枸杞多糖体外对正常及衰老小鼠免疫细胞功能的作用及作用机理的初步研究①
作者：齐春会 张永祥 陈保文 顾国明
单位：军事医学科学院毒物药物研究所，北京100850
关键词：枸杞多糖；淋巴细胞增殖反应；抗体形成细胞；游离Ca2+；Fura-2/AM
中国免疫学杂志990915 摘 要 目的：探讨枸杞多糖(LBP)对免疫细胞功能的直接作用及其机理。方法：应用淋巴细胞增殖、溶血空斑和Fura-2/AM双波长荧光测定等方法。结果：LBP体外应用对正常小鼠及快速老化模型SAMP8和抗快速老化模型SAMR1脾细胞增殖反应具有直接促增殖作用，明显增加正常小鼠脾抗体形成细胞(PFC)数目，迅速诱导脾细胞和腹腔巨噬细胞内[Ca2+]i的增加，并有一定剂量依赖性关系。结论：枸杞多糖对免疫活性细胞的功能有直接促进作用，这可能与其增加细胞[Ca2+]i有关。
, http://www.100md.com
中国图书分类号 R967
Effects of lycium barbarum polysaccharides on the splenocyte immune function of normal and aged model mouse and it's possible mechanism in vitro
QI Chun-Hui, ZHANG Yong-Xiang, CHEN Bao-Wen et al.
Institute of Pharmacology and Toxicology, Academy of Military Medical Science, Beijing 100850
Abstract Objective：To explore the action of immuno-modulation of lycium barbarum polysaccharides(LBP) on mouse splenocyte and it's possible mechanism in vitro.Methods：3H-TdR incorporation plaque-forming cell(PFC) assays and Fura-2/AM fluorescence double-wave measurement.Results: LBP not only enhanced splenocyte proliferation of LACA,senescence-accelerated mouse(SAMP8)and antisenescence-accelerated mouse(SAMR1)directly,but also increased the number of PFC of LACA mouse splenocytes.Furthermore,the concentration of free Ca2+ in splenocytes and macrophages was increased rapidly with dose-depend manner induced by LBP.Conclusion :LPB possesses direct immunopromoting effect on immune cell function and this effect maybe related with increasing concentration of free Ca2+ in cytoplasm,[Ca2+]i.
, 百拇医药
Key words Lycium barbarum polysaccharides(LBP) Antibody production response(PFC) Splenocyte proliferation response Concentration of free Ca2+
枸杞是传统的名贵补益中药，已有几千年的药用历史，具有“滋阴补血、益精明目”之功效。近年来，我室与植化室密切合作从中分离获得了枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides,LBP,编号901119)。免疫药理学研究表明，枸杞多糖体内应用不仅增强正常小鼠机体的免疫功能，而且对去胸腺、D-半乳糖衰老模型小鼠及自然衰老小鼠的免疫功能低下具有明显的改善作用[1-3]，但对其作用的分子机理研究较少。本文研究发现，LBP在体外直接促进正常小鼠和衰老模型小鼠脾细胞增殖反应，具有原丝分裂原样作用。随后从细胞信号传导途径开始研
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1 材料与方法
1.1 实验动物 LACA小鼠， 雌性， 6～8 w， 本院实验动物中心供应。 快速老化模型小鼠(Senescence-accelerated mouse,SAM)，雌性，系日本京都大学竹田教授赠送，在本所动物实验室饲养繁殖。SAMP8和SAMR1分别为快速老化亚系和抗快速老化亚系。
1.2 药物与试剂 枸杞多糖系本所植化室从宁夏枸杞中提取的一种水溶性多糖。已明确该多糖系蛋白多糖，分子量为22～25 kD，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖6种单糖成分组成，详细的结构分析尚在进行之中。RPMI 1640培养液，GIBCO产品，配制时加入青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml、Hepes 10 mmol/L和谷氨酰胺2 mmol/L，使用时根据需要加入10 %～15 %的小牛血清； 环磷酰胺(Cyclophos-phamide, Cy)，上海华联制药厂；ConA为Sigma产品；3H-TdR:中科院北京原子能所，比活性20 Ci/mmol；Fura-2/AM为Sigma产品，用DMSO溶解成1 mmol/L贮备液，分装后置-20℃避光保存。
, 百拇医药
1.3 实验方法 无菌取脾制成单个细胞悬液，无菌双蒸水破坏红细胞，用RPMI 1640液洗2次，调整至需要的细胞浓度。台盼蓝染色证明细胞存活率>90%。腹腔巨噬细胞的制备按文献[4]进行。
淋巴细胞增殖反应：3H-TdR掺入法[5]，实验孔分别加入不同浓度的LBP或(和)Con A，对照孔以培养液代替，于96孔培养板，37℃ 5% CO2饱和湿度条件下培养72 h，培养结束前10～16 h每孔加入0.5 μ Ci 3H-TdR，结果以每样本3复孔平均cpm值表示。
抗体生成细胞(PFC)检测法(溶血空斑实验)：参照文献[6]进行，略加修改。于实验前4天以10%的绵羊红细胞(SRBC)腹腔注射免疫小鼠，实验时断头处死小鼠，取脾脏制备脾细胞悬液，按常规方法测定PFC数目。或者取未经任何处理小鼠的脾脏制备脾细胞悬液(1×107/ml)，然后取脾细胞悬液1 ml，1% SRBC 60 μl和RPMI 1640液配制的不同浓度的LBP，加入24孔培养板中，总培养体积2 ml，在上述相同培养条件下培养4 d，于第5天测定PFC数目。
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细胞内游离 Ca2+ 浓度[Ca2+]i测定：Fura-2/AM双波长荧光法，参考文献[4,7]进行。药物与脾细胞或腹腔巨噬细胞作用2～3 min时测定[Ca2+]i。
2 结 果
2.1 LBP体内给药对Cy处理小鼠脾抗体生成反应的影响 LBP剂量为5 mg/kg，连续给予7 d(sc.)，做PFC实验，实验前5 d 1次给予Cy(sc. 50 mg/kg)。实验结果表明，LBP(5 mg/kg)对Cy所诱发的抗体生成反应低下具有明显的改善作用，见表1。
表1 LBP对Cy处理小鼠脾抗体生成反应的影响
Tab.1 The effect of LBP on splenocyte antibody production response in Cy-treated mice Group
, http://www.100md.com
Doses(mg/kg)
PFC/106 cell(
±s)
N.S-CON
/
1 038±91
Cy-CON
/
535±961)
Cy-LBP
5
937±302)
, http://www.100md.com
Note：1)P<0.01 vs N.S-CON；2)P<0.01 vs Cy-CON,t test, n=3
2.2 LBP体外对LACA小鼠脾细胞增殖反应的影响 由表2可以看出，在加ConA和不加ConA两种条件下，在50～100 μg/ml剂量范围内，LBP均使3H-TdR掺入明显增加，说明LBP在体外不仅可以促进Con A诱导的脾细胞增殖反应，而且可以直接刺激脾细胞增殖，具有直接激活小鼠脾细胞增殖的作用。
表2 枸杞多糖(LBP)对LACA小鼠脾细胞增殖反应的影响
Tab.2 The effect of LBP on splenocyte proliferation response of LACA mouse Doses
(μg/ml)
, 百拇医药
3H-TdR
cpm(±s)
Con A(-)
Con A(+)(2.5 μg/ml)
0
10
50
100
500
1 000
6 632±483
, http://www.100md.com
11 997±2591)
20 306±1 0701)
18 962±2 7311)
6 547±1 799
2 973±1 0242)
61 529±2 867
59 272±4 303
74 205±4021)
76 999±1 1151)
, 百拇医药 66 494±3 117
55 383±7 229
Note：1)P<0.01,2)P<0.001,vs 0(Control), t test, n=3
2.3 LBP体外对不同月龄SAMP8和SAMR1小鼠脾细胞增殖反应的影响 选择LBP最佳有效剂量50 μg/ml，观察LBP对4、9、14月龄SAMP8和SAMR1小鼠脾细胞增殖反应的影响(表3)。SAMP8小鼠脾细胞增殖反应较SAMR1明显低下，且随着月龄变化，SAMP8变化明显，14月龄时，近乎于不增殖状态，而SAMR1变化则不明显。不加ConA，LBP使各月龄SAMP8和SAMR1小鼠脾细胞增殖反应明显增强；与ConA合用时，LBP对SAMP8与对LACA小鼠作用相似，而对SAMR1则没有协同作用。
表3 LBP体外对不同月龄SAMP8和SAMR1小鼠脾细胞增殖反应的影响
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Tab.3 The effect of LBP on splenocyte proliferation of different-month SAMP8 and SAMR1 mouse in vitro Animal
Month
cpm(
±s)
Con A(-)
Con A(+) (2.5 μg/ml)
Control
LBP(50 μg/ml)
Control
, http://www.100md.com
LBP(50 μg/ml)
SAMR1
4
9
14
3 820±724
3 954±864
4 616±1 757
7 887±1 3102)
7 580±1 0322)
6 969±1 0081)
, 百拇医药
75 480±4 102
60 016±4 945
51 573±6 442
81 043±7 559
64 044±5 700
49 430±5 095
SAMP8
4
9
14
853±153
1 216±192
, 百拇医药
261±71
1 462±1982)
2 164±2582)
353±631)
62 991±2 143
59 560±7 598
2 106±260
71 197±6 0311)
69 548±7 5051)
2 942±3322)
, 百拇医药
Note：1)P<0.05，2)P<0.01, vs 0 (Control), t test,n=6表4 LBP对小鼠脾抗体形成细胞(PFC)的影响
Tab.4 The effect of LBP on splenocyte antibody forming cell (PFC) of LACAmouse in vitro Doses(μg/ml)
PFC/106 cell(±s)
0
645±40
10
1 602±512)
, 百拇医药
50
1 130±1302)
100
1 000±532)
500
830±701)
1 000
512±19
Note: 1)P<0.05，2)P<0.01, vs 0 (Control), t test, n=3
2.4 LBP体外对脾抗体生成反应的影响 LBP在10～100 μg/ml剂量范围内，明显增加脾细胞PFC的
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数目，是对照组的2倍左右(表4)，说明LBP可增强免疫细胞对胸腺依赖抗原SRBC的抗体反应能力。表5 LBP对脾细胞和腹腔巨噬细胞内[Ca2+]i的影响(n=3)
Tab.5 The effect of LBP on [Ca2+]i in splenocyte and macrophage(n=3) Group
Doses
(μg/ml)
[Ca2+]i(nmol/L)(±s)
Elevated rate (%)
, 百拇医药
Splenocyte
MΦ
Splenocyte
MΦ
Control
0
105.1±7.3
95.3±6.6
/
/
ConA
5
161.0±4.81)
, 百拇医药
125.8±7.91)
53.2
32.0
LBP
10
162.1±1.71)
118.0±0.41)
54.2
23.8
25
178.7±0.91)
, http://www.100md.com
143.4±9.11)
70.0
50.5
50
211.1±9.71)
191.7±7.01)
100.9
101.2
100
245.7±16.31)
/
, 百拇医药
133.8
/
Note：1)P<0.01 vs 0 (Control), t test, n=3
3 讨 论
本研究体内给药7 d发现LBP对Cy处理小鼠脾抗体生成反应有明显的增强作用，这与以往研究结果一致[1]。进一步观察LBP体外对LACA小鼠脾细胞增殖反应和抗体形成细胞数目的影响，发现LBP不仅明显增强ConA诱导的脾细胞增殖反应，而且单独使用时对脾细胞有直接促增殖作用；另外可增加脾抗体形成细胞(PFC)的数目，增强脾细胞对抗原SRBC的抗体反应能力。上述结果表明LBP体外实验与体内研究的结果是一致的。提示直接作用于免疫活性细胞是LBP调节免疫功能的途径之一。
Yuko等[8]报道了快速老化模型小鼠(SAM)的特征是自出生后3～4个月开始出现全身多功能系统的快速老化，免疫功能低下是其特点之一。快速老化亚系SAMP8的免疫功能较同龄抗快速老化亚系SAMR1更为低下，这与本实验所观察到的结果相一致。单用LBP对来自不同月龄SAMP8的脾细胞增殖反应既有明显促进作用，与ConA合用具有协同作用，提示LBP对功能衰退的淋巴细胞亦有直接促进作用。单用LBP对SAMR1的作用与SAMP8相同，但与ConA合用时则无协同作用，其机制尚不清楚，有待进一步研究，可能与脾细胞对ConA的应答能力有关。
, 百拇医药
淋巴细胞受抗原、有丝分裂原等刺激，活化细胞膜表面的受体，主要通过两条信息传导途径即Ca2+和腺苷酸环化酶(AC)/cAMP途径，最终导致增殖、分化和功能改变[9]。本研究发现LBP在10～100 μg/ml剂量范围内，剂量依赖性增加脾细胞和腹腔巨噬细胞内[Ca2+]i ，提示LBP对免疫活性细胞功能的促进作用可能与其诱导[Ca2+]i增加有关。张新等报道枸杞多糖可升高小鼠脾淋巴细胞内cAMP和cGMP的水平[10]。由此可以推测，枸杞多糖可能通过Ca2+、 cAMP、cGMP等多种细胞内信息传递机制而发挥对免疫活性细胞功能的调节作用。
致谢：本文得到邢善田教授的指导，在此表示衷心的感谢。
①国家自然科学基金青年基金和重点项目资助课题，NO.39600188和39730480
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作者简介：齐春会，女，30岁，助理研究员，主要从事中药免疫药理学研究；
张永祥，男，40岁，研究员，主要研究方向为中药药理学究其作用的分子机理。
4 参考文献
1 邢善田. 枸杞多糖的免疫药理作用与延缓衰老研究. 见：周金黄主编.中药免疫药理学. 北京：人民军医出版社，1994: 232-243
2 耿长山. 枸杞子多糖对老年小鼠免疫功能低下的调节作用. 中华老年医学杂志，1989;8(4):236
3 王柏昆. 枸杞多糖对小鼠T、杀伤T和NK细胞的免疫药理作用及对抗环磷酰胺的免疫抑制作用. 中国药理学与毒理学杂志，1990; 4(1):39
4 张均田.用Fura-2/AM测定细胞内游离钙浓度的方法. 中国药学杂志，1991; 26(11):655
, 百拇医药
5 丁 雁，邢善田，周金黄. 淫羊藿多糖促进小鼠T和B细胞[3H]TdR掺入和诱生干扰素作用的研究. 中国免疫学杂志，1985; 1(6):342
6 马大龙. 一种敏感的改良空斑形成细胞测定法. 北京医学院学报，1983; 15(3):222
7 Malgaroli A, Milani D, Meldolesi J et al. Fura-2 measurement of cytosolic free Ca2+ in monolayers and suspensions of various types of animal cells. J Cell Biology, 1987；105: 2145
8 Yuko A, Manami Y, Yoshio K et al. Defects of immune cells in the senescence-accelerated mouse: a model for learning and memory deficits in the aged. Cellular Immunology, 1994; 157: 59
9 夏海滨. 淋巴细胞活化过程中信号转导的分子基础. 见：金伯泉主编. 细胞和分子免疫学. 西安：世界图书出版社，1995：287～298
10 张 新，项树林，崔晓燕 et al. 枸杞多糖对小鼠淋巴细胞信号系统的效应. 中国免疫学杂志，1997; 13(5): 289
〔收稿日期：1998-04-27 修稿日期：1999-06-09〕, 百拇医药
单位：军事医学科学院毒物药物研究所，北京100850
关键词：枸杞多糖；淋巴细胞增殖反应；抗体形成细胞；游离Ca2+；Fura-2/AM
中国免疫学杂志990915 摘 要 目的：探讨枸杞多糖(LBP)对免疫细胞功能的直接作用及其机理。方法：应用淋巴细胞增殖、溶血空斑和Fura-2/AM双波长荧光测定等方法。结果：LBP体外应用对正常小鼠及快速老化模型SAMP8和抗快速老化模型SAMR1脾细胞增殖反应具有直接促增殖作用，明显增加正常小鼠脾抗体形成细胞(PFC)数目，迅速诱导脾细胞和腹腔巨噬细胞内[Ca2+]i的增加，并有一定剂量依赖性关系。结论：枸杞多糖对免疫活性细胞的功能有直接促进作用，这可能与其增加细胞[Ca2+]i有关。
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中国图书分类号 R967
Effects of lycium barbarum polysaccharides on the splenocyte immune function of normal and aged model mouse and it's possible mechanism in vitro
QI Chun-Hui, ZHANG Yong-Xiang, CHEN Bao-Wen et al.
Institute of Pharmacology and Toxicology, Academy of Military Medical Science, Beijing 100850
Abstract Objective：To explore the action of immuno-modulation of lycium barbarum polysaccharides(LBP) on mouse splenocyte and it's possible mechanism in vitro.Methods：3H-TdR incorporation plaque-forming cell(PFC) assays and Fura-2/AM fluorescence double-wave measurement.Results: LBP not only enhanced splenocyte proliferation of LACA,senescence-accelerated mouse(SAMP8)and antisenescence-accelerated mouse(SAMR1)directly,but also increased the number of PFC of LACA mouse splenocytes.Furthermore,the concentration of free Ca2+ in splenocytes and macrophages was increased rapidly with dose-depend manner induced by LBP.Conclusion :LPB possesses direct immunopromoting effect on immune cell function and this effect maybe related with increasing concentration of free Ca2+ in cytoplasm,[Ca2+]i.
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Key words Lycium barbarum polysaccharides(LBP) Antibody production response(PFC) Splenocyte proliferation response Concentration of free Ca2+
枸杞是传统的名贵补益中药，已有几千年的药用历史，具有“滋阴补血、益精明目”之功效。近年来，我室与植化室密切合作从中分离获得了枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides,LBP,编号901119)。免疫药理学研究表明，枸杞多糖体内应用不仅增强正常小鼠机体的免疫功能，而且对去胸腺、D-半乳糖衰老模型小鼠及自然衰老小鼠的免疫功能低下具有明显的改善作用[1-3]，但对其作用的分子机理研究较少。本文研究发现，LBP在体外直接促进正常小鼠和衰老模型小鼠脾细胞增殖反应，具有原丝分裂原样作用。随后从细胞信号传导途径开始研
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1 材料与方法
1.1 实验动物 LACA小鼠， 雌性， 6～8 w， 本院实验动物中心供应。 快速老化模型小鼠(Senescence-accelerated mouse,SAM)，雌性，系日本京都大学竹田教授赠送，在本所动物实验室饲养繁殖。SAMP8和SAMR1分别为快速老化亚系和抗快速老化亚系。
1.2 药物与试剂 枸杞多糖系本所植化室从宁夏枸杞中提取的一种水溶性多糖。已明确该多糖系蛋白多糖，分子量为22～25 kD，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖6种单糖成分组成，详细的结构分析尚在进行之中。RPMI 1640培养液，GIBCO产品，配制时加入青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml、Hepes 10 mmol/L和谷氨酰胺2 mmol/L，使用时根据需要加入10 %～15 %的小牛血清； 环磷酰胺(Cyclophos-phamide, Cy)，上海华联制药厂；ConA为Sigma产品；3H-TdR:中科院北京原子能所，比活性20 Ci/mmol；Fura-2/AM为Sigma产品，用DMSO溶解成1 mmol/L贮备液，分装后置-20℃避光保存。
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1.3 实验方法 无菌取脾制成单个细胞悬液，无菌双蒸水破坏红细胞，用RPMI 1640液洗2次，调整至需要的细胞浓度。台盼蓝染色证明细胞存活率>90%。腹腔巨噬细胞的制备按文献[4]进行。
淋巴细胞增殖反应：3H-TdR掺入法[5]，实验孔分别加入不同浓度的LBP或(和)Con A，对照孔以培养液代替，于96孔培养板，37℃ 5% CO2饱和湿度条件下培养72 h，培养结束前10～16 h每孔加入0.5 μ Ci 3H-TdR，结果以每样本3复孔平均cpm值表示。
抗体生成细胞(PFC)检测法(溶血空斑实验)：参照文献[6]进行，略加修改。于实验前4天以10%的绵羊红细胞(SRBC)腹腔注射免疫小鼠，实验时断头处死小鼠，取脾脏制备脾细胞悬液，按常规方法测定PFC数目。或者取未经任何处理小鼠的脾脏制备脾细胞悬液(1×107/ml)，然后取脾细胞悬液1 ml，1% SRBC 60 μl和RPMI 1640液配制的不同浓度的LBP，加入24孔培养板中，总培养体积2 ml，在上述相同培养条件下培养4 d，于第5天测定PFC数目。
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细胞内游离 Ca2+ 浓度[Ca2+]i测定：Fura-2/AM双波长荧光法，参考文献[4,7]进行。药物与脾细胞或腹腔巨噬细胞作用2～3 min时测定[Ca2+]i。
2 结 果
2.1 LBP体内给药对Cy处理小鼠脾抗体生成反应的影响 LBP剂量为5 mg/kg，连续给予7 d(sc.)，做PFC实验，实验前5 d 1次给予Cy(sc. 50 mg/kg)。实验结果表明，LBP(5 mg/kg)对Cy所诱发的抗体生成反应低下具有明显的改善作用，见表1。
表1 LBP对Cy处理小鼠脾抗体生成反应的影响
Tab.1 The effect of LBP on splenocyte antibody production response in Cy-treated mice Group
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Doses(mg/kg)
PFC/106 cell(
±s)N.S-CON
/
1 038±91
Cy-CON
/
535±961)
Cy-LBP
5
937±302)
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Note：1)P<0.01 vs N.S-CON；2)P<0.01 vs Cy-CON,t test, n=3
2.2 LBP体外对LACA小鼠脾细胞增殖反应的影响 由表2可以看出，在加ConA和不加ConA两种条件下，在50～100 μg/ml剂量范围内，LBP均使3H-TdR掺入明显增加，说明LBP在体外不仅可以促进Con A诱导的脾细胞增殖反应，而且可以直接刺激脾细胞增殖，具有直接激活小鼠脾细胞增殖的作用。
表2 枸杞多糖(LBP)对LACA小鼠脾细胞增殖反应的影响
Tab.2 The effect of LBP on splenocyte proliferation response of LACA mouse Doses
(μg/ml)
, 百拇医药
3H-TdR
cpm(
±s)Con A(-)
Con A(+)(2.5 μg/ml)
0
10
50
100
500
1 000
6 632±483
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11 997±2591)
20 306±1 0701)
18 962±2 7311)
6 547±1 799
2 973±1 0242)
61 529±2 867
59 272±4 303
74 205±4021)
76 999±1 1151)
, 百拇医药 66 494±3 117
55 383±7 229
Note：1)P<0.01,2)P<0.001,vs 0(Control), t test, n=3
2.3 LBP体外对不同月龄SAMP8和SAMR1小鼠脾细胞增殖反应的影响 选择LBP最佳有效剂量50 μg/ml，观察LBP对4、9、14月龄SAMP8和SAMR1小鼠脾细胞增殖反应的影响(表3)。SAMP8小鼠脾细胞增殖反应较SAMR1明显低下，且随着月龄变化，SAMP8变化明显，14月龄时，近乎于不增殖状态，而SAMR1变化则不明显。不加ConA，LBP使各月龄SAMP8和SAMR1小鼠脾细胞增殖反应明显增强；与ConA合用时，LBP对SAMP8与对LACA小鼠作用相似，而对SAMR1则没有协同作用。
表3 LBP体外对不同月龄SAMP8和SAMR1小鼠脾细胞增殖反应的影响
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Tab.3 The effect of LBP on splenocyte proliferation of different-month SAMP8 and SAMR1 mouse in vitro Animal
Month
cpm(
±s)Con A(-)
Con A(+) (2.5 μg/ml)
Control
LBP(50 μg/ml)
Control
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LBP(50 μg/ml)
SAMR1
4
9
14
3 820±724
3 954±864
4 616±1 757
7 887±1 3102)
7 580±1 0322)
6 969±1 0081)
, 百拇医药
75 480±4 102
60 016±4 945
51 573±6 442
81 043±7 559
64 044±5 700
49 430±5 095
SAMP8
4
9
14
853±153
1 216±192
, 百拇医药
261±71
1 462±1982)
2 164±2582)
353±631)
62 991±2 143
59 560±7 598
2 106±260
71 197±6 0311)
69 548±7 5051)
2 942±3322)
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Note：1)P<0.05，2)P<0.01, vs 0 (Control), t test,n=6表4 LBP对小鼠脾抗体形成细胞(PFC)的影响
Tab.4 The effect of LBP on splenocyte antibody forming cell (PFC) of LACAmouse in vitro Doses(μg/ml)
PFC/106 cell(
±s)0
645±40
10
1 602±512)
, 百拇医药
50
1 130±1302)
100
1 000±532)
500
830±701)
1 000
512±19
Note: 1)P<0.05，2)P<0.01, vs 0 (Control), t test, n=3
2.4 LBP体外对脾抗体生成反应的影响 LBP在10～100 μg/ml剂量范围内，明显增加脾细胞PFC的
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数目，是对照组的2倍左右(表4)，说明LBP可增强免疫细胞对胸腺依赖抗原SRBC的抗体反应能力。表5 LBP对脾细胞和腹腔巨噬细胞内[Ca2+]i的影响(n=3)
Tab.5 The effect of LBP on [Ca2+]i in splenocyte and macrophage(n=3) Group
Doses
(μg/ml)
[Ca2+]i(nmol/L)(
±s)Elevated rate (%)
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Splenocyte
MΦ
Splenocyte
MΦ
Control
0
105.1±7.3
95.3±6.6
/
/
ConA
5
161.0±4.81)
, 百拇医药
125.8±7.91)
53.2
32.0
LBP
10
162.1±1.71)
118.0±0.41)
54.2
23.8
25
178.7±0.91)
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143.4±9.11)
70.0
50.5
50
211.1±9.71)
191.7±7.01)
100.9
101.2
100
245.7±16.31)
/
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133.8
/
Note：1)P<0.01 vs 0 (Control), t test, n=3
3 讨 论
本研究体内给药7 d发现LBP对Cy处理小鼠脾抗体生成反应有明显的增强作用，这与以往研究结果一致[1]。进一步观察LBP体外对LACA小鼠脾细胞增殖反应和抗体形成细胞数目的影响，发现LBP不仅明显增强ConA诱导的脾细胞增殖反应，而且单独使用时对脾细胞有直接促增殖作用；另外可增加脾抗体形成细胞(PFC)的数目，增强脾细胞对抗原SRBC的抗体反应能力。上述结果表明LBP体外实验与体内研究的结果是一致的。提示直接作用于免疫活性细胞是LBP调节免疫功能的途径之一。
Yuko等[8]报道了快速老化模型小鼠(SAM)的特征是自出生后3～4个月开始出现全身多功能系统的快速老化，免疫功能低下是其特点之一。快速老化亚系SAMP8的免疫功能较同龄抗快速老化亚系SAMR1更为低下，这与本实验所观察到的结果相一致。单用LBP对来自不同月龄SAMP8的脾细胞增殖反应既有明显促进作用，与ConA合用具有协同作用，提示LBP对功能衰退的淋巴细胞亦有直接促进作用。单用LBP对SAMR1的作用与SAMP8相同，但与ConA合用时则无协同作用，其机制尚不清楚，有待进一步研究，可能与脾细胞对ConA的应答能力有关。
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淋巴细胞受抗原、有丝分裂原等刺激，活化细胞膜表面的受体，主要通过两条信息传导途径即Ca2+和腺苷酸环化酶(AC)/cAMP途径，最终导致增殖、分化和功能改变[9]。本研究发现LBP在10～100 μg/ml剂量范围内，剂量依赖性增加脾细胞和腹腔巨噬细胞内[Ca2+]i ，提示LBP对免疫活性细胞功能的促进作用可能与其诱导[Ca2+]i增加有关。张新等报道枸杞多糖可升高小鼠脾淋巴细胞内cAMP和cGMP的水平[10]。由此可以推测，枸杞多糖可能通过Ca2+、 cAMP、cGMP等多种细胞内信息传递机制而发挥对免疫活性细胞功能的调节作用。
致谢：本文得到邢善田教授的指导，在此表示衷心的感谢。
①国家自然科学基金青年基金和重点项目资助课题，NO.39600188和39730480
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作者简介：齐春会，女，30岁，助理研究员，主要从事中药免疫药理学研究；
张永祥，男，40岁，研究员，主要研究方向为中药药理学究其作用的分子机理。
4 参考文献
1 邢善田. 枸杞多糖的免疫药理作用与延缓衰老研究. 见：周金黄主编.中药免疫药理学. 北京：人民军医出版社，1994: 232-243
2 耿长山. 枸杞子多糖对老年小鼠免疫功能低下的调节作用. 中华老年医学杂志，1989;8(4):236
3 王柏昆. 枸杞多糖对小鼠T、杀伤T和NK细胞的免疫药理作用及对抗环磷酰胺的免疫抑制作用. 中国药理学与毒理学杂志，1990; 4(1):39
4 张均田.用Fura-2/AM测定细胞内游离钙浓度的方法. 中国药学杂志，1991; 26(11):655
, 百拇医药
5 丁 雁，邢善田，周金黄. 淫羊藿多糖促进小鼠T和B细胞[3H]TdR掺入和诱生干扰素作用的研究. 中国免疫学杂志，1985; 1(6):342
6 马大龙. 一种敏感的改良空斑形成细胞测定法. 北京医学院学报，1983; 15(3):222
7 Malgaroli A, Milani D, Meldolesi J et al. Fura-2 measurement of cytosolic free Ca2+ in monolayers and suspensions of various types of animal cells. J Cell Biology, 1987；105: 2145
8 Yuko A, Manami Y, Yoshio K et al. Defects of immune cells in the senescence-accelerated mouse: a model for learning and memory deficits in the aged. Cellular Immunology, 1994; 157: 59
9 夏海滨. 淋巴细胞活化过程中信号转导的分子基础. 见：金伯泉主编. 细胞和分子免疫学. 西安：世界图书出版社，1995：287～298
10 张 新，项树林，崔晓燕 et al. 枸杞多糖对小鼠淋巴细胞信号系统的效应. 中国免疫学杂志，1997; 13(5): 289
〔收稿日期：1998-04-27 修稿日期：1999-06-09〕, 百拇医药