环磷酰胺诱发大鼠胸腺细胞凋亡的研究
作者：王冠军 李薇 蔡露
单位：白求恩医科大学血液病研究所，长春 130021
关键词：环磷酰胺；细胞凋亡；胸腺细胞
中国免疫学杂志990809 摘 要 目的：研究环磷酰胺的免疫抑制作用机制。方法：以大鼠胸腺为对象，采用细胞凋亡的原位特异性染色及DNA凝胶电泳的方法，观察不同剂量、不同时间环磷酰胺处理后胸腺细胞的凋亡现象。结果：剂量为20 和70 mg/kg 的环磷酰胺可引起广泛的胸腺细胞凋亡。该作用最早发生在环磷酰胺处理后的8 h，12～24 h最明显，48 h消失。结论：环磷酰胺的免疫抑制作用可能是通过诱导免疫细胞凋亡而产生的。
中国图书分类号 R392
Induction of apoptosis in rat thymus by cyclophosphamide
, 百拇医药
WANG Guan-Jun ,LI Wei，CAI Lu.Institute of Heamotological Disease，Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130021
Abstract Objective:To understand the mechanism of immunosuppression of cyclophosphamide. Methods: Investigate if cyclophosphamide produces the immunosuppression by the induction of apoptotic cell death in thymus .Results: 20 and 70 mg/kg cyclophosphamide could induce markedly apoptosis in rat thymus at 12 h after treatment ,the apoptotic cell death took place at 8～24 h and disappeared at 48 h after cyclophosphamide treatment. Conclusion： Cyclophosphamide may causes immunosuppression through the induction of apoposis of thymocyte.
, 百拇医药
Key words Cyclophosphamide Apoptosis Thymus
细胞凋亡(Apoptosis)是一种广泛存在于生物体系中又严格受基因程序调控的生理现象，近年来发现在免疫系统中也同样存在PCD，这种方式在胸腺未成熟T细胞的去除、T细胞克隆的无能化、自我耐受、免疫缺陷病毒感染后T细胞减少等生理、病理过程中都有重要作用[1]。本文所要探讨的是免疫治疗过程中的细胞凋亡。
1 材料与方法
1.1 实验分组及动物处理 雄性 sprague-Dawley大白鼠，体重375～400 g，分2组：第1组大鼠经灌胃食入70 mg/kg环磷酰胺后，不同时间(0、4、8、12、18、24及48 h)杀鼠取胸腺，称重后迅速将部分组织冻存于液氮中，其余组织于福尔马林中固定；另一组经0、2、7、20和70 mg/kg环磷酰胺处理12 h后杀鼠取胸腺，处理同上(每个剂量点和时间点用5只鼠)。
, http://www.100md.com
1.2 细胞凋亡特异性染色 胸腺经福尔马林固定，石蜡包埋，常规制片，酒精脱水。细胞凋亡特异性染色用美国oncor公司的Apop-Tag-Peroxidase 原位细胞凋亡检测试剂盒[2]。
1.3 DNA凝胶电泳分析 于液氧中保存的组织，经研磨器在预冷的条件下研碎，酚、氯仿法提取DNA，uv检测DNA含量，取10 μg DNA经琼脂糖凝胶电泳(1.8%琼脂糖、20 V电压、2～3 h)后，溴化乙啶染色，uv灯下照像。
2 结果
第1组大鼠经灌胃食入70 mg/kg环磷酰胺后，0 h 测胸腺重量为225±34 mg，自12 h 开始下降，48 h 下降至100±23 mg(图1A)，且有明显统计学意义(P<0.05)，第2组于环磷酰胺(0～70 mg/kg)处理12 h后未见明显胸腺重量下降(图1B)。
, 百拇医药
图1 环磷酰胺处理后对大鼠胸腺重量的影响
Fig.1 The influence after treatment of cyclophosphamide (CPA) on the weight of rat thymus
从各实验组提取的DNA凝胶电泳分析：70 mg/kg 环磷酰胺处理组8～24 h出现明显的梯型图像，48 h消失(图2A)。不同剂量组(0、2、7、20和70 mg/kg)处理后12 h只有20 和70 mg/kg剂量点表现出明显的梯形图像(图2B)。
细胞凋亡特异性染色：剂量为7、20和70 mg/kg时发现细胞凋亡特异性染色阳性结果(图3)，但以70 mg/kg时阳性面积最大，呈大边状(图3D)。
3 讨论
已有研究证明环磷酰胺可诱导整体条件下肿瘤细胞的凋亡，其发生高峰在8～18 h[3]。本文以同样剂量的环磷酰胺进行诱导胸腺细胞凋亡的研究，证明了该药的免疫抑制作用同样是通过诱导细胞凋亡而产生的，并且这一作用呈时间剂量依赖性。胸腺重量自12 h开始下降，至48 h更加明显，也证明由细胞死亡而导致器官重量下降。
, 百拇医药
DNA琼脂糖凝胶电泳方法未能证明2 和7 mg/kg剂量点有细胞凋亡现象(图2B)，但细胞凋亡特异性染色可见7 mg/kg环磷酰胺已诱导细胞凋亡的发生(图3B)。这一结果说明细胞凋亡特异性染色是较DNA琼脂糖凝胶电泳更敏感的检测方法。
图2 环磷酰胺诱导细胞凋亡的DNA凝胶电泳图像
Fig.2 Agarose gel electrophoresis of DNA from apoptosis cyclophosphamide-induced
, http://www.100md.com
图3 大鼠胸腺切片原位细胞凋亡特异性染色(400×)
Fig.3 TUNEL in situ staining for cell apoptosis on the section of rat thymus(400×)
Note:A.CPA-untreated;B.at 12 h after 7 mg/kg CPA treatment;C.at 12 h after 20 mg/kg CPA treatment；D.at 12 h after 70 mg/kg CPA treatment
由于环磷酰胺的双重药理作用，故以其作为化疗药物杀伤肿瘤细胞的同时又会引起免疫系统损伤，而影响治疗效果，为此有人成功地把促进细胞凋亡的基因Bax-x(s)转入动物体内，从而选择性地增强肿瘤细胞凋亡[4]，而不影响正常造血细胞凋亡，也有人探讨把自体骨髓干细胞转入Bcl-2抑制凋亡基因后再移植给供体[5]，以求在抗肿瘤放化疗时减少造血及免疫细胞凋亡，达到增强抗肿瘤疗效的目的。
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加拿大西安大略大学病理科
作者简介：王冠军，男，43岁，副教授，主要从事血液病临床及实验研究
4 参考文献
1 Raff M C.Social controls on cell survival and cell death.Nature，1992；365 (6368):397
2 韩 锐主编.抗癌药物研究与实验技术.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997：404
3 Meyn R E,Stephen L C,Hunter N R et al. Apoptosis in murine tumors treated with chemothrapy agents.Antr-Cancer Drugs ,1995;6:443
, http://www.100md.com
4 Clark M F,Apel I J,Benedict M A et al.A recombinant bcl-x(s) adenovirus selectively induces apoptiosis in cancer cells but not in normal bome marrow cell. Proc Natl Acad Sci USA， 1995;92:11024
5 Kondo S,Ying D,Morimura T et al.Transfection with a bcl-2 expression vector protects transplanted bone marrow from chemotherapy-induced myelosuppre-ssion.Cancer Res,1994;54(11):2928
〔收稿1998-05-06 修回1998-08-21〕, http://www.100md.com
单位：白求恩医科大学血液病研究所，长春 130021
关键词：环磷酰胺；细胞凋亡；胸腺细胞
中国免疫学杂志990809 摘 要 目的：研究环磷酰胺的免疫抑制作用机制。方法：以大鼠胸腺为对象，采用细胞凋亡的原位特异性染色及DNA凝胶电泳的方法，观察不同剂量、不同时间环磷酰胺处理后胸腺细胞的凋亡现象。结果：剂量为20 和70 mg/kg 的环磷酰胺可引起广泛的胸腺细胞凋亡。该作用最早发生在环磷酰胺处理后的8 h，12～24 h最明显，48 h消失。结论：环磷酰胺的免疫抑制作用可能是通过诱导免疫细胞凋亡而产生的。
中国图书分类号 R392
Induction of apoptosis in rat thymus by cyclophosphamide
, 百拇医药
WANG Guan-Jun ,LI Wei，CAI Lu.Institute of Heamotological Disease，Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130021
Abstract Objective:To understand the mechanism of immunosuppression of cyclophosphamide. Methods: Investigate if cyclophosphamide produces the immunosuppression by the induction of apoptotic cell death in thymus .Results: 20 and 70 mg/kg cyclophosphamide could induce markedly apoptosis in rat thymus at 12 h after treatment ,the apoptotic cell death took place at 8～24 h and disappeared at 48 h after cyclophosphamide treatment. Conclusion： Cyclophosphamide may causes immunosuppression through the induction of apoposis of thymocyte.
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Key words Cyclophosphamide Apoptosis Thymus
细胞凋亡(Apoptosis)是一种广泛存在于生物体系中又严格受基因程序调控的生理现象，近年来发现在免疫系统中也同样存在PCD，这种方式在胸腺未成熟T细胞的去除、T细胞克隆的无能化、自我耐受、免疫缺陷病毒感染后T细胞减少等生理、病理过程中都有重要作用[1]。本文所要探讨的是免疫治疗过程中的细胞凋亡。
1 材料与方法
1.1 实验分组及动物处理 雄性 sprague-Dawley大白鼠，体重375～400 g，分2组：第1组大鼠经灌胃食入70 mg/kg环磷酰胺后，不同时间(0、4、8、12、18、24及48 h)杀鼠取胸腺，称重后迅速将部分组织冻存于液氮中，其余组织于福尔马林中固定；另一组经0、2、7、20和70 mg/kg环磷酰胺处理12 h后杀鼠取胸腺，处理同上(每个剂量点和时间点用5只鼠)。
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1.2 细胞凋亡特异性染色 胸腺经福尔马林固定，石蜡包埋，常规制片，酒精脱水。细胞凋亡特异性染色用美国oncor公司的Apop-Tag-Peroxidase 原位细胞凋亡检测试剂盒[2]。
1.3 DNA凝胶电泳分析 于液氧中保存的组织，经研磨器在预冷的条件下研碎，酚、氯仿法提取DNA，uv检测DNA含量，取10 μg DNA经琼脂糖凝胶电泳(1.8%琼脂糖、20 V电压、2～3 h)后，溴化乙啶染色，uv灯下照像。
2 结果
第1组大鼠经灌胃食入70 mg/kg环磷酰胺后，0 h 测胸腺重量为225±34 mg，自12 h 开始下降，48 h 下降至100±23 mg(图1A)，且有明显统计学意义(P<0.05)，第2组于环磷酰胺(0～70 mg/kg)处理12 h后未见明显胸腺重量下降(图1B)。
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图1 环磷酰胺处理后对大鼠胸腺重量的影响
Fig.1 The influence after treatment of cyclophosphamide (CPA) on the weight of rat thymus
从各实验组提取的DNA凝胶电泳分析：70 mg/kg 环磷酰胺处理组8～24 h出现明显的梯型图像，48 h消失(图2A)。不同剂量组(0、2、7、20和70 mg/kg)处理后12 h只有20 和70 mg/kg剂量点表现出明显的梯形图像(图2B)。
细胞凋亡特异性染色：剂量为7、20和70 mg/kg时发现细胞凋亡特异性染色阳性结果(图3)，但以70 mg/kg时阳性面积最大，呈大边状(图3D)。
3 讨论
已有研究证明环磷酰胺可诱导整体条件下肿瘤细胞的凋亡，其发生高峰在8～18 h[3]。本文以同样剂量的环磷酰胺进行诱导胸腺细胞凋亡的研究，证明了该药的免疫抑制作用同样是通过诱导细胞凋亡而产生的，并且这一作用呈时间剂量依赖性。胸腺重量自12 h开始下降，至48 h更加明显，也证明由细胞死亡而导致器官重量下降。
, 百拇医药
DNA琼脂糖凝胶电泳方法未能证明2 和7 mg/kg剂量点有细胞凋亡现象(图2B)，但细胞凋亡特异性染色可见7 mg/kg环磷酰胺已诱导细胞凋亡的发生(图3B)。这一结果说明细胞凋亡特异性染色是较DNA琼脂糖凝胶电泳更敏感的检测方法。
图2 环磷酰胺诱导细胞凋亡的DNA凝胶电泳图像
Fig.2 Agarose gel electrophoresis of DNA from apoptosis cyclophosphamide-induced
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图3 大鼠胸腺切片原位细胞凋亡特异性染色(400×)
Fig.3 TUNEL in situ staining for cell apoptosis on the section of rat thymus(400×)
Note:A.CPA-untreated;B.at 12 h after 7 mg/kg CPA treatment;C.at 12 h after 20 mg/kg CPA treatment；D.at 12 h after 70 mg/kg CPA treatment
由于环磷酰胺的双重药理作用，故以其作为化疗药物杀伤肿瘤细胞的同时又会引起免疫系统损伤，而影响治疗效果，为此有人成功地把促进细胞凋亡的基因Bax-x(s)转入动物体内，从而选择性地增强肿瘤细胞凋亡[4]，而不影响正常造血细胞凋亡，也有人探讨把自体骨髓干细胞转入Bcl-2抑制凋亡基因后再移植给供体[5]，以求在抗肿瘤放化疗时减少造血及免疫细胞凋亡，达到增强抗肿瘤疗效的目的。
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加拿大西安大略大学病理科
作者简介：王冠军，男，43岁，副教授，主要从事血液病临床及实验研究
4 参考文献
1 Raff M C.Social controls on cell survival and cell death.Nature，1992；365 (6368):397
2 韩 锐主编.抗癌药物研究与实验技术.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997：404
3 Meyn R E,Stephen L C,Hunter N R et al. Apoptosis in murine tumors treated with chemothrapy agents.Antr-Cancer Drugs ,1995;6:443
, http://www.100md.com
4 Clark M F,Apel I J,Benedict M A et al.A recombinant bcl-x(s) adenovirus selectively induces apoptiosis in cancer cells but not in normal bome marrow cell. Proc Natl Acad Sci USA， 1995;92:11024
5 Kondo S,Ying D,Morimura T et al.Transfection with a bcl-2 expression vector protects transplanted bone marrow from chemotherapy-induced myelosuppre-ssion.Cancer Res,1994;54(11):2928
〔收稿1998-05-06 修回1998-08-21〕, http://www.100md.com