多因素所致温病湿热证模型大鼠红细胞免疫功能的变化
作者：佟丽 陈江华 吴仕九 杨运高 杨钦河 刘立
单位：第一军医大学中医系，广州510515
关键词：红细胞C3b受体 红细胞免疫粘附复合物 湿热证 动物模型
中国免疫学杂志990812 摘 要 目的：探讨高温、高湿环境，同时给予高脂、高糖饲料，并感染不同的病原微生物等因素对大鼠红细胞免疫功能 的影响。方法：采用红细胞酵母菌混合花环法测定大鼠红细胞C3b受体花环数(E-C3bRR)和红细胞免疫粘附物(E-ICR)花环数。结果：在多因素作用下，模型大鼠外周血中红细胞C3b受体花环数(E-C3bRR)显著降低，而红细胞免疫粘附物(E-ICR)升高。除去病原微生物作用，大鼠在高脂高糖、高温高湿环境，E-C3bRR显著降低和E-ICR水平均显著降低；将动物给予普通饲料，置于高温高湿环境，E-C3bRR显著降低，而E-ICR水平无显著变化。结论：多因素同时作用所致大鼠温病湿热证模型其红细胞免疫功能发生显著变化。
, 百拇医药
中国图书分类号 R229
The effect of multiple factors on erythrocytoimmunity function in dampness-heat model rats of epidemic febrile disease
TONG Li, CHEN Jiang-Hua, WU Shi-Jiu et al.Departtment of TCM, the First Military Medical University， Guangzhou 510515
Abstract Objective:To probe into effect several factors such as high temperature, high humidity, high sugar and high fat diet and infection of pathogenic microorganisms on erythrocytoimmunity function in rats model of dampness-heat. Methods:The number of blood erythrocyte C3b receptor rosettes and immune complex rosettes (E-ICR) in the rats model were tested by red cell and yeast mixture rose. Results:Blood erythrocyte C3b receptor rosette (E-C3bR) of rats decrased but erythrocyte immune complex rosette (E-ICR) increased significantly to induce by multiply factors. Both of E-C3bR and E-ICR were decreased significantly induced by high temperature, high humidity and high sugar and fat diet.Except the pathogenic microorganisms. In high temperature and humidity, E-C3bR of the experimental rat which fed by common diet decreased significantly but the level of E-ICR had not any change. Conclusion:Erythrocytoimmunity function of dampness-heat rats of epidemic febrile disease changed significantly when multiple factors affected it together.
, 百拇医药
Key words Erythrocytoimmunity Dampness-heat Syndrome Animal model
湿热证是热病中常见的病证，中医认为湿热病邪侵入人体，常以脾胃为中心，累及多脏，与气候、饮食及体质有关[1]。为了进一步揭示湿热证的本质，我们模拟湿热病发病原因，对大鼠施加饮食、环境、生物因子等多种因素，旨在建立符合中医证候特征的动物模型，本项研究探讨几种不同因素对大鼠红细胞免疫功能的影响。
1 材料与方法
1.1 动物 Wistar大鼠，雌雄兼用，体重180～220 g，清洁级，由华南实验动物中心提供。
1.2 试剂及菌种 致敏及未致敏冻干酵母菌制剂购自上海第二军医大学长海医院免疫室。大肠杆菌(E.coli. 44851)，中国生物制品检验所提供，应用浓度为107ml-1；鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella tyhimupium 460894),中国军事医学科学院提供，应用浓度为109 ml-1。
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1.3 造模箱 本课题组自行设计后，由第一军医大学医疗器械修配所制造，型号Z-1型，自动调温调湿。
1.4 实验分组 模型1组，(高脂高糖+造模箱+鼠伤寒沙门氏菌)大鼠饲以高糖高脂饲料，10 d后，放入造模箱(温度35℃、相对湿度95%，下同)，96 h后，灌胃给予鼠伤寒沙门氏菌2 ml/200 g体重。120 h后，再加强感染1次(1 ml/200 g体重)，然后将动物从造模箱移出，置自然环境；模型2组，(高脂高糖+造模箱+大肠杆菌)大鼠饲以高糖高脂饲料，10 d后，放入造模箱，72 h后，尾静脉注射大肠杆菌1 ml/200 g体重。3 d后，从造模箱移出；模型3组：(高脂高糖+造模箱)大鼠以高脂高糖饲料喂养10 d，然后放入造模箱中，3 d后从造模箱中移出；模型4组：(高脂高糖+人工气候室Artifical climate chamber， ACC)大鼠给以高脂高糖饲料喂养10 d，然后放入人工气候室(温度39℃逐渐升至42.5℃，相对温度70%)。4 h后，从人工气候室移出；模型对照1组：大鼠给以正常饲料10 d，然后放入人工气候室。4 h后，从人工气候室移出。以上各组动物均为从造模箱及人工气候室移出1 h内，采血进行检测。正常对照组：常规饮食及自然环境(温度22℃，相对湿度65%)。
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1.5 实验方法 大鼠按上述分组分别施加各种因素，实验结束后，尾静脉采血，按郭峰方法测定红细胞C3b受体(Erythrocyte C3b receptor rosette, E-C3bR)及红细胞粘附免疫复合物(erythrocyte immune complex receptor rosette, E-ICR)[2]。大鼠尾静脉血0.2 ml，用生理盐水洗涤两次，调整红细胞数为1.2×1011L-1。取两支试管，各加红细胞悬液0.075 ml，第1管加致敏酵母多糖0.075 ml，第2管加未致敏酵母多糖0.075 ml，37℃水浴30 min后，加0.25%戊二醛0.05 ml，涂片，瑞士染色，高倍镜下计数200个红细胞，以1个红细胞结合2个或2个以上酵母细胞为1个花环，计算花环形成百分率。
2 结果
2.1 不同生物因子对大鼠红细胞免疫功能的影响 大鼠给予高脂高糖饲料并置于造模箱中，模型1组灌胃鼠伤寒沙门氏菌，模型2组静注大肠杆菌。实验结束后，测大鼠红细胞免疫功能。结果见表1。结果可见，在外界环境相同条件下，生物因子的作用对大鼠红细胞免疫功能具有显著的影响。两组感染生物因子模型大鼠红细胞C3b受体数显著降低，而红细胞粘附免疫复合物显著增高。模型对照组与正常对照组比较大鼠红细胞C3b受体数显著降低。
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表1 不同的生物因子对大鼠红细胞免疫功能的影响(
±s，%)
Tab.1 Effect of different biological factors on erythrocytoimmunity in rats (±s，%)
Group
n
E-C3bR
E-ICR
Effect factor
, http://www.100md.com Normal control
10
21.37±6.52
17.75±6.26
Normal diet+natural enviroment
Model control 1
12
14.67±4.213)
15.5±10.64
Normal diet+model box
Model 1
, http://www.100md.com
10
10.3±7.741)
20.0±8.211)
Hing sugar and fat+ model box+Salmonella tyhimupium
Model 2
10
4.3±0.582)
21.0±5.631)
Hing sugar and fat+ model box+ E.coil
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Note:vs: model control 1 group, 1)P<0.01;2) P<0.001; Vs: normal control group, 3)P<0.05 2.2 饮食及环境因素对大鼠红细胞免疫功能的影响 改变饮食及环境条件，实验动物红细胞免疫功能是否发生改变?我们将大鼠分为5组，观察了在不同条件下，大鼠E-C3bR及E-ICR的变化。见表2。结果表明，饮食相同，改变温度时，模型对照1及2组与正常对照组比较红细胞C3b受体数显著低于正常对照组，并伴随红细胞免疫复合物花环数也降低。单纯改变饮食因素，在相同的温度及湿度影响下，模型3组大鼠与其模型对照1组比较红细胞C3b受体数及红细胞免疫复合物花环数显著降低，而模型4组与模型对照组2相比红细胞C3b受体数升高而红细胞免疫复合物花环数无显著变化。
3 讨论
临床上湿热病属于中医急性热病中的一类具有特殊性规律的疾病，与湿热的气候环境、病源微生物的侵入及人体易感性体质有关。我们以前的研究发现临床上湿热病人机体免疫功能发生了一定的变化[3]，血清中补体成分及免疫球蛋白含量显著升高，而T淋巴细胞亚群CD4/CD8比例降低，表明湿热证与免疫功能的改变具有一定的相关性。本项研究模拟湿热病发病条件，采用多因素施加方法，观察大鼠红细胞免疫功能的变化。实验结果表明，在高脂高糖、高温高湿环境以及病原微生物的感染下，大鼠红细胞免疫功能显著降低，表现为E-C3bR水平降低，而E-ICR显著升高。去除病原微生物的感染，改变温度及湿度，大鼠给予普通饲料，红细胞免疫的两项指标同时降低；而在同一温度环境中，大鼠给予高脂高糖，在造模箱环境下，E-C3bR和E-ICR降低；在人工气候室里，E-C3bR升高而E-ICR无显著变化。提示多因素的改变导致大鼠红细胞免疫功能显著降低，比较符合临床湿热病的特征。表2 饮食及环境因素对大鼠红细胞免疫功能的影响(±s，%)
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Tab.2 Effect of diet and environment condition on erythrocytoimmunity in rats (±s,%) Group
n
E-C3bR
E-ICR
Effect factor
Normal control
10
21.37±6.52
17.75±6.26
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Normal diet+natural enviroment
Model control 1
12
14.67±4.211)
15.50±10.64
Normal dite + model box
Model 3
9
9.43±2.513)
5.71±2.223)
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Hing sugar and fat diet+ model box
Model control 2
9
3.22±2.612)
8.50±6.352)
Nomal diet+Artifical climate chamber
Model 4
7
5.14±2.614)
6.14±3.18
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High sugar and fat+Artifical climate chamber
Note:Vs normal control group, 1)P<0.01; 2)P<0.001,vs model control 1 group, 3)P<0.001,vs model control 2 group, 4)P<0.05
红细胞免疫自80年代由美国学者Siegel提出以来，已逐渐引起人们的重视，研究发现红细胞具有识别、粘附、浓缩、杀伤抗原和清除循环中的免疫复合物(CIC)的能力，并参与机体免疫调控的完整的自我调控系统。红细胞上具有调控补体的膜蛋白，研究证明红细胞与免疫复合物(IC)的连接是通过红细胞表面的补体受体CR1、CR3和IC上相应的补体C3b、iC3b结合而介导的[4]。我们研制的温热模型大鼠E-C3bR水平降低，RBC-ICR显著升高。提示湿热证病人红细胞免疫功能异常与E-C3bR数目减少，IC不能及时清除有关。
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广东省科委自然科学基金资助项目(950567)
作者简介：佟 丽，女，42岁，副研究员，主要从事分子药理学及免疫药理学研究
4 参考文献
1 吴仕九.湿热证的研究方向及其探讨.中国中医急症，1994；3(2)：86
2 郭 峰，骆永珍主编.红细胞免疫学新探.南京：南京大学出版社，1993：93
3 陈江华，佟 丽，吴仕九.湿热证病人体液免疫状态观察.中国中医急症，1998；7(1)：6
4 郭 峰.红细胞调控免疫的事实与意义.上海免疫学杂志，1991；11(1)：49
〔收稿1998-09-06 修回1999-04-12〕, 百拇医药
单位：第一军医大学中医系，广州510515
关键词：红细胞C3b受体 红细胞免疫粘附复合物 湿热证 动物模型
中国免疫学杂志990812 摘 要 目的：探讨高温、高湿环境，同时给予高脂、高糖饲料，并感染不同的病原微生物等因素对大鼠红细胞免疫功能 的影响。方法：采用红细胞酵母菌混合花环法测定大鼠红细胞C3b受体花环数(E-C3bRR)和红细胞免疫粘附物(E-ICR)花环数。结果：在多因素作用下，模型大鼠外周血中红细胞C3b受体花环数(E-C3bRR)显著降低，而红细胞免疫粘附物(E-ICR)升高。除去病原微生物作用，大鼠在高脂高糖、高温高湿环境，E-C3bRR显著降低和E-ICR水平均显著降低；将动物给予普通饲料，置于高温高湿环境，E-C3bRR显著降低，而E-ICR水平无显著变化。结论：多因素同时作用所致大鼠温病湿热证模型其红细胞免疫功能发生显著变化。
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中国图书分类号 R229
The effect of multiple factors on erythrocytoimmunity function in dampness-heat model rats of epidemic febrile disease
TONG Li, CHEN Jiang-Hua, WU Shi-Jiu et al.Departtment of TCM, the First Military Medical University， Guangzhou 510515
Abstract Objective:To probe into effect several factors such as high temperature, high humidity, high sugar and high fat diet and infection of pathogenic microorganisms on erythrocytoimmunity function in rats model of dampness-heat. Methods:The number of blood erythrocyte C3b receptor rosettes and immune complex rosettes (E-ICR) in the rats model were tested by red cell and yeast mixture rose. Results:Blood erythrocyte C3b receptor rosette (E-C3bR) of rats decrased but erythrocyte immune complex rosette (E-ICR) increased significantly to induce by multiply factors. Both of E-C3bR and E-ICR were decreased significantly induced by high temperature, high humidity and high sugar and fat diet.Except the pathogenic microorganisms. In high temperature and humidity, E-C3bR of the experimental rat which fed by common diet decreased significantly but the level of E-ICR had not any change. Conclusion:Erythrocytoimmunity function of dampness-heat rats of epidemic febrile disease changed significantly when multiple factors affected it together.
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Key words Erythrocytoimmunity Dampness-heat Syndrome Animal model
湿热证是热病中常见的病证，中医认为湿热病邪侵入人体，常以脾胃为中心，累及多脏，与气候、饮食及体质有关[1]。为了进一步揭示湿热证的本质，我们模拟湿热病发病原因，对大鼠施加饮食、环境、生物因子等多种因素，旨在建立符合中医证候特征的动物模型，本项研究探讨几种不同因素对大鼠红细胞免疫功能的影响。
1 材料与方法
1.1 动物 Wistar大鼠，雌雄兼用，体重180～220 g，清洁级，由华南实验动物中心提供。
1.2 试剂及菌种 致敏及未致敏冻干酵母菌制剂购自上海第二军医大学长海医院免疫室。大肠杆菌(E.coli. 44851)，中国生物制品检验所提供，应用浓度为107ml-1；鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella tyhimupium 460894),中国军事医学科学院提供，应用浓度为109 ml-1。
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1.3 造模箱 本课题组自行设计后，由第一军医大学医疗器械修配所制造，型号Z-1型，自动调温调湿。
1.4 实验分组 模型1组，(高脂高糖+造模箱+鼠伤寒沙门氏菌)大鼠饲以高糖高脂饲料，10 d后，放入造模箱(温度35℃、相对湿度95%，下同)，96 h后，灌胃给予鼠伤寒沙门氏菌2 ml/200 g体重。120 h后，再加强感染1次(1 ml/200 g体重)，然后将动物从造模箱移出，置自然环境；模型2组，(高脂高糖+造模箱+大肠杆菌)大鼠饲以高糖高脂饲料，10 d后，放入造模箱，72 h后，尾静脉注射大肠杆菌1 ml/200 g体重。3 d后，从造模箱移出；模型3组：(高脂高糖+造模箱)大鼠以高脂高糖饲料喂养10 d，然后放入造模箱中，3 d后从造模箱中移出；模型4组：(高脂高糖+人工气候室Artifical climate chamber， ACC)大鼠给以高脂高糖饲料喂养10 d，然后放入人工气候室(温度39℃逐渐升至42.5℃，相对温度70%)。4 h后，从人工气候室移出；模型对照1组：大鼠给以正常饲料10 d，然后放入人工气候室。4 h后，从人工气候室移出。以上各组动物均为从造模箱及人工气候室移出1 h内，采血进行检测。正常对照组：常规饮食及自然环境(温度22℃，相对湿度65%)。
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1.5 实验方法 大鼠按上述分组分别施加各种因素，实验结束后，尾静脉采血，按郭峰方法测定红细胞C3b受体(Erythrocyte C3b receptor rosette, E-C3bR)及红细胞粘附免疫复合物(erythrocyte immune complex receptor rosette, E-ICR)[2]。大鼠尾静脉血0.2 ml，用生理盐水洗涤两次，调整红细胞数为1.2×1011L-1。取两支试管，各加红细胞悬液0.075 ml，第1管加致敏酵母多糖0.075 ml，第2管加未致敏酵母多糖0.075 ml，37℃水浴30 min后，加0.25%戊二醛0.05 ml，涂片，瑞士染色，高倍镜下计数200个红细胞，以1个红细胞结合2个或2个以上酵母细胞为1个花环，计算花环形成百分率。
2 结果
2.1 不同生物因子对大鼠红细胞免疫功能的影响 大鼠给予高脂高糖饲料并置于造模箱中，模型1组灌胃鼠伤寒沙门氏菌，模型2组静注大肠杆菌。实验结束后，测大鼠红细胞免疫功能。结果见表1。结果可见，在外界环境相同条件下，生物因子的作用对大鼠红细胞免疫功能具有显著的影响。两组感染生物因子模型大鼠红细胞C3b受体数显著降低，而红细胞粘附免疫复合物显著增高。模型对照组与正常对照组比较大鼠红细胞C3b受体数显著降低。
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表1 不同的生物因子对大鼠红细胞免疫功能的影响(
±s，%)Tab.1 Effect of different biological factors on erythrocytoimmunity in rats (
±s，%)Group
n
E-C3bR
E-ICR
Effect factor
, http://www.100md.com Normal control
10
21.37±6.52
17.75±6.26
Normal diet+natural enviroment
Model control 1
12
14.67±4.213)
15.5±10.64
Normal diet+model box
Model 1
, http://www.100md.com
10
10.3±7.741)
20.0±8.211)
Hing sugar and fat+ model box+Salmonella tyhimupium
Model 2
10
4.3±0.582)
21.0±5.631)
Hing sugar and fat+ model box+ E.coil
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Note:vs: model control 1 group, 1)P<0.01;2) P<0.001; Vs: normal control group, 3)P<0.05 2.2 饮食及环境因素对大鼠红细胞免疫功能的影响 改变饮食及环境条件，实验动物红细胞免疫功能是否发生改变?我们将大鼠分为5组，观察了在不同条件下，大鼠E-C3bR及E-ICR的变化。见表2。结果表明，饮食相同，改变温度时，模型对照1及2组与正常对照组比较红细胞C3b受体数显著低于正常对照组，并伴随红细胞免疫复合物花环数也降低。单纯改变饮食因素，在相同的温度及湿度影响下，模型3组大鼠与其模型对照1组比较红细胞C3b受体数及红细胞免疫复合物花环数显著降低，而模型4组与模型对照组2相比红细胞C3b受体数升高而红细胞免疫复合物花环数无显著变化。
3 讨论
临床上湿热病属于中医急性热病中的一类具有特殊性规律的疾病，与湿热的气候环境、病源微生物的侵入及人体易感性体质有关。我们以前的研究发现临床上湿热病人机体免疫功能发生了一定的变化[3]，血清中补体成分及免疫球蛋白含量显著升高，而T淋巴细胞亚群CD4/CD8比例降低，表明湿热证与免疫功能的改变具有一定的相关性。本项研究模拟湿热病发病条件，采用多因素施加方法，观察大鼠红细胞免疫功能的变化。实验结果表明，在高脂高糖、高温高湿环境以及病原微生物的感染下，大鼠红细胞免疫功能显著降低，表现为E-C3bR水平降低，而E-ICR显著升高。去除病原微生物的感染，改变温度及湿度，大鼠给予普通饲料，红细胞免疫的两项指标同时降低；而在同一温度环境中，大鼠给予高脂高糖，在造模箱环境下，E-C3bR和E-ICR降低；在人工气候室里，E-C3bR升高而E-ICR无显著变化。提示多因素的改变导致大鼠红细胞免疫功能显著降低，比较符合临床湿热病的特征。表2 饮食及环境因素对大鼠红细胞免疫功能的影响(
±s，%), http://www.100md.com
Tab.2 Effect of diet and environment condition on erythrocytoimmunity in rats (
±s,%) Groupn
E-C3bR
E-ICR
Effect factor
Normal control
10
21.37±6.52
17.75±6.26
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Normal diet+natural enviroment
Model control 1
12
14.67±4.211)
15.50±10.64
Normal dite + model box
Model 3
9
9.43±2.513)
5.71±2.223)
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Hing sugar and fat diet+ model box
Model control 2
9
3.22±2.612)
8.50±6.352)
Nomal diet+Artifical climate chamber
Model 4
7
5.14±2.614)
6.14±3.18
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High sugar and fat+Artifical climate chamber
Note:Vs normal control group, 1)P<0.01; 2)P<0.001,vs model control 1 group, 3)P<0.001,vs model control 2 group, 4)P<0.05
红细胞免疫自80年代由美国学者Siegel提出以来，已逐渐引起人们的重视，研究发现红细胞具有识别、粘附、浓缩、杀伤抗原和清除循环中的免疫复合物(CIC)的能力，并参与机体免疫调控的完整的自我调控系统。红细胞上具有调控补体的膜蛋白，研究证明红细胞与免疫复合物(IC)的连接是通过红细胞表面的补体受体CR1、CR3和IC上相应的补体C3b、iC3b结合而介导的[4]。我们研制的温热模型大鼠E-C3bR水平降低，RBC-ICR显著升高。提示湿热证病人红细胞免疫功能异常与E-C3bR数目减少，IC不能及时清除有关。
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广东省科委自然科学基金资助项目(950567)
作者简介：佟 丽，女，42岁，副研究员，主要从事分子药理学及免疫药理学研究
4 参考文献
1 吴仕九.湿热证的研究方向及其探讨.中国中医急症，1994；3(2)：86
2 郭 峰，骆永珍主编.红细胞免疫学新探.南京：南京大学出版社，1993：93
3 陈江华，佟 丽，吴仕九.湿热证病人体液免疫状态观察.中国中医急症，1998；7(1)：6
4 郭 峰.红细胞调控免疫的事实与意义.上海免疫学杂志，1991；11(1)：49
〔收稿1998-09-06 修回1999-04-12〕, 百拇医药