人胎盘泌乳素乳胶诊断试剂盒的研制①
作者：王晓东 李立梅 周连福 由家惠 李玉珍 付平平 王彦忠
单位：王晓东 李立梅 周连福 由家惠 李玉珍 吉林省计划生育科研所，长春 130041；付平平 白求恩医科大学第三临床医院，长春 130021；王彦忠 吉林省医院，长春 130021
关键词：人胎盘泌乳素；围产期；胎盘功能
中国免疫学杂志991109 中国图书分类号 R446.6
摘 要 目的：根据聚苯乙烯乳胶对蛋白质的良好吸附性能，通过对乳胶的化学改性，使其能够同人胎盘泌乳素(Human placetal lactogen，HPL) 抗血清牢固联接。方法：利用乳胶作为联接HPL抗血清的载体，同孕妇血清进行凝集反应。根据血清的稀释倍数，半定量测定出HPL的浓度。结果：经过对183例足月孕妇血清测定，并同时与单向免疫扩散法做相关性比较，两者呈高度相关，相关系数r=0.611，P<0.001。结论：此方法可以作为围产期检查胎盘功能的一种新方法。
, 百拇医药
Development of diagnosis kit for human placental lactogen (HPL) by latex
WANG Xiao-Dong,LI Li-Mei，ZHOU Lian-Fu et al
(Family Planning Institute of Jilin Province,Changchun 130041)
Abstract Objective：According to the property of polystyrene latex that can adsorb Proteins perfectly anti-HPL serum was combined with latex that was modified Chemically. Methods：Latex that was linked with anti-hpl serum can act as a carrier that will agglutinate when it reacts with pregnancy' serum. The concentration of HPL will be analyzed half quantitatively by serum dilution. Results：We analyzed 183 cases pregnancys' serums using latex agglutination and immunodiffusion .The results show that these two methods have high correlations, the correlation coefficient r=0.611(p<0.001). Conclusion：Indicated that the latex agglutination kit could be a new method to detect peripartum placental function.
, 百拇医药
Key words Human placental lactogen Perinatology Placental function
自1956年Singer和Ploz首次报道以乳胶为载体建立免疫学诊断方法以来，乳胶凝集作为快速检查方法，深受使用者欢迎。但由于乳胶本身的局限性和空间位阻效应，使免疫活性物质不能有效充分结合到乳胶表面[1]。所以目前国内多为联接抗原的乳胶凝集抑制试验，而能够联接抗体的乳胶报道甚少。经资料查询国内未发现乳胶直接凝集试剂盒产品。我们经过多年的试验研究，采用化学修饰的方法，使合成的乳胶表面带有活泼脂基团，可直接同抗血清联接，方法简单实用，并且成功地将人胎盘泌乳素(HPL)抗血清联接到乳胶上，生产出HPL乳胶诊断试剂盒，现将实验报道如下。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 Strrene 苯乙烯(国产)，MES、2-N-吗啡啉-乙磺酸(Serva公司)，SDS、十二烷基磺酸钠(Sigma公司)，EDC、水溶性碳化二亚胺(Sigma公司)，HOBT、N-羟基苯丙三氮唑(Sigma公司)。
, http://www.100md.com
1.2 HPL的提纯及抗血清的制备 应用正常足月产妇胎盘, 经组织捣碎、离心、盐析、柱层析、亲合层析等手段，将HPL提纯，然后按常规方法免疫家兔，制备HPL抗血清[2]。
1.3 羧化聚苯乙烯的合成 应用3口圆底瓶，加入去离子水，在88℃水浴中300 r/min，恒温搅拌，加入SDS，待溶后按比例依次加入无阻聚剂的苯乙烯纯品、MES，连续搅拌6 h，由苯乙烯的汽油味变成杏仁味即为聚合完毕，合成后的乳胶为乳白色颗粒，直径约为0.8 μm，可采用高速离心进行颗粒筛选。
1.4 羧化乳胶的化学改性[1] 将合成的乳胶经离子交换和离心除去水溶性物质，包括表面活性剂、无机盐、可溶性高分子聚合物、非电解质等，然后按比例加入HOBT和EDC，目的是将羧基化乳胶进行化学改性，使羧基变成活泼脂基团，使免疫活性物质能与乳胶联接牢固。
1.5 乳胶同提纯后的HPL抗血清联接 取化学改性的乳胶,用甘氨酸缓冲液(GBS)配成20%浓度, 分别加入1,2, 4mg/ml不同浓度的HPL抗血清, 在56℃恒温水浴振荡反应24 h, 使HPL抗血清能充分同乳胶联接, 经10 000r/min, 30min离心洗涤3次, 洗涤液为加入1%兔血清的GBS,恢复原体积, 加入0.1%NaN3防腐。
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2 结果
2.1 致敏乳胶的自凝检测 在黑色背景的玻片上画2.5～3.0 cm大小的漆圈为反应板，将3批致敏HPL抗血清的乳胶分别配成1%浓度，各加入反应板圆圈内1滴(约30 μl)。再加入GBS缓冲液1滴，慢慢摇动反应板3～5 min，在明亮的光线下观察各不同致敏浓度是否有自凝现象。经过检测，3个致敏浓度以2 mg/ml的致敏浓度为最佳，同GBS缓冲液无凝集，乳胶颗粒均匀，大小一致。
2.2 非特异性凝集检测 将38例正常男性血清,分别稀释20、40、80倍，分别加入反应板1滴，再加入2 mg/ml致敏HPL抗血清乳胶1滴，连续慢慢摇动3～5 min，观察是否有凝集反应。经测定38例男性血清各稀释倍数均无凝集反应，说明致敏的HPL抗血清乳胶同正常男性血清无非特异性凝集反应。
2.3 致敏乳胶的敏感度检测 将提纯的HPL参考标准抗原，用GBS稀释成不同浓度[2]，分别加在反应板1滴，再加入致敏乳胶1滴。慢慢摇动反应板5 min，观察各浓度的凝集反应，以出现凝集的最低标准液浓度或标准液的最高稀释倍数为判定终点，经过测定，乳胶的敏感度为0.125 mg/L。凝集明显,颗粒均匀,界线清楚。
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2.4 致敏乳胶的稳定性检测 将致敏的乳胶试剂, 在4℃冰箱内放置6个月后进行测定, 乳胶的敏感度和清晰度均未发生改变。效价稳定，无自凝发生，说明致敏的乳胶试剂稳定性符合要求。
2.5 hpl乳胶法与hpl单向免疫扩散法的比较 将183例37～42孕周的孕妇血清,分别稀释为20、40、80倍，取各浓度血清1滴，加在反应板上，再分别加入2mg/ml致敏的乳胶液1滴，摇动反应板，5 min后判定结果，以出现明显凝集颗粒为判定终点，根据乳胶法的敏感度为0.125 mg/L,乳胶法半定量测定的HPL值为20倍2.5 mg/L，40倍5mg/L，80倍10mg/L。以20倍为危险值，40倍为异常值，80倍为正常值。同HPL单向免疫扩散法进行对照比较，单向免疫扩散法6 mg/L以下为异常值，6mg/L以上为正常值，结果见表1。
随机抽取50例进行两种方法的相关性比较,结果两法测值呈高度相关, 相关系数r=0.611，P<0.001, 其直线回归方程y=3.645+0.3184x[5]。
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表1 乳胶法与单向免疫扩散法测定HPL值比较
Tab.1 Comparison of hpl concentration between Latax agglutination and single immunodiffusion Method
Cases
Concentration
of hpl>6 mg/L
Concentration
of hpl≤6 mg/L
Cases
%
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Cases
%
HPL Latex
Agglutination
183
169
92.34
14
7.66
HPL single
Immunodiffusion
183
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160
87.43
23
12.57
3 讨论
蛋白质浓度对致敏效果影响很大，浓度低时反应慢，敏感度低，凝集颗粒小，结果不易判定。浓度过高，因未结合的蛋白游离过多，会产生非特异性凝集反应，因此必须选择合适 的致敏浓度，经过多次试验，选择2 mg/ml蛋白浓度较为理想，但是所选择的抗血清必须要纯度高、效价高，因为乳胶表面的空间结构是固定的，只有提高抗血清的纯度和效价，才能提高试剂的敏感性和特异性。
乳胶颗粒的化学改性，是本研究的关键步骤，我们参考国内外有关乳胶试剂的材料[3]，经过多次实验，找到了适合乳胶改性的条件，使乳胶的羧基改变为活泼脂基团，使改性后的乳胶具有牢固联接抗血清的能力，通过联接HPL抗血清的成功，说明改性的乳胶也可以联接其它不同种类的抗血清，应用到其它检测项目上，制备出各种反相乳胶凝集诊断试剂，这种直接反应的乳胶凝集试验，在传统乳胶凝集方法的基础上有很大的提高，使操作更加简单方便。
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经过我们对183例孕妇血清的测定，并同时与单向免疫扩散法做相关性比较，证明两法有良好的一致性，说明乳胶半定量测定方法，可以作为检测胎盘功能的一种新方法，同其它方法相比，乳胶法具有简单、快速、微量、价廉[4]。取耳垂血分离出10μl血清即可满足试验要求，使受检者容易接受。经查阅有关文献资料，未发现国内市场有此类乳胶产品，在未来快速诊断方法中，是很有开发价值的检测方法。
①吉林省科技发展计划资助项目
作者简介：王晓东，男，43岁，副研究员，主要从事免疫学诊断试剂的研究
4 参考文献
1 卢锦汉主编.医学生物制品学.北京：人民卫生出版社，1995：1060-1065
2 王晓东，崔建华，孟召祥 et al.人胎盘泌乳素(HPL)单向免疫扩散法试剂盒的研究和应用.中国免疫学杂志，1995；11(4)：226
3 王文学.异型双功能剂法致敏乳胶.第四军医大学学报，1991；12(4)：288
4 王立岩，张文颖，张为远 et al.应用酶联免疫法测定妊娠晚期血清HPL水平的研究.中国实用妇科与产科杂志，1996；12(5)：285
收稿1998-09-10 修回1999-06-11, http://www.100md.com
单位：王晓东 李立梅 周连福 由家惠 李玉珍 吉林省计划生育科研所，长春 130041；付平平 白求恩医科大学第三临床医院，长春 130021；王彦忠 吉林省医院，长春 130021
关键词：人胎盘泌乳素；围产期；胎盘功能
中国免疫学杂志991109 中国图书分类号 R446.6
摘 要 目的：根据聚苯乙烯乳胶对蛋白质的良好吸附性能，通过对乳胶的化学改性，使其能够同人胎盘泌乳素(Human placetal lactogen，HPL) 抗血清牢固联接。方法：利用乳胶作为联接HPL抗血清的载体，同孕妇血清进行凝集反应。根据血清的稀释倍数，半定量测定出HPL的浓度。结果：经过对183例足月孕妇血清测定，并同时与单向免疫扩散法做相关性比较，两者呈高度相关，相关系数r=0.611，P<0.001。结论：此方法可以作为围产期检查胎盘功能的一种新方法。
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Development of diagnosis kit for human placental lactogen (HPL) by latex
WANG Xiao-Dong,LI Li-Mei，ZHOU Lian-Fu et al
(Family Planning Institute of Jilin Province,Changchun 130041)
Abstract Objective：According to the property of polystyrene latex that can adsorb Proteins perfectly anti-HPL serum was combined with latex that was modified Chemically. Methods：Latex that was linked with anti-hpl serum can act as a carrier that will agglutinate when it reacts with pregnancy' serum. The concentration of HPL will be analyzed half quantitatively by serum dilution. Results：We analyzed 183 cases pregnancys' serums using latex agglutination and immunodiffusion .The results show that these two methods have high correlations, the correlation coefficient r=0.611(p<0.001). Conclusion：Indicated that the latex agglutination kit could be a new method to detect peripartum placental function.
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Key words Human placental lactogen Perinatology Placental function
自1956年Singer和Ploz首次报道以乳胶为载体建立免疫学诊断方法以来，乳胶凝集作为快速检查方法，深受使用者欢迎。但由于乳胶本身的局限性和空间位阻效应，使免疫活性物质不能有效充分结合到乳胶表面[1]。所以目前国内多为联接抗原的乳胶凝集抑制试验，而能够联接抗体的乳胶报道甚少。经资料查询国内未发现乳胶直接凝集试剂盒产品。我们经过多年的试验研究，采用化学修饰的方法，使合成的乳胶表面带有活泼脂基团，可直接同抗血清联接，方法简单实用，并且成功地将人胎盘泌乳素(HPL)抗血清联接到乳胶上，生产出HPL乳胶诊断试剂盒，现将实验报道如下。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 Strrene 苯乙烯(国产)，MES、2-N-吗啡啉-乙磺酸(Serva公司)，SDS、十二烷基磺酸钠(Sigma公司)，EDC、水溶性碳化二亚胺(Sigma公司)，HOBT、N-羟基苯丙三氮唑(Sigma公司)。
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1.2 HPL的提纯及抗血清的制备 应用正常足月产妇胎盘, 经组织捣碎、离心、盐析、柱层析、亲合层析等手段，将HPL提纯，然后按常规方法免疫家兔，制备HPL抗血清[2]。
1.3 羧化聚苯乙烯的合成 应用3口圆底瓶，加入去离子水，在88℃水浴中300 r/min，恒温搅拌，加入SDS，待溶后按比例依次加入无阻聚剂的苯乙烯纯品、MES，连续搅拌6 h，由苯乙烯的汽油味变成杏仁味即为聚合完毕，合成后的乳胶为乳白色颗粒，直径约为0.8 μm，可采用高速离心进行颗粒筛选。
1.4 羧化乳胶的化学改性[1] 将合成的乳胶经离子交换和离心除去水溶性物质，包括表面活性剂、无机盐、可溶性高分子聚合物、非电解质等，然后按比例加入HOBT和EDC，目的是将羧基化乳胶进行化学改性，使羧基变成活泼脂基团，使免疫活性物质能与乳胶联接牢固。
1.5 乳胶同提纯后的HPL抗血清联接 取化学改性的乳胶,用甘氨酸缓冲液(GBS)配成20%浓度, 分别加入1,2, 4mg/ml不同浓度的HPL抗血清, 在56℃恒温水浴振荡反应24 h, 使HPL抗血清能充分同乳胶联接, 经10 000r/min, 30min离心洗涤3次, 洗涤液为加入1%兔血清的GBS,恢复原体积, 加入0.1%NaN3防腐。
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2 结果
2.1 致敏乳胶的自凝检测 在黑色背景的玻片上画2.5～3.0 cm大小的漆圈为反应板，将3批致敏HPL抗血清的乳胶分别配成1%浓度，各加入反应板圆圈内1滴(约30 μl)。再加入GBS缓冲液1滴，慢慢摇动反应板3～5 min，在明亮的光线下观察各不同致敏浓度是否有自凝现象。经过检测，3个致敏浓度以2 mg/ml的致敏浓度为最佳，同GBS缓冲液无凝集，乳胶颗粒均匀，大小一致。
2.2 非特异性凝集检测 将38例正常男性血清,分别稀释20、40、80倍，分别加入反应板1滴，再加入2 mg/ml致敏HPL抗血清乳胶1滴，连续慢慢摇动3～5 min，观察是否有凝集反应。经测定38例男性血清各稀释倍数均无凝集反应，说明致敏的HPL抗血清乳胶同正常男性血清无非特异性凝集反应。
2.3 致敏乳胶的敏感度检测 将提纯的HPL参考标准抗原，用GBS稀释成不同浓度[2]，分别加在反应板1滴，再加入致敏乳胶1滴。慢慢摇动反应板5 min，观察各浓度的凝集反应，以出现凝集的最低标准液浓度或标准液的最高稀释倍数为判定终点，经过测定，乳胶的敏感度为0.125 mg/L。凝集明显,颗粒均匀,界线清楚。
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2.4 致敏乳胶的稳定性检测 将致敏的乳胶试剂, 在4℃冰箱内放置6个月后进行测定, 乳胶的敏感度和清晰度均未发生改变。效价稳定，无自凝发生，说明致敏的乳胶试剂稳定性符合要求。
2.5 hpl乳胶法与hpl单向免疫扩散法的比较 将183例37～42孕周的孕妇血清,分别稀释为20、40、80倍，取各浓度血清1滴，加在反应板上，再分别加入2mg/ml致敏的乳胶液1滴，摇动反应板，5 min后判定结果，以出现明显凝集颗粒为判定终点，根据乳胶法的敏感度为0.125 mg/L,乳胶法半定量测定的HPL值为20倍2.5 mg/L，40倍5mg/L，80倍10mg/L。以20倍为危险值，40倍为异常值，80倍为正常值。同HPL单向免疫扩散法进行对照比较，单向免疫扩散法6 mg/L以下为异常值，6mg/L以上为正常值，结果见表1。
随机抽取50例进行两种方法的相关性比较,结果两法测值呈高度相关, 相关系数r=0.611，P<0.001, 其直线回归方程y=3.645+0.3184x[5]。
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表1 乳胶法与单向免疫扩散法测定HPL值比较
Tab.1 Comparison of hpl concentration between Latax agglutination and single immunodiffusion Method
Cases
Concentration
of hpl>6 mg/L
Concentration
of hpl≤6 mg/L
Cases
%
, http://www.100md.com
Cases
%
HPL Latex
Agglutination
183
169
92.34
14
7.66
HPL single
Immunodiffusion
183
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160
87.43
23
12.57
3 讨论
蛋白质浓度对致敏效果影响很大，浓度低时反应慢，敏感度低，凝集颗粒小，结果不易判定。浓度过高，因未结合的蛋白游离过多，会产生非特异性凝集反应，因此必须选择合适 的致敏浓度，经过多次试验，选择2 mg/ml蛋白浓度较为理想，但是所选择的抗血清必须要纯度高、效价高，因为乳胶表面的空间结构是固定的，只有提高抗血清的纯度和效价，才能提高试剂的敏感性和特异性。
乳胶颗粒的化学改性，是本研究的关键步骤，我们参考国内外有关乳胶试剂的材料[3]，经过多次实验，找到了适合乳胶改性的条件，使乳胶的羧基改变为活泼脂基团，使改性后的乳胶具有牢固联接抗血清的能力，通过联接HPL抗血清的成功，说明改性的乳胶也可以联接其它不同种类的抗血清，应用到其它检测项目上，制备出各种反相乳胶凝集诊断试剂，这种直接反应的乳胶凝集试验，在传统乳胶凝集方法的基础上有很大的提高，使操作更加简单方便。
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经过我们对183例孕妇血清的测定，并同时与单向免疫扩散法做相关性比较，证明两法有良好的一致性，说明乳胶半定量测定方法，可以作为检测胎盘功能的一种新方法，同其它方法相比，乳胶法具有简单、快速、微量、价廉[4]。取耳垂血分离出10μl血清即可满足试验要求，使受检者容易接受。经查阅有关文献资料，未发现国内市场有此类乳胶产品，在未来快速诊断方法中，是很有开发价值的检测方法。
①吉林省科技发展计划资助项目
作者简介：王晓东，男，43岁，副研究员，主要从事免疫学诊断试剂的研究
4 参考文献
1 卢锦汉主编.医学生物制品学.北京：人民卫生出版社，1995：1060-1065
2 王晓东，崔建华，孟召祥 et al.人胎盘泌乳素(HPL)单向免疫扩散法试剂盒的研究和应用.中国免疫学杂志，1995；11(4)：226
3 王文学.异型双功能剂法致敏乳胶.第四军医大学学报，1991；12(4)：288
4 王立岩，张文颖，张为远 et al.应用酶联免疫法测定妊娠晚期血清HPL水平的研究.中国实用妇科与产科杂志，1996；12(5)：285
收稿1998-09-10 修回1999-06-11, http://www.100md.com