HLA-B27基因检定技术
作者：兰炯采 陈 强 郑世荣 石 宁 张祖文
单位：陈 强 郑世荣 石 宁 (中国医学科学院中国协和医科大学输血研究所，成都 610081)；兰炯采 现工作单位为第一军医大学南方医院输血科，广州 510515；张祖文 原南京血液中心，现在瑞士Kantonsspital医院
关键词：HLA-B27；聚合酶链反应；基因检定
中国免疫学杂志990910 摘 要 目的：用聚合酶链反应(PCR)和血清学方法检测HLA-B27，并进行比较。方法：采用PCR技术检测78例可疑为强直性脊椎炎患者样本的HLA-B27基因，并与血清学结果比较。结果：36例具有B27基因者中24例同时作血清学试验，5例血清学难以判定结果，并与PCR结果不一致。42例无B27基因者中21例同时作血清学试验，3例血清学结果为可疑。结论：B27基因检定技术与血清学方法比较，有快速、简便、准确性高等优点。
, 百拇医药
中国图书分类号 R392.4
Method of HLA-B27 genotyping
LAN Jiong-Cai,CHEN Qiang,ZHENG Shi-Rong et al.
Institute of Blood Transfusion,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College,Chengdu 610081
Abstract Objective:A comparison study of polymerase chain reaction (PCR) and serological typing method was used to detect HLA-B27.Methods:78 samples from patients suspected with ankylosing spondylitis (AS) were genotyped by PCR and some of them were assayed by serological typing.Results:24/36 samples with HLA-B27 gene were compared with serological typing ,the results of 5 samples serological typing were dubious or contradictory with PCR genotyping.21/42 samples without HLA-B27 gene were compared with serological typing,the results of 3 samples serological typing were dubious.Conclusion:The method of B27 genotyping by PCR is more rapid,inexpensive and exact than phenotyping by serology.
, 百拇医药
Key words HLA-B27 PCR Genotyping
HLA-B27与强直性脊椎炎(Ankylosing spondylitis,AS)及结膜—尿道—滑膜综合征(Reiter综合征)等疾病相关，前者相对危险率(RR)为87.4，后者为37.0[1]，具有临床辅助诊断价值。既往采用血清学技术检测HLA-B27表型，本文中我们采用PCR技术进行了HLA-B27基因检定研究。
1 材料与方法
1.1 样本 成都及南京地区有腰椎运动受限、腰背疼痛、胸廓扩张受限、虹膜炎病史等症状之一即怀疑为AS者78例，采血做HLA-B27基因检定及表型检测。
1.2 HLA-B27表型检测 采患者静脉血2 ml，肝素抗凝，以标准微量淋巴细胞毒试验检测HLA-B27表型。检定血清板含阳性对照、阴性对照及4孔不同批号的B27抗血清(相关系数r分别为0.84,0.86,0.90,0.90；强度SI%分别为75，77，88，91)。
, 百拇医药
1.3 HLA-B27基因检定
1.3.1 DNA模板提取 采患者静脉血0.3 ml，EDTA抗凝，快速盐析法提取DNA[2]。
1.3.2 PCR引物设计 根据已公布的HLA-B27 DNA序列[3]，参考Olerup方案设计B27序列特异性引物[4]；内对照引物5′-CAG、TCT、GTG、CCT、TGG、CGT、TGC，5′-GGC、TAC、GTG、GAC、GAC、ACG、CT，扩增产物为144 bp，可以检出WHO正式命名的8个B27等位基因，包括中国人常见的B27*04，B27*05和B27*06。以上类生长激素(HGH)基因特异性引物为内对照：5′-GCC、TTC、CCA、ACC、ATT、CCC、TTA，5′-TCA、CGG、ATT、TCT、GTT、GTG、TTT，扩增产物为429 bp。以上引物由美国G&T公司合成、纯化及鉴定。
, 百拇医药
1.3.3 PCR 将B27引物、内对照引物、MgCl2、Tris、明胶、KCl、dNTP及溴酚蓝等按一定比例(配方将另文报道)配制为PCR反应混合物(B27 Mix)，取B27 Mix 8 μl、被检DNA 100 ng、Taq DNA聚合酶0.5单位混合放入PCR机扩增，循环参数为95℃ 5 min预变性，然后95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 90 s，共30个循环。
1.3.4 PCR产物检测 以1.5%琼脂糖凝胶(含0.5 μg/ml溴乙锭)，0.5×TBE缓冲液，5 V/cm电压电泳30 min，100 bp ladder为参照物，302 nm波长紫外透射仪下分析结果。
2 结 果
2.1 具有HLA-B27基因的样本经PCR扩增出现144 bp特异性区带及429 bp内对照带，无B27基因者只出现429 bp内对照带。如果Taq DNA聚合酶质量欠佳，则有时出现一条大于429 bp的额外区带，并不影响B27基因的判定。上述结果经G&T公司提供的3份具有B27基因DNA及4份无B27基因DNA重复验证，如图1所示。
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图1 HLA-B27基因检定
Fig.1 HLA-B27 genotyping
Note:M.100 bp ladder;lane 1,2,3.without B27 gene;lane 4,5,6.with B27 gene;lane 6,7 as a same sample;lane 7 used low quality Taq DNA polymerase
2.2 本组78例可疑AS者中，具有B27基因者36例，其中34例符合AS诊断标准(X线片证实骶髂关节炎，并附加下列临床表现中1条或2条：腰椎运动受限；腰背疼痛及僵硬感；胸廓扩张受限)，2例X线片无异常不能诊断为AS。无B27基因者42例，其中2例符合AS诊断标准。
2.3 HLA-B27基因与表型检查结果比较
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2.3.1 36例具有B27基因者中，24例同时作血清学试验检查B27表型，其中1例血清学结果为阴性，4例血清学结果可疑(2例1孔血清阳性，积分6；2例(2孔血清阳性，积分4～8)，其余样本4孔血清均阳性。结果均重复验证。
2.3.2 42例无B27基因者中，21例同时作血清学试验，3例血清学结果可疑(1～3孔阳性，积分4)，其余样本4孔血清均阴性。结果均重复验证。
3 讨 论
既住采用微量淋巴细胞毒试验检查B27表型有如下缺点：要求新鲜血至少2 ml，分离的淋巴细胞要有足够数量及活力才能供试验，特殊情况下取材困难；标本难以长期保存供复核或送其他实验室验证；难以获得相关系数r为1.00或强度SI%为100的B27单价抗血清，单份血清有可能漏检或出现假阳性额外反应，如果同时用几份不同批号的血清试验，结果不一致时很难下结论；不同厂家、不同批号的血清定型板的质量难以统一化、标准化，造成不同实验室的结果不易相互比较。本组样本中血清学试验时仅部分血清阳性和/或积分低而难以判定结果，占16.3%(7/43)，此时常要凭“经验”或对血清质量分析来判定结果，常含主观人为因素，很难避免误定B27表型。本组还发现血清学漏检者1例。
, 百拇医药
HLA-B27基因的DNA序列已经清楚，WHO认定有8个等位基因。我们采用PCR技术，可以扩增B27全部等位基因[4]，含内对照引物确保结果可靠。本方法的优点是：仅需少量血样，提取的DNA可保存数年以供复核或送其他实验室验证；快速，采用快速法30 min提取DNA，PCR约2 h，电泳30 min，半天之内可出结果，适于临床常规；准确，分析结果客观，根据内对照带及有无特异性区带判定结果一目了然；试剂系合成品，易于统一化和标准化，有利于各实验室互相比较结果。
作者简介：兰炯采，男，52岁，研究员，硕士生导师，主要从事HLA研究；
陈 强，女，26岁，免疫学专业硕士生
4 参考文献
1 赵桐茂著.人类血型遗传学.北京：科学出版社，1987：323
, 百拇医药
2 兰炯采，张祖文，张玉明 et al.HLA-DQB1 PCR-SSP基因分型技术.实验血液学杂志，1996；10(4)：220
3 Zemmour J,Parham P.HLA class I neucleotide sequences,1992.Human Immunol,1992;34:225
4 Olerup O.HLA-B27 typing by a group-specific PCR amplification.Tissue Antigens,1994;43:253
〔收稿日期： 1997-07-08 修稿日期： 1997-10-06〕, http://www.100md.com
单位：陈 强 郑世荣 石 宁 (中国医学科学院中国协和医科大学输血研究所，成都 610081)；兰炯采 现工作单位为第一军医大学南方医院输血科，广州 510515；张祖文 原南京血液中心，现在瑞士Kantonsspital医院
关键词：HLA-B27；聚合酶链反应；基因检定
中国免疫学杂志990910 摘 要 目的：用聚合酶链反应(PCR)和血清学方法检测HLA-B27，并进行比较。方法：采用PCR技术检测78例可疑为强直性脊椎炎患者样本的HLA-B27基因，并与血清学结果比较。结果：36例具有B27基因者中24例同时作血清学试验，5例血清学难以判定结果，并与PCR结果不一致。42例无B27基因者中21例同时作血清学试验，3例血清学结果为可疑。结论：B27基因检定技术与血清学方法比较，有快速、简便、准确性高等优点。
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中国图书分类号 R392.4
Method of HLA-B27 genotyping
LAN Jiong-Cai,CHEN Qiang,ZHENG Shi-Rong et al.
Institute of Blood Transfusion,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College,Chengdu 610081
Abstract Objective:A comparison study of polymerase chain reaction (PCR) and serological typing method was used to detect HLA-B27.Methods:78 samples from patients suspected with ankylosing spondylitis (AS) were genotyped by PCR and some of them were assayed by serological typing.Results:24/36 samples with HLA-B27 gene were compared with serological typing ,the results of 5 samples serological typing were dubious or contradictory with PCR genotyping.21/42 samples without HLA-B27 gene were compared with serological typing,the results of 3 samples serological typing were dubious.Conclusion:The method of B27 genotyping by PCR is more rapid,inexpensive and exact than phenotyping by serology.
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Key words HLA-B27 PCR Genotyping
HLA-B27与强直性脊椎炎(Ankylosing spondylitis,AS)及结膜—尿道—滑膜综合征(Reiter综合征)等疾病相关，前者相对危险率(RR)为87.4，后者为37.0[1]，具有临床辅助诊断价值。既往采用血清学技术检测HLA-B27表型，本文中我们采用PCR技术进行了HLA-B27基因检定研究。
1 材料与方法
1.1 样本 成都及南京地区有腰椎运动受限、腰背疼痛、胸廓扩张受限、虹膜炎病史等症状之一即怀疑为AS者78例，采血做HLA-B27基因检定及表型检测。
1.2 HLA-B27表型检测 采患者静脉血2 ml，肝素抗凝，以标准微量淋巴细胞毒试验检测HLA-B27表型。检定血清板含阳性对照、阴性对照及4孔不同批号的B27抗血清(相关系数r分别为0.84,0.86,0.90,0.90；强度SI%分别为75，77，88，91)。
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1.3 HLA-B27基因检定
1.3.1 DNA模板提取 采患者静脉血0.3 ml，EDTA抗凝，快速盐析法提取DNA[2]。
1.3.2 PCR引物设计 根据已公布的HLA-B27 DNA序列[3]，参考Olerup方案设计B27序列特异性引物[4]；内对照引物5′-CAG、TCT、GTG、CCT、TGG、CGT、TGC，5′-GGC、TAC、GTG、GAC、GAC、ACG、CT，扩增产物为144 bp，可以检出WHO正式命名的8个B27等位基因，包括中国人常见的B27*04，B27*05和B27*06。以上类生长激素(HGH)基因特异性引物为内对照：5′-GCC、TTC、CCA、ACC、ATT、CCC、TTA，5′-TCA、CGG、ATT、TCT、GTT、GTG、TTT，扩增产物为429 bp。以上引物由美国G&T公司合成、纯化及鉴定。
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1.3.3 PCR 将B27引物、内对照引物、MgCl2、Tris、明胶、KCl、dNTP及溴酚蓝等按一定比例(配方将另文报道)配制为PCR反应混合物(B27 Mix)，取B27 Mix 8 μl、被检DNA 100 ng、Taq DNA聚合酶0.5单位混合放入PCR机扩增，循环参数为95℃ 5 min预变性，然后95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 90 s，共30个循环。
1.3.4 PCR产物检测 以1.5%琼脂糖凝胶(含0.5 μg/ml溴乙锭)，0.5×TBE缓冲液，5 V/cm电压电泳30 min，100 bp ladder为参照物，302 nm波长紫外透射仪下分析结果。
2 结 果
2.1 具有HLA-B27基因的样本经PCR扩增出现144 bp特异性区带及429 bp内对照带，无B27基因者只出现429 bp内对照带。如果Taq DNA聚合酶质量欠佳，则有时出现一条大于429 bp的额外区带，并不影响B27基因的判定。上述结果经G&T公司提供的3份具有B27基因DNA及4份无B27基因DNA重复验证，如图1所示。
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图1 HLA-B27基因检定
Fig.1 HLA-B27 genotyping
Note:M.100 bp ladder;lane 1,2,3.without B27 gene;lane 4,5,6.with B27 gene;lane 6,7 as a same sample;lane 7 used low quality Taq DNA polymerase
2.2 本组78例可疑AS者中，具有B27基因者36例，其中34例符合AS诊断标准(X线片证实骶髂关节炎，并附加下列临床表现中1条或2条：腰椎运动受限；腰背疼痛及僵硬感；胸廓扩张受限)，2例X线片无异常不能诊断为AS。无B27基因者42例，其中2例符合AS诊断标准。
2.3 HLA-B27基因与表型检查结果比较
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2.3.1 36例具有B27基因者中，24例同时作血清学试验检查B27表型，其中1例血清学结果为阴性，4例血清学结果可疑(2例1孔血清阳性，积分6；2例(2孔血清阳性，积分4～8)，其余样本4孔血清均阳性。结果均重复验证。
2.3.2 42例无B27基因者中，21例同时作血清学试验，3例血清学结果可疑(1～3孔阳性，积分4)，其余样本4孔血清均阴性。结果均重复验证。
3 讨 论
既住采用微量淋巴细胞毒试验检查B27表型有如下缺点：要求新鲜血至少2 ml，分离的淋巴细胞要有足够数量及活力才能供试验，特殊情况下取材困难；标本难以长期保存供复核或送其他实验室验证；难以获得相关系数r为1.00或强度SI%为100的B27单价抗血清，单份血清有可能漏检或出现假阳性额外反应，如果同时用几份不同批号的血清试验，结果不一致时很难下结论；不同厂家、不同批号的血清定型板的质量难以统一化、标准化，造成不同实验室的结果不易相互比较。本组样本中血清学试验时仅部分血清阳性和/或积分低而难以判定结果，占16.3%(7/43)，此时常要凭“经验”或对血清质量分析来判定结果，常含主观人为因素，很难避免误定B27表型。本组还发现血清学漏检者1例。
, 百拇医药
HLA-B27基因的DNA序列已经清楚，WHO认定有8个等位基因。我们采用PCR技术，可以扩增B27全部等位基因[4]，含内对照引物确保结果可靠。本方法的优点是：仅需少量血样，提取的DNA可保存数年以供复核或送其他实验室验证；快速，采用快速法30 min提取DNA，PCR约2 h，电泳30 min，半天之内可出结果，适于临床常规；准确，分析结果客观，根据内对照带及有无特异性区带判定结果一目了然；试剂系合成品，易于统一化和标准化，有利于各实验室互相比较结果。
作者简介：兰炯采，男，52岁，研究员，硕士生导师，主要从事HLA研究；
陈 强，女，26岁，免疫学专业硕士生
4 参考文献
1 赵桐茂著.人类血型遗传学.北京：科学出版社，1987：323
, 百拇医药
2 兰炯采，张祖文，张玉明 et al.HLA-DQB1 PCR-SSP基因分型技术.实验血液学杂志，1996；10(4)：220
3 Zemmour J,Parham P.HLA class I neucleotide sequences,1992.Human Immunol,1992;34:225
4 Olerup O.HLA-B27 typing by a group-specific PCR amplification.Tissue Antigens,1994;43:253
〔收稿日期： 1997-07-08 修稿日期： 1997-10-06〕, http://www.100md.com