IL-1β诱导新生牛脑微血管平滑肌细胞表达E-选择素①
作者：徐江平 芮耀诚 李铁军
单位：第二军医大学药学院药理学教研室，上海200433
关键词：
中国免疫学杂志990906 E-选择素是细胞粘附分子中选择素(Selection)家族的主要成员之一，属人类白细胞分化抗原CD62E，为110 kD的跨膜糖蛋白[1]；大多数研究认为，E-选择素只表达在受细胞因子作用后的血管内皮细胞[2]，但近来有文献报道，非内皮源性的细胞经细胞因子或脂多糖诱导后也可表达E-选择素[3，4]。本研究将观察新生牛脑微血管内皮细胞(BCMSMC)经IL-1β诱导后是否表达E-选择素。
中国图书分类号 R392.11
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 动物 新生牛，雄性，购自上海光明乳制品公司奶牛场；Wistar大鼠，雌雄兼用，本校实验动物中心提供。
1.2 药品和试剂 人源IL-1β，意大利Sclavo research center 提供;抗E-选择素单克隆抗体(AEmAb),购自Pharmingen公司；辣根过氧化物酶标记羊抗大鼠IgG(HRP-IgG),Calbiochem公司产品；牛血清白蛋白(BSA)，邻苯二胺(OPD)，Sigma公司产品；新生牛血清(NBS)、羊血清(NGS)购自华美生物工程公司；其他试剂均为分析纯或所能达到的最高等级。
1.3 BCMSMC的培养 按本室已建立的方法培养[5]。原代细胞12～15 d形成融合单层，用0.1%胰酶(Sigma)消化,传代,3～5 d传1代，用4～6代细胞进行实验。
1.4 大鼠血单核细胞(Monocytes,MN)的分离 按文献[6]进行。将分离提纯的MN用0.1%BSA/PBS溶液悬浮，并调整细胞浓度为5×106 ml-1备用。
, http://www.100md.com
1.5 细胞粘附实验 4～6代的BCMSMC在96孔培养板生长48 h，呈致密单层，经IL-1β诱导4 h，加入0.1 ml MN，孵育90 min。用Hank's溶液洗去未粘附细胞，再加入0.1 ml, 10 mmol/L EDTA/PBS溶液解离已粘附细胞30 min，吸出解离液，用血细胞记数仪(FACSⅢ型，BD公司)计数MN数目，以被粘附细胞占加入总细胞的百分率为粘附率。
1.6 ELISA方法 参考文献[7]进行。融合BCMSMC单层经IL-1β诱导4 h，用PBS缓冲液洗涤3次，4%多聚甲醛固定3 h，2%NGS/PBS封闭2 h后，加入0.1 ml, 2 μg/ml AEmAb，室温孵育3 h, PBS洗涤3次，加0.1 ml, 1:1 000 HRP-IgG,孵育2 h后, 用PBS洗涤3次，加OPD底物反应30 min, 用50 μl,2 mol/L NaOH终止反应，在酶标仪(BIO-BAD450型) 492 nm处测吸光度(A)值。
, http://www.100md.com 1.7 统计处理 所有数据用x±s表示，并用Student-t检验或单因素方差分析进行检验。
2 结 果
2.1 MN与BCMSMC的粘附 BCMSMC对MN有一定的基础粘附，但一般小于15%，而BCMSMC经IL-1β (100 U/ml) 预处理4 h后，对MN的粘附率则明显增加；将AEmAb与IL-1同时作用于BCMSMC后，可使IL-1β的诱导作用明显减弱(图1)，表明E-选择素介导了BCMSMC对MN的粘附。
图1 AEmAb对IL-1β诱导的BCMSMC与MN粘附的阻断作用(n=4)
Fig.1 Antagonistic effect on MN adhension to BCMSMC induced by IL-1β(n=4)
, 百拇医药
Note:*.P<0.01 as compared with control;**.P<0.01 as compared with IL-1β(100 U/ml)
表1 IL-1β诱导BCMSMC表达E-选择素(
±s)
Tab.1 Expression of E-selection in BCMSMC induced by IL-1β(±s) Group
n
E-selection(A)
Control
, http://www.100md.com
5
0.001±0.001 0
IL-1β(50 U/ml)
6
0.318±0.002 01)
IL-1β(100 U/ml)
6
0.735±0.003 71)
IL-1β(200 U/ml)
5
0.898±0.006 01)
, 百拇医药
Note:1)P<0.01 as compared with control
2.2 IL-1β诱导BCMSMC表达E-选择素 未经诱导的BCMSMC几乎不表达E-选择素，经IL-1β(100 U/ml) 诱导4 h后，BCMSMC表达E-选择素的量明显增加(表1)；方差分析显示，IL-1β的作用具有显著的剂量依赖性。
3 讨 论
E-选择素是细胞粘附分子选择素家族的主要成员之一，在炎症中启动白细胞与血管内皮细胞间的粘附过程，介导淋巴细胞归巢，并在肿瘤细胞转移中起重要作用[1]；文献和本实验室的工作均显示，血管内皮细胞受细胞因子如IL-1和TNF-α等的诱导激活1 h后，即可合成E-选择素，2～4 h达到高峰，24 h逐渐下降，E-选择素的这种动态表达对于控制炎症及肿瘤转移等都有重要的指导意义[1，7]。已有研究表明，大鼠心肌能表达有活性的E-选择素；人主动脉平滑肌细胞也具有E-选择素基因[3，4]。这些研究表明，非内皮源性的细胞是有可能表达E-选择素的。
, 百拇医药
本研究显示，牛脑微血管平滑肌细胞经IL-1β诱导后也可表达有活性的E-选择素，并介导加BCMSMC与MN的粘附，为非内源性组织存在E-选择素基因进一步提供了实验证据，同时也预示E-选择素在心脑血管疾病中的重要性。
①本课题受国家自然科学基金资助( 项目号: 39670832)
作者简介：徐江平，男，31岁，博士，从事脑血管和神经药理学研究；
芮耀诚，57岁，博士生导师，国家新药评审委员会委员，从事心脑血管药理学研究
4 参考文献
1 Bevilacque M P，Nelson R M. Selections. J Clin Invest, 1993; 91(2): 305
, 百拇医药 2 Wong D, Dorovin-Zis K. Regulation by cytokines and lipopolysaccharide of E-selection expression by human brain microvessel endothelial cells in primary culture. J Neuropathol Exp Neurol, 1996； 55(2): 225
3 Hattori Y, Kasai K. Induction of mRNAs for ICAM-1, VCAM-1 and ELAM-1 in cultured rat cardiac myocytes and myocardium in vivo. Bio Chemist Mol Biol Internat, 1997; 41(5): 979
4 Chen X L, Tummala P E, Olliff L et al. E-selection gene expression in vascular smooth muscle cells,evidence for a tissue-specific repressor protein. Circ Res, 1997; 80 (3): 305
5 孙笃新，芮耀诚，曾国钱 et al. 牛脑微血管平滑肌细胞的体外培养及其产生血小板激活因子观察. 解剖学杂志，1992;15(1)：27
6 杨景山. 医学细胞化学与细胞生物技术. 北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社, 1990：1-31
7 徐江平，李铁军，芮耀诚. 银杏叶提取物抑制白介素1β诱导的牛脑微血管内皮细胞表达E-选择素. 中草药，1998；29(增刊): 59
〔收稿1998-08-29 修回1998-10-20〕, http://www.100md.com
单位：第二军医大学药学院药理学教研室，上海200433
关键词：
中国免疫学杂志990906 E-选择素是细胞粘附分子中选择素(Selection)家族的主要成员之一，属人类白细胞分化抗原CD62E，为110 kD的跨膜糖蛋白[1]；大多数研究认为，E-选择素只表达在受细胞因子作用后的血管内皮细胞[2]，但近来有文献报道，非内皮源性的细胞经细胞因子或脂多糖诱导后也可表达E-选择素[3，4]。本研究将观察新生牛脑微血管内皮细胞(BCMSMC)经IL-1β诱导后是否表达E-选择素。
中国图书分类号 R392.11
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 动物 新生牛，雄性，购自上海光明乳制品公司奶牛场；Wistar大鼠，雌雄兼用，本校实验动物中心提供。
1.2 药品和试剂 人源IL-1β，意大利Sclavo research center 提供;抗E-选择素单克隆抗体(AEmAb),购自Pharmingen公司；辣根过氧化物酶标记羊抗大鼠IgG(HRP-IgG),Calbiochem公司产品；牛血清白蛋白(BSA)，邻苯二胺(OPD)，Sigma公司产品；新生牛血清(NBS)、羊血清(NGS)购自华美生物工程公司；其他试剂均为分析纯或所能达到的最高等级。
1.3 BCMSMC的培养 按本室已建立的方法培养[5]。原代细胞12～15 d形成融合单层，用0.1%胰酶(Sigma)消化,传代,3～5 d传1代，用4～6代细胞进行实验。
1.4 大鼠血单核细胞(Monocytes,MN)的分离 按文献[6]进行。将分离提纯的MN用0.1%BSA/PBS溶液悬浮，并调整细胞浓度为5×106 ml-1备用。
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1.5 细胞粘附实验 4～6代的BCMSMC在96孔培养板生长48 h，呈致密单层，经IL-1β诱导4 h，加入0.1 ml MN，孵育90 min。用Hank's溶液洗去未粘附细胞，再加入0.1 ml, 10 mmol/L EDTA/PBS溶液解离已粘附细胞30 min，吸出解离液，用血细胞记数仪(FACSⅢ型，BD公司)计数MN数目，以被粘附细胞占加入总细胞的百分率为粘附率。
1.6 ELISA方法 参考文献[7]进行。融合BCMSMC单层经IL-1β诱导4 h，用PBS缓冲液洗涤3次，4%多聚甲醛固定3 h，2%NGS/PBS封闭2 h后，加入0.1 ml, 2 μg/ml AEmAb，室温孵育3 h, PBS洗涤3次，加0.1 ml, 1:1 000 HRP-IgG,孵育2 h后, 用PBS洗涤3次，加OPD底物反应30 min, 用50 μl,2 mol/L NaOH终止反应，在酶标仪(BIO-BAD450型) 492 nm处测吸光度(A)值。
, http://www.100md.com 1.7 统计处理 所有数据用x±s表示，并用Student-t检验或单因素方差分析进行检验。
2 结 果
2.1 MN与BCMSMC的粘附 BCMSMC对MN有一定的基础粘附，但一般小于15%，而BCMSMC经IL-1β (100 U/ml) 预处理4 h后，对MN的粘附率则明显增加；将AEmAb与IL-1同时作用于BCMSMC后，可使IL-1β的诱导作用明显减弱(图1)，表明E-选择素介导了BCMSMC对MN的粘附。
图1 AEmAb对IL-1β诱导的BCMSMC与MN粘附的阻断作用(n=4)
Fig.1 Antagonistic effect on MN adhension to BCMSMC induced by IL-1β(n=4)
, 百拇医药
Note:*.P<0.01 as compared with control;**.P<0.01 as compared with IL-1β(100 U/ml)
表1 IL-1β诱导BCMSMC表达E-选择素(
±s)Tab.1 Expression of E-selection in BCMSMC induced by IL-1β(
±s) Groupn
E-selection(A)
Control
, http://www.100md.com
5
0.001±0.001 0
IL-1β(50 U/ml)
6
0.318±0.002 01)
IL-1β(100 U/ml)
6
0.735±0.003 71)
IL-1β(200 U/ml)
5
0.898±0.006 01)
, 百拇医药
Note:1)P<0.01 as compared with control
2.2 IL-1β诱导BCMSMC表达E-选择素 未经诱导的BCMSMC几乎不表达E-选择素，经IL-1β(100 U/ml) 诱导4 h后，BCMSMC表达E-选择素的量明显增加(表1)；方差分析显示，IL-1β的作用具有显著的剂量依赖性。
3 讨 论
E-选择素是细胞粘附分子选择素家族的主要成员之一，在炎症中启动白细胞与血管内皮细胞间的粘附过程，介导淋巴细胞归巢，并在肿瘤细胞转移中起重要作用[1]；文献和本实验室的工作均显示，血管内皮细胞受细胞因子如IL-1和TNF-α等的诱导激活1 h后，即可合成E-选择素，2～4 h达到高峰，24 h逐渐下降，E-选择素的这种动态表达对于控制炎症及肿瘤转移等都有重要的指导意义[1，7]。已有研究表明，大鼠心肌能表达有活性的E-选择素；人主动脉平滑肌细胞也具有E-选择素基因[3，4]。这些研究表明，非内皮源性的细胞是有可能表达E-选择素的。
, 百拇医药
本研究显示，牛脑微血管平滑肌细胞经IL-1β诱导后也可表达有活性的E-选择素，并介导加BCMSMC与MN的粘附，为非内源性组织存在E-选择素基因进一步提供了实验证据，同时也预示E-选择素在心脑血管疾病中的重要性。
①本课题受国家自然科学基金资助( 项目号: 39670832)
作者简介：徐江平，男，31岁，博士，从事脑血管和神经药理学研究；
芮耀诚，57岁，博士生导师，国家新药评审委员会委员，从事心脑血管药理学研究
4 参考文献
1 Bevilacque M P，Nelson R M. Selections. J Clin Invest, 1993; 91(2): 305
, 百拇医药 2 Wong D, Dorovin-Zis K. Regulation by cytokines and lipopolysaccharide of E-selection expression by human brain microvessel endothelial cells in primary culture. J Neuropathol Exp Neurol, 1996； 55(2): 225
3 Hattori Y, Kasai K. Induction of mRNAs for ICAM-1, VCAM-1 and ELAM-1 in cultured rat cardiac myocytes and myocardium in vivo. Bio Chemist Mol Biol Internat, 1997; 41(5): 979
4 Chen X L, Tummala P E, Olliff L et al. E-selection gene expression in vascular smooth muscle cells,evidence for a tissue-specific repressor protein. Circ Res, 1997; 80 (3): 305
5 孙笃新，芮耀诚，曾国钱 et al. 牛脑微血管平滑肌细胞的体外培养及其产生血小板激活因子观察. 解剖学杂志，1992;15(1)：27
6 杨景山. 医学细胞化学与细胞生物技术. 北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社, 1990：1-31
7 徐江平，李铁军，芮耀诚. 银杏叶提取物抑制白介素1β诱导的牛脑微血管内皮细胞表达E-选择素. 中草药，1998；29(增刊): 59
〔收稿1998-08-29 修回1998-10-20〕, http://www.100md.com