血小板活化因子抗体的研制①
作者：姚新生 孙万邦 李官成
单位：遵义医学院免疫学教研室，遵义 563003
关键词：
中国免疫学杂志991120 中国图书分类号 R392.1
血小板活化因子(PAF)自发现以来，一直受到广泛的重视，现认为PAF是一种具有激素样广泛生物学活性的物质[1]。关于血小板活化因子抗体的研制，国外有部分实验室有报道，国内少见报道，本文根据血小板活化因子特殊的化学结构，采用2种不同的方法制备出PAF免疫原，经皮下多点和足底加淋巴结2种不同途径注射免疫新西兰白兔和Balb/c小鼠，制备出效价较高、特异性较强的PAF多克隆抗体。
1 材料与方法
1.1 材料 PAF纯品、卵磷脂、胆固醇、弗氏完全佐剂(CFA)、甲基化牛血清白蛋白(MBSA)均购自美国Sigma公司；羊抗兔酶标抗体为华美生物工程公司产品；无水乙醇、醋酐等均为国产分析纯试剂；DG-3022A酶标仪为国营华东电子管厂产品；96孔酶标板为DAKA公司产品；新西兰白兔，雄性，体重2.0～2.5 kg，遵义医学院实验动物中心提供；Balb/c小鼠，体重18～22 g，重庆医科大学实验动物中心提供。
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1.2 方法
1.2.1 PAF免疫原的制备 参照Nishihira等的方法改良制备PAF1免疫原：取PAF 1.2 mg，卵磷脂12 mg，胆固醇70 mg，加无水乙醇20 ml溶解后，加到80 ml的PBS(20 mol/L,pH7.4)中，充分混合后，4 000 r/min 离心15 min，去上清，于沉淀中加入1%的MBSA 8 ml(MBSA用20 mol/L，pH7.4的含碳二亚胺的PBS溶解)。4℃静置过夜，其间摇匀3次，再加入等体积的CFA，边加边研磨2 h，制备出PAF1免疫原。PAF2免疫原的制备：取PAF 1.2 mg加 2 ml无水乙醇溶解后，加入1%的MBSA溶液8 ml混合(MBSA用20 mol/L，pH7.4的含碳二亚胺的PBS溶解)，边加边缓慢搅拌，4℃静置过夜，其间摇匀3次，再加入等体积的CFA，边加边研磨 2 h，同时加入吡啶和醋酐各8μl，制备出PAF2免疫原[2]。
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1.2.2 动物免疫程序 取新西兰白兔12只，Balb/c小鼠6只，每3只动物分一组，分别以PAF1、PAF2免疫动物，免疫途径分皮下和足底加淋巴结注射，足底加淋巴结组在兔疫前10 d以卡介苗(BCG)足底注射刺激淋巴结肿大，鼠单用皮下注射，6组免疫程序均为5次。
1.2.3 免疫血清效价测定与特异性试验 以双向琼脂扩散试验和ELISA法分别测免疫血清中抗体效价并鉴定其特异性。实验分别设胆固醇、卵磷脂，正常新西兰白兔和正常Balb/c小鼠血清作对照。双向琼脂扩散试验以出现明显的沉淀线时，免疫血清的最大稀释度为抗体的效价，ELISA法以P/N≥2.1时，免疫血清的最大稀释度为抗体的效价。
2 结果
2.1 免疫血清的抗体效价 双向琼脂扩散试验测定家兔抗体效价，皮下多点注射组最高为1∶16，足底加淋巴结注射组最高1∶32，小鼠抗体效价最高为1∶8。ELISA测定抗体效价家兔4组最高为1∶10 240，小鼠抗体效价最高为1∶9 600。
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2.2 抗体的特异性 双向琼脂扩散试验显示免疫血清与PAF出现一条明显的沉淀线，与胆固醇、卵磷脂未出现沉淀线，正常新西兰白兔和正常Balb/c小鼠血清与PAF未出现沉淀线，ELISA试验以P/N≥2.1为阳性，测兔4组免疫血清的特异性，1只免疫血清与PAF孔P/N≥2.1(5.94)。
3 讨论
1984年Nishihira等开始对PAF抗体进行研究，以一种混合的免疫原免疫新西兰白兔，制备出PAF抗体[2]。我们参照这种方法改良制备出2种免疫原，同时免疫新西兰白兔和Balb/c小鼠，均制备出PAF抗体。在制备免疫原时，首先考虑到PAF分子量小，免疫原性弱，又不易与其他载体相连接，因而采用混合的抗原与佐剂抗原。PAF1中的卵磷脂与胆固醇有可能是起一种脂质体佐剂的作用[3]，PAF也有可能和MBSA在弗氏完全佐剂抗原的包裹下，形成一种有效的免疫原，刺激机体产生抗体；同时PAF于乙醇中溶解后，在与PBS、MBSA、CFA混合中有可能形成两相的双分子层，构成类似于脂质体佐剂的作用，于局部产生缓慢持久的刺激，促使机体合成抗PAF的抗体。同时考虑到PAF的活性基团—乙酰基极不稳定，易被乙酰水解酶水解失去活性[4]，在制备PAF2免疫原时，加入了乙酰化试剂，即吡啶和醋酐，以恢复PAF在注射部位被乙酰水解酶水解的乙酰基团，延长其在局部的刺激时间。本研究初步成功，将为进一步研制效价高、特异性好的PAF多克隆抗体和PAF单克隆抗体及探索检测PAF的免疫学方法打下基础。
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①本课题受贵州省教委基金资助(91011)
作者简介：姚新生，男，29岁，硕士生，主要从事免疫生化研究；
孙万邦，男，48岁，教授，硕士生导师，主要从事分子免疫学研究
4 参考文献
1 Benveniste J P,Henson M,Cochrane C G.Leukocyte dependent histamine release from rabbit platelets the role of IgE,basophils,and platelet activating factor.J Exp Med,1972;136:1356
2 Nishihira J K,Ishibashi T,Imai Y.Production and characteirzation of specific antibodies against PAF.J Bioxhem Tokyo,1984;95(5):124
3 徐葛林.脂质体用作疫苗佐剂的研究进展.国外医学*预防，诊断，治疗生物制品分册，1996；19(1):10
4 甘卫华.肾病综合征患儿血浆血小板活化因子、血小板的变化.中华儿科杂志，1995；33(4)：212
收稿1998-05-21 修回1999-06-18, http://www.100md.com
单位：遵义医学院免疫学教研室，遵义 563003
关键词：
中国免疫学杂志991120 中国图书分类号 R392.1
血小板活化因子(PAF)自发现以来，一直受到广泛的重视，现认为PAF是一种具有激素样广泛生物学活性的物质[1]。关于血小板活化因子抗体的研制，国外有部分实验室有报道，国内少见报道，本文根据血小板活化因子特殊的化学结构，采用2种不同的方法制备出PAF免疫原，经皮下多点和足底加淋巴结2种不同途径注射免疫新西兰白兔和Balb/c小鼠，制备出效价较高、特异性较强的PAF多克隆抗体。
1 材料与方法
1.1 材料 PAF纯品、卵磷脂、胆固醇、弗氏完全佐剂(CFA)、甲基化牛血清白蛋白(MBSA)均购自美国Sigma公司；羊抗兔酶标抗体为华美生物工程公司产品；无水乙醇、醋酐等均为国产分析纯试剂；DG-3022A酶标仪为国营华东电子管厂产品；96孔酶标板为DAKA公司产品；新西兰白兔，雄性，体重2.0～2.5 kg，遵义医学院实验动物中心提供；Balb/c小鼠，体重18～22 g，重庆医科大学实验动物中心提供。
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1.2 方法
1.2.1 PAF免疫原的制备 参照Nishihira等的方法改良制备PAF1免疫原：取PAF 1.2 mg，卵磷脂12 mg，胆固醇70 mg，加无水乙醇20 ml溶解后，加到80 ml的PBS(20 mol/L,pH7.4)中，充分混合后，4 000 r/min 离心15 min，去上清，于沉淀中加入1%的MBSA 8 ml(MBSA用20 mol/L，pH7.4的含碳二亚胺的PBS溶解)。4℃静置过夜，其间摇匀3次，再加入等体积的CFA，边加边研磨2 h，制备出PAF1免疫原。PAF2免疫原的制备：取PAF 1.2 mg加 2 ml无水乙醇溶解后，加入1%的MBSA溶液8 ml混合(MBSA用20 mol/L，pH7.4的含碳二亚胺的PBS溶解)，边加边缓慢搅拌，4℃静置过夜，其间摇匀3次，再加入等体积的CFA，边加边研磨 2 h，同时加入吡啶和醋酐各8μl，制备出PAF2免疫原[2]。
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1.2.2 动物免疫程序 取新西兰白兔12只，Balb/c小鼠6只，每3只动物分一组，分别以PAF1、PAF2免疫动物，免疫途径分皮下和足底加淋巴结注射，足底加淋巴结组在兔疫前10 d以卡介苗(BCG)足底注射刺激淋巴结肿大，鼠单用皮下注射，6组免疫程序均为5次。
1.2.3 免疫血清效价测定与特异性试验 以双向琼脂扩散试验和ELISA法分别测免疫血清中抗体效价并鉴定其特异性。实验分别设胆固醇、卵磷脂，正常新西兰白兔和正常Balb/c小鼠血清作对照。双向琼脂扩散试验以出现明显的沉淀线时，免疫血清的最大稀释度为抗体的效价，ELISA法以P/N≥2.1时，免疫血清的最大稀释度为抗体的效价。
2 结果
2.1 免疫血清的抗体效价 双向琼脂扩散试验测定家兔抗体效价，皮下多点注射组最高为1∶16，足底加淋巴结注射组最高1∶32，小鼠抗体效价最高为1∶8。ELISA测定抗体效价家兔4组最高为1∶10 240，小鼠抗体效价最高为1∶9 600。
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2.2 抗体的特异性 双向琼脂扩散试验显示免疫血清与PAF出现一条明显的沉淀线，与胆固醇、卵磷脂未出现沉淀线，正常新西兰白兔和正常Balb/c小鼠血清与PAF未出现沉淀线，ELISA试验以P/N≥2.1为阳性，测兔4组免疫血清的特异性，1只免疫血清与PAF孔P/N≥2.1(5.94)。
3 讨论
1984年Nishihira等开始对PAF抗体进行研究，以一种混合的免疫原免疫新西兰白兔，制备出PAF抗体[2]。我们参照这种方法改良制备出2种免疫原，同时免疫新西兰白兔和Balb/c小鼠，均制备出PAF抗体。在制备免疫原时，首先考虑到PAF分子量小，免疫原性弱，又不易与其他载体相连接，因而采用混合的抗原与佐剂抗原。PAF1中的卵磷脂与胆固醇有可能是起一种脂质体佐剂的作用[3]，PAF也有可能和MBSA在弗氏完全佐剂抗原的包裹下，形成一种有效的免疫原，刺激机体产生抗体；同时PAF于乙醇中溶解后，在与PBS、MBSA、CFA混合中有可能形成两相的双分子层，构成类似于脂质体佐剂的作用，于局部产生缓慢持久的刺激，促使机体合成抗PAF的抗体。同时考虑到PAF的活性基团—乙酰基极不稳定，易被乙酰水解酶水解失去活性[4]，在制备PAF2免疫原时，加入了乙酰化试剂，即吡啶和醋酐，以恢复PAF在注射部位被乙酰水解酶水解的乙酰基团，延长其在局部的刺激时间。本研究初步成功，将为进一步研制效价高、特异性好的PAF多克隆抗体和PAF单克隆抗体及探索检测PAF的免疫学方法打下基础。
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①本课题受贵州省教委基金资助(91011)
作者简介：姚新生，男，29岁，硕士生，主要从事免疫生化研究；
孙万邦，男，48岁，教授，硕士生导师，主要从事分子免疫学研究
4 参考文献
1 Benveniste J P,Henson M,Cochrane C G.Leukocyte dependent histamine release from rabbit platelets the role of IgE,basophils,and platelet activating factor.J Exp Med,1972;136:1356
2 Nishihira J K,Ishibashi T,Imai Y.Production and characteirzation of specific antibodies against PAF.J Bioxhem Tokyo,1984;95(5):124
3 徐葛林.脂质体用作疫苗佐剂的研究进展.国外医学*预防，诊断，治疗生物制品分册，1996；19(1):10
4 甘卫华.肾病综合征患儿血浆血小板活化因子、血小板的变化.中华儿科杂志，1995；33(4)：212
收稿1998-05-21 修回1999-06-18, http://www.100md.com