.1 小鼠血清TgAb水平 经Tg+CFA初次免疫后第6周，EAT组和DC组小鼠血清中TgAb均较正常对照组有明显升高，尤以DC组为著；至第12周，EAT组和DC组小鼠血清中TgAb 较正常对照组升高4倍以上，但EAT组和DC组之间无显著性差异，经33D1单克隆抗体处理组小鼠血清中TgAb水平较DC组有明显下降，结果见表1。
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表1 小鼠血清TgAb水平(n=5)
Tab.1 The level of thyroglobulin antibody (TgAb) in serum(n=5) Groups
6 weeks
12 weeks
Control
0.21±0.05
0.31±0.08
EAT
0.44±0.071)
1.36±0.121)
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DC
0.67±0.101)2)
1.47±0.181)
33D1
NT
0.68±0.063)
Note:1)compared with control:P<0.01;2)compared with EAT:P<0.01;3)compared with DC:P<0.01; 4)NT:not tested
2.2 体外Tg刺激的淋巴细胞增殖试验 无论在初次免疫后第6周还是第12周，EAT组和DC组经Tg刺激的淋巴细胞增殖能力均强于正常对照组,并且DC组的增殖能力亦均高于EAT组，经33D1单克隆抗体处理的增殖能力明显低于DC组，结果见表2。
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表2 不同组别小鼠体外Tg刺激的淋巴细胞增殖能力比较(n=5)
Tab.2 The comlparison of lymphocyte proliferation to Tg in different groups(n=5) Groups
6 weeks
12 weeks
Control
0.36±0.05
0.42±0.05
EAT
0.49±0.041)
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0.67±0.061)
DC
0.69±0.041)2)
1.79±0.021)3)
33D1
NT
0.57±0.084)
Note:1)compared with control:P<0.01; 2)compared with EAT:P<0.01;3)compared with EAT:P<0.05;4)compared with DC:P<0.01; 5)NT:not tested
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2.3 不同组别小鼠IL-1和TNF水平 各组小鼠经初次免疫后第12周时IL-1和TNF水平见表3，结果显示EAT组和DC 组IL-1水平均高于正常对照组，且DC组的IL-1水平高于EAT组，但经33D1 单克隆抗体处理组小鼠的IL-1水平明显低于DC组；EAT组和DC组小鼠TNF水平高于正常对照组，但DC组和EAT组之间无显著性差异，经33D1单克隆抗体处理组小鼠TNF水平明显低于DC组。
表3 不同组别小鼠IL-1和TNF水平(n=5)
Tab.3 The levels of IL-1 and TNF in different groups(n=5) Groups
IL-1(OD570)
TNF(%)
Control
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0.93±0.08
20.62±2.62
EAT
1.27±0.201)
39.13±8.264)
DC
1.53±0.091)2)
41.29±5.104)
33D1
1.07±0.143)
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Note:1)compared with control:P<0.01;2)compared with EAT:P<0.01;3)compared with DC:P<0.01;4)compared with control:P<0.05;5)compared with DC:P<0.05
2.4 病理学观察 EAT组和DC组小鼠甲状腺组织在光镜下可见有较多淋巴细胞浸润，部分甲状腺滤泡出现萎缩现象，尤以DC注射组表现最为明显，而正常对照组未见上述病变。
3 讨论
HT是一类针对自身抗原(如Tg、TPO)产生免疫应答导致甲状腺功能损害的自身免疫病。APC是启动和调节自身免疫应答过程中的一个重要因素，Mφ和DC是两类主要的抗原递呈细胞，但DC递呈可溶性抗原诱导免疫应答的能力强于Mφ[5]，因此针对Tg和TPO的自身免疫应答中DC可能起着极其重要的作用。
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在诱导小鼠EAT的同时，我们应用新鲜血分离的DC或DC单抗注射小鼠体内，同时以EAT组和正常小鼠作为对照，研究DC在小鼠EAT发生发展中的作用，结果显示：经DC注射的小鼠，早期(6 w)产生TgAb的能力显著增加，体外Tg 刺激的淋巴细胞增殖能力无论是在早期(6 w)还是晚期(12 w)，DC注射组的增殖能力均明显高于其它各组，而经DC单抗处理的小鼠的TgAb水平及体外Tg刺激的淋巴细胞增殖能力均较DC注射组有显著下降，由此看来，DC参与了EAT的启动和延续的整个过程，DC 通过其树突状表面以膜结合方式捕获自身抗原后[6]，可将其递呈给局部浸润淋巴细胞， 触发自身免疫反应的发生而导致局部组织功能受损，病理形态学检查也证实DC注射组小鼠甲状腺内淋巴细胞数目较多，形成淋巴细胞浸润灶，并且甲状腺滤泡萎缩现象严重。
细胞因子与自身免疫性疾病有着密切的关系，特别是IL-1和TNF是一对具有多种生物学效应的细胞因子，是炎症反应中引起局部组织损伤最重要的炎症介质，我们的结果表明，DC注射组小鼠血清IL-1的水平明显高于EAT组，DC注射组小鼠 TNF 的水平仅略高于EAT组，二者间无显著性差异。DC作为抗原递呈细胞将抗原信号递呈并活化TH细胞的过程中能促进IL-1的产生，正向调节免疫应答的发生，并且IL-1本身亦能显著增强DC的抗原递呈能力[7]。提示DC促进小鼠EAT的发生可能与IL-1的升高有较为密切的关系。
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总之，本实验采用Tg预刺激的DC注射同源小鼠诱导EAT的发生，证实DC 在小鼠EAT的发生发展中具有一定的促进作用。关于小鼠EAT甲状腺局部组织炎症细胞浸润灶中DC的分布情况以及IFN-r、NO等炎症介导因子在EAT中的作用等尚待进一步研究。
①本课题受国家自然科学基金(39370364)和江苏省教委自然科学基金(JW970002)资助
②本院内分泌室
作者简介：王胜军，男，30岁，讲师；
刘恭植，教授，中国免疫学会名誉理事
4 参考文献
1 Utiger R D. The pathogensis of autoimmune thyroid disease. N Engl J Med,1991;325:278
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2 许化溪，刘恭植.小鼠脾脏树突状细胞的分离与鉴定.上海免疫学杂志,1991;11(3):129
3 王胜军，许化溪，刘恭植 et al.小鼠实验性自身免疫性甲状腺炎的初步研究.镇江医学院学报，1997;7(1):7
4 章卫平，曹雪涛.WEHI164-C1细胞株检测TNF的MTS/PMS比色法的建立.免疫学杂志，1994;10(4):263
5 王胜军,许化溪，刘恭植.小鼠树突状细胞对不同抗原递呈作用的体外研究.中国实验临床免疫学杂志，1996;8(2):1
6 King P D,Katz D R.Mechanisms of dendritic cell function. Immunology Today,1990;11(6):206
7 Inaba K,Witmer-M D,Inaba M et al.The function of Ia+ dendritic cells and Ia- dendritic cells precursors in thymocyte mitogenesis to lectin and lectin plus interleukin 1. J Exp Med,1988;167(1):149
收稿1997-05-21 修回1998-11-11, http://www.100md.com