IL-6D24-Linker-PE40重组毒素的分子生物学特性预测
作者：郑黎燕 奚永志 孔繁华 陈兴国 金荔 屠敏 刘楠
单位：军事医学科学院附属医院免疫学研究室，北京100039
关键词：IL-6D24-Linker-PE40重组毒素；分子结构预测；计算机模拟
中国免疫学杂志990802 摘 要 目的：探讨重组毒素IL-6D24-Linker-PE40融合蛋白及其接头设计的合理性。方法：应用核酸和蛋白质序列分析软件系统-GOLDKEY软件，对IL-6D24-Linker-PE40重组毒素融合蛋白的柔性、抗原性、亲水性、表位等分子生物学特性进行计算机模拟预测，并做Western blot分析进行验证。结果：IL-6D24-Linker-PE40分别保留了IL-6D24和PE40的表位特征，没有新的抗原表位出现，而且柔性接头处具有极低的抗原性。Western blot分析结果表明融合蛋白能分别与IL-6和PEA的单克隆抗体发生特异结合，这说明融合蛋白保留了IL-6和PE40的空间结构特征。结论：预测结果有助于我们更好地从实验中认识蛋白质生物活性。
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中国图书分类号 R392.11
The prediction of the molecular biology characteristics of recombinant fusion toxin IL-6D24-Linker-PE40
ZHENG Li-Yan, XI Yong-Zhi, KONG Fan-Hua et al. Department of Immunology, North Tai Ping Road Hospital , Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100039
Abstract Objective：To discover the designing reasonability of recombinant fusion toxin IL-6D24-Linker-PE40. Methods：Using GlODKEY，the molecular biology characteristics of recombinant fusion toxin IL-6D24-Linker-PE40, such as flexibility, antigenicity, Hopp&Woods hydrophilicity and epitope, were predicted by computer analysis. The results were confirmed by Western blot. Results：It is indicated that the recombinant fusion toxin IL-6D24-Linker-PE40 which has correct domains of IL-6D24 and PE40 , can react with both MoAbs of IL-6 and MoAbs of PE40 simultaneously. The linker has low epitope, low antigenicity and high flexibility. Conclusion：The results will helps us to study the biological activity of the recombinant fusion toxin IL-6D24-Linker-PE40.
, 百拇医药
Key words Recombinant fusion toxin IL-6D24-Linker-PE40 Molecular constructure Computer analysis
利用细胞因子-受体来介导重组细胞因子-外毒素融合蛋白以达到选择性杀伤高表达相应细胞因子受体的白血病及其它肿瘤细胞，标志着肿瘤导向杀伤策略研究的最新进展之一[1，2]。鉴于白血病细胞异常高表达IL-6/IL-6R系统，而正常造血细胞几乎不表达或微量表达这一事实，我们在克隆了新型毒素蛋白绿脓杆菌外毒素(PE40)及人IL-6基因的基础上，新近采用基因融合新策略又构建成功了重组毒素IL-6D24-Linker-PE40并在大肠杆菌中高效表达,试图为白血病的导向治疗提供杀伤特异性更强、疗效更好、毒副作用更小的IL-6D24-Linker-PE40融合蛋白。由于重组毒素IL-6D24-Linker-PE40并非自然界所固有的天然蛋白, 而且国际上至今对如何能设计构建成功人们所期望的理想的重组细胞因子融合蛋白还缺乏具有指导性的理论[2]，本研究所构建的IL-6D24-Linker-PE40融合蛋白能否达到所预期的高度特异性和高杀伤性， 这是我们最为关注的首要问题。为此，我们利用计算机模拟了IL-6D24-Linker-PE40的某些分子生物学特性，诸如柔性、抗原性、亲水性、等电点及表位，以预测融合蛋白及其接头设计的合理性。
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1 材料与方法
1.1 融合蛋白分子生物学特性的计算机预测 采用军事医学科学院吴加金教授设计的GOLDKEY软件[3]。
1.2 Westem blot分析 采用BIORAD公司的 Western blot分析试剂盒。抗人IL-6单克隆抗体由军事医学科学院沈倍奋院士提供，抗PEA抗体购自Sigma公司。
2 结果
目前，从氨基酸序列预测蛋白质二级结构的方法将近20余种，主要为两大类，一是统计方法，主要考虑短程相互作用，基于已知晶体结构的蛋白质分子，统计出各残基、二肽或三肽片段在有序结构中出现的频率，以此预测肽段形成二级结构的可能；另一类方法是基于残基的物理化学性质，基于主体化学的考虑作出预测，基本上考虑了长程相互作用。我们应用完善的C-F法对IL-6D24-Linker-PE40的氨基酸序列进行了预测，它是统计分析了29个已知晶体结构的蛋白，得出各残基形成α螺旋、β结构和转折
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图1 IL-6D24-Linker-PE40柔性的计算机分析
Fig.1 Flexibility prediction of proteins IL-6D24-Linker-PE40 by computer
图2 IL-6D24-Linker-PE40抗原性的计算机分析
Fig.2 Antigenicity prediction of proteins IL-6D24-Linker-PE40 by computer
的构象参数以及α螺旋和β结构边缘出现的频率，将残基按形成还是破坏α或β结构的趋势分为6类，总结出形成有序二级结构的判定规则和条件，预测成功率为70%。
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2.1 柔性分析 从理论上讲，柔性区的存在有利于蛋白质两侧功能区的正确折叠，使接头两侧的多肽片断和氨基酸侧链能够自由运动，形成具有生物活性的空间结构。为了使IL-6D24和PE40融合后IL-6D24和PE40各自的空间结构不受影响，在二者之间加一个柔性的接头，构建了融合蛋白IL-6D24-Linker-PE40，这有利于IL-6D24与其受体的特异性结合，更好地起到导向的作用。IL-6D24-Linker-PE40柔性的计算机分析见图1。从图中可以看出，IL-6D24-Linker-PE40在第161～180氨基酸附近存在着高柔性区，
图3 IL-6D24-Linker-PE40亲水性的计算机分析
Fig.3 Hopp&Woods hydrophilicity prediction of proteins IL-6D24-Linker-PE40 by computer
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图4 IL-6D24-Linker-PE40表位的计算机分析
Fig.4 Epitope analysis of proteins IL-6D24-Linker-PE40 by computer
这说明IL-6D24和PE40由柔性肽连接，伸展性大，相互作用小，能自由运动，各自均可发挥原有的生物学效能。
2.2 抗原性分析 融合蛋白两分子间的接头区不应具有抗原性，接头序列的加入应使其两侧多肽原有的抗原性保持不变，不应产生新的抗原性，稳定的
抗原性在临床应用中有重要的意义，IL-6D24-Linker-PE40的抗原性计算机分析见图2。从图中可以看出，IL-6D24-Linker-PE40分别与IL-6D24和PE40相比，没有产生新的抗原性，IL-6D24-Linker-PE40在第161～180氨基酸的柔性接头处具有极低的抗原性，这为该融合蛋白的临床应用提供了一定的安全保证。
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2.3 亲水性分析 蛋白质分子表面带电的亲水性氨基酸富集的部位构成局部亲水性强的区域，成为蛋白质分子的一种表面特征。从图3中可以看出，IL-6D24-Linker-PE40与IL-6D24和PE40相比，分别保留了IL-6D24和PE40的亲水性区域，没有新的亲水表位产生，在IL-6D24-Linker-PE40的第161～180氨基酸的柔性接头处呈中性，从等电点的预测中也可以看出(图略)，柔性接头对等电点没有影响，IL-6D24-PE40和IL-6D24-Linker-PE40等电点均为5.15。
2.4 表位分析 表位是蛋白质分子的一种表面特征，位于那些充分暴露于溶剂或带电的亲水性氨基酸富集的部位，因此，对蛋白质的氨基酸序列中局部亲水性、序列中特定氨基酸的出现、主链的柔性等参数进行综合分析就可预测出序列局部亲水性强的区域，即表位区(图4)。从图中可以看出，IL-6D24-Linker-PE40分别保留了IL-6D24和PE40的表位特征，没有新的抗原表位出现。在第161～180氨基酸的柔性接头处表位量化指数低，表位特征差，说明IL-6D24和PE40相互影响少，融合蛋白没有增加新的表位区。
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2.5 Western blot分析 为了验证IL-6D24-Linker-PE40是否分别具有IL-6D24和PE40的抗原结构特征，对其进行了Western blot分析，结果表明，IL-6D24-Linker-PE40能分别与IL-6和PEA的单克隆抗体发生特异结合(图略)，融合蛋白保留了IL-6和PE40的空间结构特征，IL-6D24和PE40两个结构间有一定的空间距离，融合蛋白分别具有IL-6和PE40的免疫学活性。
3 讨论
借助计算机预测分析蛋白质的结构，有助于我们更好地认识蛋白质生物功能的作用机制。虽然现在人们对细胞内外蛋白质怎样折叠成其特定的空间结构并不十分清楚，但随着基因工程技术的运用，使得按人们的意愿创造自然界不存在的蛋白质或改善现有蛋白质的特性和生物功能成为可能。本研究首次通过计算机模拟预测了IL-6D24-Linker-PE40融合蛋白的柔性、抗原性、亲水性、等电点及表位等生物学特性，帮助我们更好地从实验中研究其生物活性，从而设计出更合理的受体导向药物。随着对蛋白质一、二、三级结构特定结构域及生物信号相关性研究的不断深入，加之基因工程技术的巧妙运用，按人的意志去改造现有药用蛋白质的特性及生物功能或去创造自然界中不存在的药用蛋白质已成可能。利用细胞因子-受体系统介导重组细胞因子-外毒素融合蛋白靶向杀伤肿瘤细胞这一思路确具有其新颖性、科学性和实践的可行性，值得我们去揭示。
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致谢：李伍举助理研究员及吴加金教授在计算机模拟预测中给予热情帮助。
国家自然科学基金资助项目(批准号:39500062和39870875)
作者简介：郑黎燕，女，30岁，免疫学博士研究生；指导老师，孔繁华，62岁，主任医师，博士生导师，主要从事免疫遗传学研究；奚永志，38岁，研究员，硕士生导师，主要从事造血调控研究
4 参考文献
1 Pasten I. Targeted therapy of cancer with recombinant immunotoxins. Biochim Biophys Acta， 1997；1333:C1
2 Pai L H，Pastan I. Clinical trials with pseudomanas exotoxin immunotoxins. Curr Top Microbiol Immunol，1998；234:83
3 吴加金，李伍举，雷红星 et al. 核酸和蛋白质序列分析的软件系统—GOLDKEY.生物技术通讯，1994；5(4)：189
〔收稿1998-11-24 修回1999-01-29〕, 百拇医药
单位：军事医学科学院附属医院免疫学研究室，北京100039
关键词：IL-6D24-Linker-PE40重组毒素；分子结构预测；计算机模拟
中国免疫学杂志990802 摘 要 目的：探讨重组毒素IL-6D24-Linker-PE40融合蛋白及其接头设计的合理性。方法：应用核酸和蛋白质序列分析软件系统-GOLDKEY软件，对IL-6D24-Linker-PE40重组毒素融合蛋白的柔性、抗原性、亲水性、表位等分子生物学特性进行计算机模拟预测，并做Western blot分析进行验证。结果：IL-6D24-Linker-PE40分别保留了IL-6D24和PE40的表位特征，没有新的抗原表位出现，而且柔性接头处具有极低的抗原性。Western blot分析结果表明融合蛋白能分别与IL-6和PEA的单克隆抗体发生特异结合，这说明融合蛋白保留了IL-6和PE40的空间结构特征。结论：预测结果有助于我们更好地从实验中认识蛋白质生物活性。
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The prediction of the molecular biology characteristics of recombinant fusion toxin IL-6D24-Linker-PE40
ZHENG Li-Yan, XI Yong-Zhi, KONG Fan-Hua et al. Department of Immunology, North Tai Ping Road Hospital , Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100039
Abstract Objective：To discover the designing reasonability of recombinant fusion toxin IL-6D24-Linker-PE40. Methods：Using GlODKEY，the molecular biology characteristics of recombinant fusion toxin IL-6D24-Linker-PE40, such as flexibility, antigenicity, Hopp&Woods hydrophilicity and epitope, were predicted by computer analysis. The results were confirmed by Western blot. Results：It is indicated that the recombinant fusion toxin IL-6D24-Linker-PE40 which has correct domains of IL-6D24 and PE40 , can react with both MoAbs of IL-6 and MoAbs of PE40 simultaneously. The linker has low epitope, low antigenicity and high flexibility. Conclusion：The results will helps us to study the biological activity of the recombinant fusion toxin IL-6D24-Linker-PE40.
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Key words Recombinant fusion toxin IL-6D24-Linker-PE40 Molecular constructure Computer analysis
利用细胞因子-受体来介导重组细胞因子-外毒素融合蛋白以达到选择性杀伤高表达相应细胞因子受体的白血病及其它肿瘤细胞，标志着肿瘤导向杀伤策略研究的最新进展之一[1，2]。鉴于白血病细胞异常高表达IL-6/IL-6R系统，而正常造血细胞几乎不表达或微量表达这一事实，我们在克隆了新型毒素蛋白绿脓杆菌外毒素(PE40)及人IL-6基因的基础上，新近采用基因融合新策略又构建成功了重组毒素IL-6D24-Linker-PE40并在大肠杆菌中高效表达,试图为白血病的导向治疗提供杀伤特异性更强、疗效更好、毒副作用更小的IL-6D24-Linker-PE40融合蛋白。由于重组毒素IL-6D24-Linker-PE40并非自然界所固有的天然蛋白, 而且国际上至今对如何能设计构建成功人们所期望的理想的重组细胞因子融合蛋白还缺乏具有指导性的理论[2]，本研究所构建的IL-6D24-Linker-PE40融合蛋白能否达到所预期的高度特异性和高杀伤性， 这是我们最为关注的首要问题。为此，我们利用计算机模拟了IL-6D24-Linker-PE40的某些分子生物学特性，诸如柔性、抗原性、亲水性、等电点及表位，以预测融合蛋白及其接头设计的合理性。
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1 材料与方法
1.1 融合蛋白分子生物学特性的计算机预测 采用军事医学科学院吴加金教授设计的GOLDKEY软件[3]。
1.2 Westem blot分析 采用BIORAD公司的 Western blot分析试剂盒。抗人IL-6单克隆抗体由军事医学科学院沈倍奋院士提供，抗PEA抗体购自Sigma公司。
2 结果
目前，从氨基酸序列预测蛋白质二级结构的方法将近20余种，主要为两大类，一是统计方法，主要考虑短程相互作用，基于已知晶体结构的蛋白质分子，统计出各残基、二肽或三肽片段在有序结构中出现的频率，以此预测肽段形成二级结构的可能；另一类方法是基于残基的物理化学性质，基于主体化学的考虑作出预测，基本上考虑了长程相互作用。我们应用完善的C-F法对IL-6D24-Linker-PE40的氨基酸序列进行了预测，它是统计分析了29个已知晶体结构的蛋白，得出各残基形成α螺旋、β结构和转折
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图1 IL-6D24-Linker-PE40柔性的计算机分析
Fig.1 Flexibility prediction of proteins IL-6D24-Linker-PE40 by computer
图2 IL-6D24-Linker-PE40抗原性的计算机分析
Fig.2 Antigenicity prediction of proteins IL-6D24-Linker-PE40 by computer
的构象参数以及α螺旋和β结构边缘出现的频率，将残基按形成还是破坏α或β结构的趋势分为6类，总结出形成有序二级结构的判定规则和条件，预测成功率为70%。
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2.1 柔性分析 从理论上讲，柔性区的存在有利于蛋白质两侧功能区的正确折叠，使接头两侧的多肽片断和氨基酸侧链能够自由运动，形成具有生物活性的空间结构。为了使IL-6D24和PE40融合后IL-6D24和PE40各自的空间结构不受影响，在二者之间加一个柔性的接头，构建了融合蛋白IL-6D24-Linker-PE40，这有利于IL-6D24与其受体的特异性结合，更好地起到导向的作用。IL-6D24-Linker-PE40柔性的计算机分析见图1。从图中可以看出，IL-6D24-Linker-PE40在第161～180氨基酸附近存在着高柔性区，
图3 IL-6D24-Linker-PE40亲水性的计算机分析
Fig.3 Hopp&Woods hydrophilicity prediction of proteins IL-6D24-Linker-PE40 by computer
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图4 IL-6D24-Linker-PE40表位的计算机分析
Fig.4 Epitope analysis of proteins IL-6D24-Linker-PE40 by computer
这说明IL-6D24和PE40由柔性肽连接，伸展性大，相互作用小，能自由运动，各自均可发挥原有的生物学效能。
2.2 抗原性分析 融合蛋白两分子间的接头区不应具有抗原性，接头序列的加入应使其两侧多肽原有的抗原性保持不变，不应产生新的抗原性，稳定的
抗原性在临床应用中有重要的意义，IL-6D24-Linker-PE40的抗原性计算机分析见图2。从图中可以看出，IL-6D24-Linker-PE40分别与IL-6D24和PE40相比，没有产生新的抗原性，IL-6D24-Linker-PE40在第161～180氨基酸的柔性接头处具有极低的抗原性，这为该融合蛋白的临床应用提供了一定的安全保证。
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2.3 亲水性分析 蛋白质分子表面带电的亲水性氨基酸富集的部位构成局部亲水性强的区域，成为蛋白质分子的一种表面特征。从图3中可以看出，IL-6D24-Linker-PE40与IL-6D24和PE40相比，分别保留了IL-6D24和PE40的亲水性区域，没有新的亲水表位产生，在IL-6D24-Linker-PE40的第161～180氨基酸的柔性接头处呈中性，从等电点的预测中也可以看出(图略)，柔性接头对等电点没有影响，IL-6D24-PE40和IL-6D24-Linker-PE40等电点均为5.15。
2.4 表位分析 表位是蛋白质分子的一种表面特征，位于那些充分暴露于溶剂或带电的亲水性氨基酸富集的部位，因此，对蛋白质的氨基酸序列中局部亲水性、序列中特定氨基酸的出现、主链的柔性等参数进行综合分析就可预测出序列局部亲水性强的区域，即表位区(图4)。从图中可以看出，IL-6D24-Linker-PE40分别保留了IL-6D24和PE40的表位特征，没有新的抗原表位出现。在第161～180氨基酸的柔性接头处表位量化指数低，表位特征差，说明IL-6D24和PE40相互影响少，融合蛋白没有增加新的表位区。
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2.5 Western blot分析 为了验证IL-6D24-Linker-PE40是否分别具有IL-6D24和PE40的抗原结构特征，对其进行了Western blot分析，结果表明，IL-6D24-Linker-PE40能分别与IL-6和PEA的单克隆抗体发生特异结合(图略)，融合蛋白保留了IL-6和PE40的空间结构特征，IL-6D24和PE40两个结构间有一定的空间距离，融合蛋白分别具有IL-6和PE40的免疫学活性。
3 讨论
借助计算机预测分析蛋白质的结构，有助于我们更好地认识蛋白质生物功能的作用机制。虽然现在人们对细胞内外蛋白质怎样折叠成其特定的空间结构并不十分清楚，但随着基因工程技术的运用，使得按人们的意愿创造自然界不存在的蛋白质或改善现有蛋白质的特性和生物功能成为可能。本研究首次通过计算机模拟预测了IL-6D24-Linker-PE40融合蛋白的柔性、抗原性、亲水性、等电点及表位等生物学特性，帮助我们更好地从实验中研究其生物活性，从而设计出更合理的受体导向药物。随着对蛋白质一、二、三级结构特定结构域及生物信号相关性研究的不断深入，加之基因工程技术的巧妙运用，按人的意志去改造现有药用蛋白质的特性及生物功能或去创造自然界中不存在的药用蛋白质已成可能。利用细胞因子-受体系统介导重组细胞因子-外毒素融合蛋白靶向杀伤肿瘤细胞这一思路确具有其新颖性、科学性和实践的可行性，值得我们去揭示。
, http://www.100md.com
致谢：李伍举助理研究员及吴加金教授在计算机模拟预测中给予热情帮助。
国家自然科学基金资助项目(批准号:39500062和39870875)
作者简介：郑黎燕，女，30岁，免疫学博士研究生；指导老师，孔繁华，62岁，主任医师，博士生导师，主要从事免疫遗传学研究；奚永志，38岁，研究员，硕士生导师，主要从事造血调控研究
4 参考文献
1 Pasten I. Targeted therapy of cancer with recombinant immunotoxins. Biochim Biophys Acta， 1997；1333:C1
2 Pai L H，Pastan I. Clinical trials with pseudomanas exotoxin immunotoxins. Curr Top Microbiol Immunol，1998；234:83
3 吴加金，李伍举，雷红星 et al. 核酸和蛋白质序列分析的软件系统—GOLDKEY.生物技术通讯，1994；5(4)：189
〔收稿1998-11-24 修回1999-01-29〕, 百拇医药