逆转录病毒介导重组CD23 cDNA 稳定整合的RVc23-8866细胞株的建立①
作者：宋 辉 晋康新 王卫莉 唐 莉 刘 芳 徐德胜
单位：
关键词：逆转录病毒；B淋巴细胞；CD23；RVc23-8866
中国免疫学杂志990902 摘 要 目的：建立稳定整合的细胞株，为研究外源基因定位整合机制及其对靶细胞生物特征影响，建立一个生物模型。方法：构建重组病毒载体PLXCD；用Lipofectin将PLXCD转染PA317包装细胞，用G418筛选获得抗性细胞克隆，扩增抗性细胞收集病毒上清；测定病毒上清效价，感染RPMI8866细胞，用G418筛选获得抗性细胞(RVc23-8866细胞)；用FACS分析RVc23-8866细胞膜蛋白分子CD23的表达；用细胞原位杂交(FISH)分析细胞染色体基因组的改变。结果：建立了稳定整合的RVc23-8866细胞株。结论：FISH结果表明PLXCD重组体已整合到细胞基因组中；FACS分析表明RVc23-8866细胞膜表面CD23分子的表达量明显降低，并说明了整合入基因组的CD23片段影响了固有CD23基因的表达。
, 百拇医药
中国图书分类号 R392.12
Establishment of RVc23-8866 cell line transfected by retrovirus mediated recombinant CD23 cDNA
SONG Hui, JIN Kang-Xin,WANG Wei-Li et al.
Department of Cell Biology,Beijing Medical University,Beijing 100083
Abstract Objective:To establish a stable cell line and employ the cell line as a model to study target integration of exogenous cDNA and modulation of gene expression.Methods:Establish recombinant retrovirus vector PLXCD;use PLXCD to transfect PA317 cells by lipofectin,screen the transfected cells by G418,culture the cells to get supernatant containing viruses;measure the titer of the virus-containing supernatant and transfect RPMI-8866 cells,screen the RVc23-8866 cells by G418;analyze the expression of CD23 on the membrane of RVc23-8866 by FACS;analyze the change of genome by In Situ Hybridization (FISH Method).Results:A stable cell line,RVc23-8866 was established.Conclusions:The results of FISH indicate that the recombinant PLXCD has integrated into the genome of RVc23-8866 cells;the results of FACS indicate that the expression of RVc23-8866 cells;the results of FACS indicate that the expression of membranal CD23 diminished and the integrated CD23 cDNA fragment has effected the expression of inherent CD23 gene.
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Key words Retrovirus B lymphocyte CD23 RVc23-8866
随着分子生物学与分子遗传学的迅速发展和研究深入，使得核酸作为一种生物治疗手段正逐步成为现实。但是在实际应用中尚有许多问题没有得到解决，这在某种程度上限制它的广泛应用。CD23主要是分布在B细胞膜上的45 kD的蛋白分子，具有许多生物功能，在B细胞上发挥着重要的作用[1-3]。为了解决基因治疗中最为关键的外源基因靶向定位和表达调控这一难题，我们设计了用逆转录病毒载体(LXSN neor)介导重组的 CD23 cDNA 进入高表达CD23分子的RPMI8866[4]细胞，建立了RVc23-8866 细胞株，以此作为研究上述问题的生物模型。
1 材料与方法
1.1 试剂 FITC标记的CD23单克隆抗体(ImmunoTech, France)，EcoRⅠ酶、T4连接酶、小肠碱性磷酸酶(均为Promega公司产品)，Lipofectin(GIBCO公司产品)，逆转录病毒载体LXSN (Dr. Miller 惠赠)[5]，CD23cDNA由PGEM-CD23扩增获得。
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1.2 细胞株 RPMI8866细胞株，PA317包装细胞(陈慰峰教授惠赠)，NIH3T3细胞均用含15%小牛血清的DMEM培养基在37℃二氧化碳孵箱中培养。
1.3 重组病毒载体的构建 由PGEM-CD23经扩增后，用EcoRⅠ酶切消化分离获得1.6 kb的CD23片段。病毒载体LXSN (5.8 kb，neor)用EcoRⅠ酶切消化，经用小肠碱性磷酸酶作CIP处理后，用T4连接酶在16℃将线性LXSN与CD23 cDNA连接过夜。经转化DH-1和酶切鉴定筛选后，获得纯化的重组复合体PLXCD。
1.4 病毒上清制备 用Lipofectin将重组的病毒复合体转染PA317包装细胞。用含600 μg/ml G418的DMEM筛选2 w，获得抗性细胞克隆。扩增培养，收取病毒上清[5]。
1.5 病毒上清效价测定 取适当稀释的1 ml病毒上清悬浮1×105NIH3T3细胞，加入8 μg的polybrene于37℃、5%CO2环境培养24 h。去除上清，加入5 ml 含1 mg/ml G418 新鲜的DMEM继续培养72 h。去除上清,用台盼蓝染色，计数活细胞克隆数(CFU/ml)[5]。
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1.6 病毒上清感染RPMI8866细胞 取1 ml 病毒上清悬浮5×105 RPMI8866细胞。加入终浓度为8 μg/ml的Polybrene，于37℃、5%CO2培养3 h。然后，加入5 ml新鲜的DMEM继续培养48 h。弃上清，用新鲜的DMEM洗2次，然后用含400 μg/ml G418的DMEM筛选14 d，获得抗性细胞[6]，扩增备用。
1.7 RVc23-8866细胞膜上CD23分子检测 用Hank's液洗1×106 RPMI8866细胞2次。用20 μl FITC标记的抗CD23单抗重悬细胞，4℃水浴反应30 min。用Hank's液洗2次[2]，FACS分析结果。
1.8 细胞原位杂交(FISH实验 ) 用地高辛标记的LXSN 探针、CD23探针与用乙酸:甲醇(1∶3)固定的RVc23-8866细胞杂交过夜， FITC 标记的抗地高辛抗体37℃反应30 min，荧光显微镜下观察结果[7]。
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2 结 果
2.1 RVc23-8866 细胞与RPMI8866 细胞的比较 经G418连续3次(14 d/每次),RVc23-8866细胞均能在含G418 的DMEM中生长，而RPMI8866细胞则全部死亡 (材料未列出)。FACS 和FISH分析证实 RVc23-8866细胞的膜蛋白分子表达，染色体基因组和细胞形态均已改变。
2.1.1 RVc23-8866 细胞与RPMI8866细胞形态的比较 在倒置显微镜(10×40 倍)下观察可见，RVc23-8866 细胞增大,且细胞内空泡增多。提示逆转录病毒介导外源基因插入RPMI8866细胞，影响了细胞的生长代谢(见图1)。
图1 经G418筛选的RVc23-8866细胞与RPMI8866细胞的比较
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Fig.1 Comparing RPMI8866 cells with RVc23-8866 cells by G418 screening
2.1.2 FACS 分析RVc23-8866细胞膜CD23分子的表达 FITC 标记的CD23 单抗检测，FACS分析证实：RVc23-8866细胞膜荧光强度比正常RPMI8866细胞显著降低，提示RVc23-8866细胞膜CD23分子的表达量降低，外源基因影响了细胞CD23膜蛋白分子的表达(见图2：横坐标表示荧光强度，纵坐标表示细胞数)。
图2 FACS分析膜CD23蛋白分子在RVc23-8866细胞与RPMI8866细胞上的变化
Fig.2 Change of membrane CD23 molecule on RVc23-8866 cells and RPMI8866 cells by FACS analyzing
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2.1.3 细胞原位杂交分析RVc23-8866细胞染色体基因组的改变 用地高辛标记的CD23和LXSN探针检测RVc23-8866细胞和RPMI8866细胞，FISH实验结果可见：用CD23探针杂交，RVc23-8866细胞与RPMI8866细胞上均有黄绿色的杂交荧光斑点(图未给出)。而用LXSN探针的杂交实验发现：仅RVc23-8866细胞可见黄绿色的杂交荧光斑点， RPMI8866细胞没有观察到荧光斑点(图3：箭头所示)。提示RVc23-8866细胞中含有病毒载体序列，说明PLXCD重组体已整合到细胞基因组中。
图3 FISH分析RVc23-8866细胞与RPMI8866细胞的差异
Fig.3 FISH analyzing difference between RVc23-8866 cells and RPMI8866 cells
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2.2 不同浓度的G418对RPMI8866细胞的作用及其量效关系 在6孔培养板中，取1×105 RPMI8866细胞加入到4 ml新鲜的分别含G418 600, 500, 400, 300, 200, 100 μg/ml DMEM培养液, 每个浓度设3个孔。测定活细胞数并计算3个孔的平均数[8]。结果可见：在含400 μg/ml 以上G418的培养液中，细胞在14 d全部死亡(图4)。因此，400 μg/ml G418可以作为筛选本细胞系的最佳有效浓度。用此浓度的G418连续筛选RVc23-8866细胞3次，每次14 d，获得稳定存活的细胞，冻存备用。
图4 RPMI8866细胞在含不同浓度G418培养液中的生长曲线
Fig.4 Living scale of RPMI8866 cells in DMEM containing several different concentrations G418
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3 讨 论
经G418连续筛选成活表明RVc23-8866能表达G418抗性，提示逆转录病毒介导的重组CD23 cDNA已经稳定整合到细胞基因组中。细胞原位杂交分析证实：仅RVc2-38866细胞中有LXSN探针的荧光杂交斑点，说明RVc23-8866是逆转录病毒介导的重组CD23 cDNA在RPMI8866细胞中稳定整合的细胞株。FACS分析证实RVc23-8866细胞膜CD23分子表达降低，推测是由于逆转录病毒LXSN插入或置换了细胞基因组固有的CD23基因。进一步的实验结果将在相关文章中陆续报道。总之，FACS分析、FISH实验及G418筛选均证实RVc23-8866细胞是由逆转录病毒介导的重组CD23 cDNA在RPMI8866细胞中稳定整合的细胞株。
①本课题受国家自然科学基金(No39570681)和国家教委跨世纪优秀人才基金资助
作者简介：宋 辉，男，32岁，讲师，从事分子免疫学和分子细胞生物学研究；
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徐德胜，男，43岁，教授，博士生导师，从事分子免疫学和分子细胞生物学研究
作者单位：
4 参考文献
1 陈新洁，徐德胜，赵海霞 et al. 高浓度CD23单抗抑制B细胞增殖作用的研究.中华微生物学和免疫学杂志，1996；16(5)：323
2 Bonnefoy J Y, Aubry J P, Peronne C et al. Production and characterization of a monoclonal antibody specific for the human lymphocyte low affinity receptor for IgE: CD23 is a low affinity receptor for IgE. J of Immunol, 1987;138(9):2970
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3 Bonnefoy J Y. A new pair of surface molecules involved in human IgE regulation. Immunology Today,1993;14(1): 1
4 Finegold I, Fahey J L, Granger H. Synthesis of immunoglobulins by human cell lines in tissue culture. Journal of Immunology, 1967; 99(5):839
5 Miller A D , Rosman G J. Improved retroviral vector for gene transfer and expression. Bio Techniques, 1989;7(9):980
6 Wang-P M, Chung S W,Dunbar C E et al. Retrovirus-mediated transfer and expression of the interleukin-3 gene in mouse hematopoietic cells result in a myeloproliferative disorder. Molecular and Cellular Biology， 1989； 9:798
7 Parkway P. Chromosome in situ hybridization manual.Gaithershburg:Oncor Inc, 1995： 209
8 Ausubel F M,Kingston R,Seidman J G et al.Short protocols in molecular biology.3rd ed.New York:John Wiley & Sons Inc,1995:15-57
收稿日期：1997-06-25 修稿日期：1998-01-12, 百拇医药
单位：
关键词：逆转录病毒；B淋巴细胞；CD23；RVc23-8866
中国免疫学杂志990902 摘 要 目的：建立稳定整合的细胞株，为研究外源基因定位整合机制及其对靶细胞生物特征影响，建立一个生物模型。方法：构建重组病毒载体PLXCD；用Lipofectin将PLXCD转染PA317包装细胞，用G418筛选获得抗性细胞克隆，扩增抗性细胞收集病毒上清；测定病毒上清效价，感染RPMI8866细胞，用G418筛选获得抗性细胞(RVc23-8866细胞)；用FACS分析RVc23-8866细胞膜蛋白分子CD23的表达；用细胞原位杂交(FISH)分析细胞染色体基因组的改变。结果：建立了稳定整合的RVc23-8866细胞株。结论：FISH结果表明PLXCD重组体已整合到细胞基因组中；FACS分析表明RVc23-8866细胞膜表面CD23分子的表达量明显降低，并说明了整合入基因组的CD23片段影响了固有CD23基因的表达。
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中国图书分类号 R392.12
Establishment of RVc23-8866 cell line transfected by retrovirus mediated recombinant CD23 cDNA
SONG Hui, JIN Kang-Xin,WANG Wei-Li et al.
Department of Cell Biology,Beijing Medical University,Beijing 100083
Abstract Objective:To establish a stable cell line and employ the cell line as a model to study target integration of exogenous cDNA and modulation of gene expression.Methods:Establish recombinant retrovirus vector PLXCD;use PLXCD to transfect PA317 cells by lipofectin,screen the transfected cells by G418,culture the cells to get supernatant containing viruses;measure the titer of the virus-containing supernatant and transfect RPMI-8866 cells,screen the RVc23-8866 cells by G418;analyze the expression of CD23 on the membrane of RVc23-8866 by FACS;analyze the change of genome by In Situ Hybridization (FISH Method).Results:A stable cell line,RVc23-8866 was established.Conclusions:The results of FISH indicate that the recombinant PLXCD has integrated into the genome of RVc23-8866 cells;the results of FACS indicate that the expression of RVc23-8866 cells;the results of FACS indicate that the expression of membranal CD23 diminished and the integrated CD23 cDNA fragment has effected the expression of inherent CD23 gene.
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Key words Retrovirus B lymphocyte CD23 RVc23-8866
随着分子生物学与分子遗传学的迅速发展和研究深入，使得核酸作为一种生物治疗手段正逐步成为现实。但是在实际应用中尚有许多问题没有得到解决，这在某种程度上限制它的广泛应用。CD23主要是分布在B细胞膜上的45 kD的蛋白分子，具有许多生物功能，在B细胞上发挥着重要的作用[1-3]。为了解决基因治疗中最为关键的外源基因靶向定位和表达调控这一难题，我们设计了用逆转录病毒载体(LXSN neor)介导重组的 CD23 cDNA 进入高表达CD23分子的RPMI8866[4]细胞，建立了RVc23-8866 细胞株，以此作为研究上述问题的生物模型。
1 材料与方法
1.1 试剂 FITC标记的CD23单克隆抗体(ImmunoTech, France)，EcoRⅠ酶、T4连接酶、小肠碱性磷酸酶(均为Promega公司产品)，Lipofectin(GIBCO公司产品)，逆转录病毒载体LXSN (Dr. Miller 惠赠)[5]，CD23cDNA由PGEM-CD23扩增获得。
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1.2 细胞株 RPMI8866细胞株，PA317包装细胞(陈慰峰教授惠赠)，NIH3T3细胞均用含15%小牛血清的DMEM培养基在37℃二氧化碳孵箱中培养。
1.3 重组病毒载体的构建 由PGEM-CD23经扩增后，用EcoRⅠ酶切消化分离获得1.6 kb的CD23片段。病毒载体LXSN (5.8 kb，neor)用EcoRⅠ酶切消化，经用小肠碱性磷酸酶作CIP处理后，用T4连接酶在16℃将线性LXSN与CD23 cDNA连接过夜。经转化DH-1和酶切鉴定筛选后，获得纯化的重组复合体PLXCD。
1.4 病毒上清制备 用Lipofectin将重组的病毒复合体转染PA317包装细胞。用含600 μg/ml G418的DMEM筛选2 w，获得抗性细胞克隆。扩增培养，收取病毒上清[5]。
1.5 病毒上清效价测定 取适当稀释的1 ml病毒上清悬浮1×105NIH3T3细胞，加入8 μg的polybrene于37℃、5%CO2环境培养24 h。去除上清，加入5 ml 含1 mg/ml G418 新鲜的DMEM继续培养72 h。去除上清,用台盼蓝染色，计数活细胞克隆数(CFU/ml)[5]。
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1.6 病毒上清感染RPMI8866细胞 取1 ml 病毒上清悬浮5×105 RPMI8866细胞。加入终浓度为8 μg/ml的Polybrene，于37℃、5%CO2培养3 h。然后，加入5 ml新鲜的DMEM继续培养48 h。弃上清，用新鲜的DMEM洗2次，然后用含400 μg/ml G418的DMEM筛选14 d，获得抗性细胞[6]，扩增备用。
1.7 RVc23-8866细胞膜上CD23分子检测 用Hank's液洗1×106 RPMI8866细胞2次。用20 μl FITC标记的抗CD23单抗重悬细胞，4℃水浴反应30 min。用Hank's液洗2次[2]，FACS分析结果。
1.8 细胞原位杂交(FISH实验 ) 用地高辛标记的LXSN 探针、CD23探针与用乙酸:甲醇(1∶3)固定的RVc23-8866细胞杂交过夜， FITC 标记的抗地高辛抗体37℃反应30 min，荧光显微镜下观察结果[7]。
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2 结 果
2.1 RVc23-8866 细胞与RPMI8866 细胞的比较 经G418连续3次(14 d/每次),RVc23-8866细胞均能在含G418 的DMEM中生长，而RPMI8866细胞则全部死亡 (材料未列出)。FACS 和FISH分析证实 RVc23-8866细胞的膜蛋白分子表达，染色体基因组和细胞形态均已改变。
2.1.1 RVc23-8866 细胞与RPMI8866细胞形态的比较 在倒置显微镜(10×40 倍)下观察可见，RVc23-8866 细胞增大,且细胞内空泡增多。提示逆转录病毒介导外源基因插入RPMI8866细胞，影响了细胞的生长代谢(见图1)。
图1 经G418筛选的RVc23-8866细胞与RPMI8866细胞的比较
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Fig.1 Comparing RPMI8866 cells with RVc23-8866 cells by G418 screening
2.1.2 FACS 分析RVc23-8866细胞膜CD23分子的表达 FITC 标记的CD23 单抗检测，FACS分析证实：RVc23-8866细胞膜荧光强度比正常RPMI8866细胞显著降低，提示RVc23-8866细胞膜CD23分子的表达量降低，外源基因影响了细胞CD23膜蛋白分子的表达(见图2：横坐标表示荧光强度，纵坐标表示细胞数)。
图2 FACS分析膜CD23蛋白分子在RVc23-8866细胞与RPMI8866细胞上的变化
Fig.2 Change of membrane CD23 molecule on RVc23-8866 cells and RPMI8866 cells by FACS analyzing
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2.1.3 细胞原位杂交分析RVc23-8866细胞染色体基因组的改变 用地高辛标记的CD23和LXSN探针检测RVc23-8866细胞和RPMI8866细胞，FISH实验结果可见：用CD23探针杂交，RVc23-8866细胞与RPMI8866细胞上均有黄绿色的杂交荧光斑点(图未给出)。而用LXSN探针的杂交实验发现：仅RVc23-8866细胞可见黄绿色的杂交荧光斑点， RPMI8866细胞没有观察到荧光斑点(图3：箭头所示)。提示RVc23-8866细胞中含有病毒载体序列，说明PLXCD重组体已整合到细胞基因组中。
图3 FISH分析RVc23-8866细胞与RPMI8866细胞的差异
Fig.3 FISH analyzing difference between RVc23-8866 cells and RPMI8866 cells
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2.2 不同浓度的G418对RPMI8866细胞的作用及其量效关系 在6孔培养板中，取1×105 RPMI8866细胞加入到4 ml新鲜的分别含G418 600, 500, 400, 300, 200, 100 μg/ml DMEM培养液, 每个浓度设3个孔。测定活细胞数并计算3个孔的平均数[8]。结果可见：在含400 μg/ml 以上G418的培养液中，细胞在14 d全部死亡(图4)。因此，400 μg/ml G418可以作为筛选本细胞系的最佳有效浓度。用此浓度的G418连续筛选RVc23-8866细胞3次，每次14 d，获得稳定存活的细胞，冻存备用。
图4 RPMI8866细胞在含不同浓度G418培养液中的生长曲线
Fig.4 Living scale of RPMI8866 cells in DMEM containing several different concentrations G418
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经G418连续筛选成活表明RVc23-8866能表达G418抗性，提示逆转录病毒介导的重组CD23 cDNA已经稳定整合到细胞基因组中。细胞原位杂交分析证实：仅RVc2-38866细胞中有LXSN探针的荧光杂交斑点，说明RVc23-8866是逆转录病毒介导的重组CD23 cDNA在RPMI8866细胞中稳定整合的细胞株。FACS分析证实RVc23-8866细胞膜CD23分子表达降低，推测是由于逆转录病毒LXSN插入或置换了细胞基因组固有的CD23基因。进一步的实验结果将在相关文章中陆续报道。总之，FACS分析、FISH实验及G418筛选均证实RVc23-8866细胞是由逆转录病毒介导的重组CD23 cDNA在RPMI8866细胞中稳定整合的细胞株。
①本课题受国家自然科学基金(No39570681)和国家教委跨世纪优秀人才基金资助
作者简介：宋 辉，男，32岁，讲师，从事分子免疫学和分子细胞生物学研究；
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徐德胜，男，43岁，教授，博士生导师，从事分子免疫学和分子细胞生物学研究
作者单位：
4 参考文献
1 陈新洁，徐德胜，赵海霞 et al. 高浓度CD23单抗抑制B细胞增殖作用的研究.中华微生物学和免疫学杂志，1996；16(5)：323
2 Bonnefoy J Y, Aubry J P, Peronne C et al. Production and characterization of a monoclonal antibody specific for the human lymphocyte low affinity receptor for IgE: CD23 is a low affinity receptor for IgE. J of Immunol, 1987;138(9):2970
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3 Bonnefoy J Y. A new pair of surface molecules involved in human IgE regulation. Immunology Today,1993;14(1): 1
4 Finegold I, Fahey J L, Granger H. Synthesis of immunoglobulins by human cell lines in tissue culture. Journal of Immunology, 1967; 99(5):839
5 Miller A D , Rosman G J. Improved retroviral vector for gene transfer and expression. Bio Techniques, 1989;7(9):980
6 Wang-P M, Chung S W,Dunbar C E et al. Retrovirus-mediated transfer and expression of the interleukin-3 gene in mouse hematopoietic cells result in a myeloproliferative disorder. Molecular and Cellular Biology， 1989； 9:798
7 Parkway P. Chromosome in situ hybridization manual.Gaithershburg:Oncor Inc, 1995： 209
8 Ausubel F M,Kingston R,Seidman J G et al.Short protocols in molecular biology.3rd ed.New York:John Wiley & Sons Inc,1995:15-57
收稿日期：1997-06-25 修稿日期：1998-01-12, 百拇医药