双抗HBsAg抗体夹心时间分辨免疫荧光分析方法的建立
作者：额尔敦 其其格 郭美香 韩 玲 刘士山 张丽民 陈 杞 张庆荣
单位：额尔敦 其其格 郭美香 刘士山 解放军第二五三医院免疫中心，呼和浩特 010051；韩 玲 张丽民 陈 杞 解放军第二军医大学放射医学研究所，上海 200433；张庆荣 上海市岳阳医院中心实验室，上海 200437
关键词：
中国免疫学杂志991110 中国图书分类号 R371-33
时间分辨免疫荧光分析技术(TRIFMA)具有灵敏度高、稳定性好等优点。乙型肝炎表面抗原(HBsAg)是感染乙型肝炎病毒的重要标志，目前临床多以ELISA法进行检测，为了进一步提高HBsAg检测的灵敏度，我们建立了HBsAg的TRIFMA检测的方法。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 标本 选择用科华ELISA药盒检测HBsAg阳性和阴性肝素抗凝血血清，-20℃保存。
1.2 试剂仪器 抗HBsAg单克隆抗体、多克隆抗体及HBsAg由本室制备。酯化生物素(BNSH)和ABC复合物，由海军医学研究所流行病研究所程振球研究员赠。链亲和素、BSA为Sigma产品。Eu3+标记药盒为Wallac产品。条排酶标板为Wallac DELFIA产品。时间分辨荧光计，Arcus1234及配套装置。酶联检测仪，STL340ATC产品。
1.3 生物素标记抗HBsAg单抗 选择酯化生物素和抗HBsAg单抗以700 μg Bio/mg抗体作为最佳标记比值，标记品用2%BSA适当稀释，加等量甘油分装，-80℃保存。
1.4 Eu3+标记链亲和素(SA) 异硫氰酸苯基EDTA-Eu3+和链亲和素的摩尔比约为80：1，4℃过夜，加入50mmol/L pH8.8，含0.9%NaCl的碳酸缓冲液中，Sephadex G-50柱(1×25cm)洗脱液淋洗，收集流出液(每管1ml/6min)逐管测量吸光度(A280)，合并峰管，定出蛋白量。用Arcus1234测定峰管荧光强度，同时测已知Eu3+浓度标准液，从而获得标记到链亲和素上Eu3+的量，所得标记率(Eu3+mol/SAmol)约是7，蛋白回收率约70%。
, 百拇医药
1.5 方法 羊抗HBsAg多抗稀释成10μg/ml，分别取200μl加入酶联板孔，室温放置24～48h，洗涤3次；每孔加封闭液250μl，37℃2 h，室温过夜。冲洗1次，晾干，设置空白、标准、样品孔，其中空白管加试验缓冲液100μl，标准曲线加0.05，0.10，0.50,1.00,10.00,50.00,100.00 ng/ml不同梯度的标准HBsAg溶液100μl，样品孔加待测样品25 μl后补加试验缓冲液至100μl，室温振荡反应1h，洗涤4次；然后加入酯化生物素标记抗HBsAg单抗液100μl，室温振荡反应1h,洗涤6次；最后每孔加入稀释好的Eu3+标记链亲和素100μl，室温振荡反应1 h，洗涤10次，加增强液100μl，振荡10min，放置5min，即可在Acrus1234时间分辨荧光计上测量荧光强度，用预先编制的程序划出标准曲线，并直接打印出待测样品浓度。
2 结果
由绘制标准曲线可知，线性范围在0.05～100.00ng/ml，即本法最小可测值是0.05ng/ml以下，从而大大提高了HBsAg检测的灵敏度。我们的重复性、准确性均较好，批内CV(3.58%～9.90%)，平均6.74%，对3个不同浓度的标准品检测，回收率分别为99.48%，108.00%，109.00%，通过与ELISA法相比较，本法灵敏度明显高于酶联法(P<0.01)。
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3 讨论
在实验过程中，我们发现生物素标记单抗的加量比较低，因此采用振荡反应适当延长反应时间，更有助于提高灵敏度，降低本底。同时，我们也发现Eu3+标记链亲和素用的螯合剂质量很重要。用国产螯合剂，本底普通比Wallac生产螯合剂标记的高。综上所述，本文建立的TRIFMA法，分析范围和灵敏度以及稳定性均较理想，对乙型肝炎早期诊断、预防、治疗有非常重要的意义。对血库血源的筛查来说，本方法的灵敏度较高，更能避免输血造成的传染病的传播。
作者简介：额尔敦，主管技师，硕士
收稿 1998-10-13 修回 1999-03-17, 百拇医药
单位：额尔敦 其其格 郭美香 刘士山 解放军第二五三医院免疫中心，呼和浩特 010051；韩 玲 张丽民 陈 杞 解放军第二军医大学放射医学研究所，上海 200433；张庆荣 上海市岳阳医院中心实验室，上海 200437
关键词：
中国免疫学杂志991110 中国图书分类号 R371-33
时间分辨免疫荧光分析技术(TRIFMA)具有灵敏度高、稳定性好等优点。乙型肝炎表面抗原(HBsAg)是感染乙型肝炎病毒的重要标志，目前临床多以ELISA法进行检测，为了进一步提高HBsAg检测的灵敏度，我们建立了HBsAg的TRIFMA检测的方法。
1 材料与方法
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1.1 标本 选择用科华ELISA药盒检测HBsAg阳性和阴性肝素抗凝血血清，-20℃保存。
1.2 试剂仪器 抗HBsAg单克隆抗体、多克隆抗体及HBsAg由本室制备。酯化生物素(BNSH)和ABC复合物，由海军医学研究所流行病研究所程振球研究员赠。链亲和素、BSA为Sigma产品。Eu3+标记药盒为Wallac产品。条排酶标板为Wallac DELFIA产品。时间分辨荧光计，Arcus1234及配套装置。酶联检测仪，STL340ATC产品。
1.3 生物素标记抗HBsAg单抗 选择酯化生物素和抗HBsAg单抗以700 μg Bio/mg抗体作为最佳标记比值，标记品用2%BSA适当稀释，加等量甘油分装，-80℃保存。
1.4 Eu3+标记链亲和素(SA) 异硫氰酸苯基EDTA-Eu3+和链亲和素的摩尔比约为80：1，4℃过夜，加入50mmol/L pH8.8，含0.9%NaCl的碳酸缓冲液中，Sephadex G-50柱(1×25cm)洗脱液淋洗，收集流出液(每管1ml/6min)逐管测量吸光度(A280)，合并峰管，定出蛋白量。用Arcus1234测定峰管荧光强度，同时测已知Eu3+浓度标准液，从而获得标记到链亲和素上Eu3+的量，所得标记率(Eu3+mol/SAmol)约是7，蛋白回收率约70%。
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1.5 方法 羊抗HBsAg多抗稀释成10μg/ml，分别取200μl加入酶联板孔，室温放置24～48h，洗涤3次；每孔加封闭液250μl，37℃2 h，室温过夜。冲洗1次，晾干，设置空白、标准、样品孔，其中空白管加试验缓冲液100μl，标准曲线加0.05，0.10，0.50,1.00,10.00,50.00,100.00 ng/ml不同梯度的标准HBsAg溶液100μl，样品孔加待测样品25 μl后补加试验缓冲液至100μl，室温振荡反应1h，洗涤4次；然后加入酯化生物素标记抗HBsAg单抗液100μl，室温振荡反应1h,洗涤6次；最后每孔加入稀释好的Eu3+标记链亲和素100μl，室温振荡反应1 h，洗涤10次，加增强液100μl，振荡10min，放置5min，即可在Acrus1234时间分辨荧光计上测量荧光强度，用预先编制的程序划出标准曲线，并直接打印出待测样品浓度。
2 结果
由绘制标准曲线可知，线性范围在0.05～100.00ng/ml，即本法最小可测值是0.05ng/ml以下，从而大大提高了HBsAg检测的灵敏度。我们的重复性、准确性均较好，批内CV(3.58%～9.90%)，平均6.74%，对3个不同浓度的标准品检测，回收率分别为99.48%，108.00%，109.00%，通过与ELISA法相比较，本法灵敏度明显高于酶联法(P<0.01)。
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3 讨论
在实验过程中，我们发现生物素标记单抗的加量比较低，因此采用振荡反应适当延长反应时间，更有助于提高灵敏度，降低本底。同时，我们也发现Eu3+标记链亲和素用的螯合剂质量很重要。用国产螯合剂，本底普通比Wallac生产螯合剂标记的高。综上所述，本文建立的TRIFMA法，分析范围和灵敏度以及稳定性均较理想，对乙型肝炎早期诊断、预防、治疗有非常重要的意义。对血库血源的筛查来说，本方法的灵敏度较高，更能避免输血造成的传染病的传播。
作者简介：额尔敦，主管技师，硕士
收稿 1998-10-13 修回 1999-03-17, 百拇医药