肝素诱导结晶紫比色法检测成纤维细胞生长因子的生物活性
作者：叶春婷 李斯明 邹海燕 杨小红 叶惠贞
单位：广州市红十字会医院创伤外科研究所，广州 510220
关键词：成纤维细胞生长因子；结晶紫；肝素
中国免疫学杂志991108 中国图书分类号 R392.33 Q342.4
摘 要 目的：为寻找一种简便、经济、灵敏度高而不需使用放射性同位素的生物活性检测方法对成纤维细胞生长因子(FGF)进行检测。方法：利用肝素对Balb/c 3T3细胞株进行诱导，然后运用结晶紫比色法对其进行生物活性检测。结果：最大吸光度 A值的一半为 0.315，所对应的 aFGF浓度为24 pg/ml，而没有肝素诱导的最大A值一半为 0.16，所对应的浓度为156 pg/ml。结论：肝素的存在提高了结晶紫法的灵敏度。因此是一种简便、快捷而值得推广应用的 FGF生物活性检测法。
, 百拇医药
Bioassay for fibroblast growth factor by crystal violet inducing with heparin
YE Chun-Ting,LI Si-Ming,ZOU Hai-Yan et al
(Guangzhou Red Cross Hospital,Guangzhou 510220
Abstract Objective：Fibroblast growth factor (FGF) is one of the important cytokines for wound healing.It can accelerate the regeneration of blood vessel,nerve and epidermis.To look for a bioassay of FGF that is not only easy,economic and high sensitivity ,but also not involving radioisotope such as 3H-TdR.Methods：The authors used heparin to induce the Balb/c 3T3 cells,and then the crystal violet colorimetric analysis(CVCA) was used to measure its boiogical activity .Results:It showed that the half-maximal of A value was stimulated by 24 pg/ml aFGF with inducing by heparin,while that was stimulated by 156 pg/ml aFGF without heparin inducing .Conclusion：The existing of heparin could enhance the sensitivity of CVCA.It may be an easy,sensitive and valuable method to popularize for FGF bioassay.
, 百拇医药
Key words Fibroblast growth factor Heparin Crystal violet
成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor, FGF)是一种重要的促创伤愈合因子，不但促进创面的愈合[1]，而且对血管和神经的再生有很强的促进作用[2]，成为当今研究的热点之一。无论是生化提取物还是基因工程产品，其纯度和生物活性都不断提高，这就要求相应的生物活性的检测手段也要不断进步。目前， FGF的生物活性检测法以 3H-TdR方法为主，因其使用放射性同位素，受设备和仪器的限制，加上操作繁琐，检测费用高，因此，我们致力于研究一种高灵敏度，操作简便而且经济的检测方法。
1 材料与方法
1.1 材料 aFGF：GIBCO BRL10μg/瓶；DMEM：GIBCOBRL ；结晶紫：中国远航化工厂 A.R；SDS：INDONESIA CHEICALS；新生小牛血清(NCS)，成都华西生化制品厂。
, 百拇医药
1.2 方法 于96孔平底板加入含10%NCS的 DMEM培养基，再加入10 ng/ml aFGF溶液进行倍比稀释，随后加入含 50μg/ml肝素钠的Balb/c3T3细胞悬液，于37℃5%CO2培养48h，去除上清，加入0.5%结晶紫溶液染色15min后，冲去染色液，于50℃烘干，加入 1%SDS溶液，振荡溶解，于540 nm读吸光度 A值。
2 结果
结果如图1所示。
图1 3T3细胞增殖反应曲线
Fig.1 Proliferation of 3T3 cell line
Note:Half-maximal of A value was stimulated by 24 pg/ml with heparin,by 156 pg/ml without heparin
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3 讨论
FGF又分为 aFGF(酸性)和 bFGF(碱性)两种，两者具有相同的生物学功能。其中 bFGF对其受体的亲和性大于 aFGF，因此 bFGF的生物学活性比 aFGF强10～100倍左右[3]。但无论aFGF还是 bFGF都同样能与肝素结合，从而加强了 FGF的生物学功能，在分离纯化 FGF时就利用了这一点，从而大大提高了分离的效果和速度[4]。在本研究中，我们在生物活性的鉴定上也利用这一点来提高其检测的灵敏度。如上图所示，不加肝素诱导的最大吸光度 A值一半为 0.16，所对应的浓度为156 pg/ml，加肝素诱导最大 A值的一半为 0.315，所对应的浓度为24 pg/ml，在aFGF的生物活性检测中加入肝素其灵敏度明显提高。据报道，肝素的存在可使 aFGF的活性增加10～100倍，包括刺激 3T3细胞和血管内皮细胞的生长，其作用的有效浓度范围为10～100 ng/ml[5]。由于 bFGF的活性比 aFGF高，其作用的有效浓度可能会适当降低。
, 百拇医药
我们利用肝素作为诱导剂，不但提高了检测的灵敏度，而且还缩短和简化了检测的时间和步骤。因为灵敏度高，分辨率也相应提高，省略了无血清或低血清培养 3T3细胞的步骤，直接用细胞培养用血清浓度即可，细胞不用“饥锇”，保持着良好的状态，给后面的检测工作提供了良好的基础。
结晶紫法检测细胞因子生物活性属比色法范畴，它是利用结晶紫的甲醇溶液对活细胞直接进行固定染色，再用水充分洗去剩余的染色液，烘干后用 SDS溶解细胞即可比色。此法操作简便，需时短，无需细胞代谢摄入的中间过程。对于象 3T3这样的贴壁细胞尤其合适，因为染色后的细胞仍然紧贴板壁，只要沿板边小心冲洗掉多余的染料即可，省去了收集和离心洗涤细胞的麻烦。在检测另一种类似的细胞因子即表皮生长因子(EGF)时，我们也运用了结晶紫法，而且还和 MTT和 3H -TdR方法进行实验对照，结果结晶紫法的灵敏度与 3H-TdR法相仿，比 MTT法高[6]。
, 百拇医药 运用结晶紫法检测 FGF的生物活性，无论从操作的繁简，经济因素以及对人体和环境的危害等都比现时普遍应用的 3H-TdR法具有优势，加肝素诱导后，灵敏度也相应提高了，这就为结晶紫法的普遍应用提供了前提。
作者简介：叶春婷，女，30岁，硕士，主要从事组织工程学；
李斯明，男，37岁，副主任医师
4 参考文献
1 McGee G S.Recombinant basic fibroblast growth factor accelerates wound healing.J Surg Res,1988;45:145
2 Gospodarowicz D.Molecular and biological characterization of fibroblast growth factor： a cangiogenic factor which also controls the proliferation and differentiation of mesoderm and neurectoderm derived cells.Cell Differ,1986;19:1
, 百拇医药
3 周延冲.多肽生长因子.北京：中国科学技术出版社，1992：209-230
4 Rogers M L,Belford D A,Francis G L et al.Identification of fibroblast growth factors in bovine cheese whey.J Dairy Res，1995;62(3):501
5 薛沿宁，王会信，汪浩勇 et al.重组人酸性成纤维细胞生长因子的分离纯化及鉴定.生物化学与生物物理学报，1993；25(4)：403
6 叶春婷，李斯明，查健群et al. 结晶紫比色法检测表皮生长因子生物活性的探讨.中华微生物学和免疫学杂志，1997；17(2)：154
收稿1998-05-25 二次修回1999-02-10, 百拇医药
单位：广州市红十字会医院创伤外科研究所，广州 510220
关键词：成纤维细胞生长因子；结晶紫；肝素
中国免疫学杂志991108 中国图书分类号 R392.33 Q342.4
摘 要 目的：为寻找一种简便、经济、灵敏度高而不需使用放射性同位素的生物活性检测方法对成纤维细胞生长因子(FGF)进行检测。方法：利用肝素对Balb/c 3T3细胞株进行诱导，然后运用结晶紫比色法对其进行生物活性检测。结果：最大吸光度 A值的一半为 0.315，所对应的 aFGF浓度为24 pg/ml，而没有肝素诱导的最大A值一半为 0.16，所对应的浓度为156 pg/ml。结论：肝素的存在提高了结晶紫法的灵敏度。因此是一种简便、快捷而值得推广应用的 FGF生物活性检测法。
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Bioassay for fibroblast growth factor by crystal violet inducing with heparin
YE Chun-Ting,LI Si-Ming,ZOU Hai-Yan et al
(Guangzhou Red Cross Hospital,Guangzhou 510220
Abstract Objective：Fibroblast growth factor (FGF) is one of the important cytokines for wound healing.It can accelerate the regeneration of blood vessel,nerve and epidermis.To look for a bioassay of FGF that is not only easy,economic and high sensitivity ,but also not involving radioisotope such as 3H-TdR.Methods：The authors used heparin to induce the Balb/c 3T3 cells,and then the crystal violet colorimetric analysis(CVCA) was used to measure its boiogical activity .Results:It showed that the half-maximal of A value was stimulated by 24 pg/ml aFGF with inducing by heparin,while that was stimulated by 156 pg/ml aFGF without heparin inducing .Conclusion：The existing of heparin could enhance the sensitivity of CVCA.It may be an easy,sensitive and valuable method to popularize for FGF bioassay.
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Key words Fibroblast growth factor Heparin Crystal violet
成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor, FGF)是一种重要的促创伤愈合因子，不但促进创面的愈合[1]，而且对血管和神经的再生有很强的促进作用[2]，成为当今研究的热点之一。无论是生化提取物还是基因工程产品，其纯度和生物活性都不断提高，这就要求相应的生物活性的检测手段也要不断进步。目前， FGF的生物活性检测法以 3H-TdR方法为主，因其使用放射性同位素，受设备和仪器的限制，加上操作繁琐，检测费用高，因此，我们致力于研究一种高灵敏度，操作简便而且经济的检测方法。
1 材料与方法
1.1 材料 aFGF：GIBCO BRL10μg/瓶；DMEM：GIBCOBRL ；结晶紫：中国远航化工厂 A.R；SDS：INDONESIA CHEICALS；新生小牛血清(NCS)，成都华西生化制品厂。
, 百拇医药
1.2 方法 于96孔平底板加入含10%NCS的 DMEM培养基，再加入10 ng/ml aFGF溶液进行倍比稀释，随后加入含 50μg/ml肝素钠的Balb/c3T3细胞悬液，于37℃5%CO2培养48h，去除上清，加入0.5%结晶紫溶液染色15min后，冲去染色液，于50℃烘干，加入 1%SDS溶液，振荡溶解，于540 nm读吸光度 A值。
2 结果
结果如图1所示。
图1 3T3细胞增殖反应曲线
Fig.1 Proliferation of 3T3 cell line
Note:Half-maximal of A value was stimulated by 24 pg/ml with heparin,by 156 pg/ml without heparin
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3 讨论
FGF又分为 aFGF(酸性)和 bFGF(碱性)两种，两者具有相同的生物学功能。其中 bFGF对其受体的亲和性大于 aFGF，因此 bFGF的生物学活性比 aFGF强10～100倍左右[3]。但无论aFGF还是 bFGF都同样能与肝素结合，从而加强了 FGF的生物学功能，在分离纯化 FGF时就利用了这一点，从而大大提高了分离的效果和速度[4]。在本研究中，我们在生物活性的鉴定上也利用这一点来提高其检测的灵敏度。如上图所示，不加肝素诱导的最大吸光度 A值一半为 0.16，所对应的浓度为156 pg/ml，加肝素诱导最大 A值的一半为 0.315，所对应的浓度为24 pg/ml，在aFGF的生物活性检测中加入肝素其灵敏度明显提高。据报道，肝素的存在可使 aFGF的活性增加10～100倍，包括刺激 3T3细胞和血管内皮细胞的生长，其作用的有效浓度范围为10～100 ng/ml[5]。由于 bFGF的活性比 aFGF高，其作用的有效浓度可能会适当降低。
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我们利用肝素作为诱导剂，不但提高了检测的灵敏度，而且还缩短和简化了检测的时间和步骤。因为灵敏度高，分辨率也相应提高，省略了无血清或低血清培养 3T3细胞的步骤，直接用细胞培养用血清浓度即可，细胞不用“饥锇”，保持着良好的状态，给后面的检测工作提供了良好的基础。
结晶紫法检测细胞因子生物活性属比色法范畴，它是利用结晶紫的甲醇溶液对活细胞直接进行固定染色，再用水充分洗去剩余的染色液，烘干后用 SDS溶解细胞即可比色。此法操作简便，需时短，无需细胞代谢摄入的中间过程。对于象 3T3这样的贴壁细胞尤其合适，因为染色后的细胞仍然紧贴板壁，只要沿板边小心冲洗掉多余的染料即可，省去了收集和离心洗涤细胞的麻烦。在检测另一种类似的细胞因子即表皮生长因子(EGF)时，我们也运用了结晶紫法，而且还和 MTT和 3H -TdR方法进行实验对照，结果结晶紫法的灵敏度与 3H-TdR法相仿，比 MTT法高[6]。
, 百拇医药 运用结晶紫法检测 FGF的生物活性，无论从操作的繁简，经济因素以及对人体和环境的危害等都比现时普遍应用的 3H-TdR法具有优势，加肝素诱导后，灵敏度也相应提高了，这就为结晶紫法的普遍应用提供了前提。
作者简介：叶春婷，女，30岁，硕士，主要从事组织工程学；
李斯明，男，37岁，副主任医师
4 参考文献
1 McGee G S.Recombinant basic fibroblast growth factor accelerates wound healing.J Surg Res,1988;45:145
2 Gospodarowicz D.Molecular and biological characterization of fibroblast growth factor： a cangiogenic factor which also controls the proliferation and differentiation of mesoderm and neurectoderm derived cells.Cell Differ,1986;19:1
, 百拇医药
3 周延冲.多肽生长因子.北京：中国科学技术出版社，1992：209-230
4 Rogers M L,Belford D A,Francis G L et al.Identification of fibroblast growth factors in bovine cheese whey.J Dairy Res，1995;62(3):501
5 薛沿宁，王会信，汪浩勇 et al.重组人酸性成纤维细胞生长因子的分离纯化及鉴定.生物化学与生物物理学报，1993；25(4)：403
6 叶春婷，李斯明，查健群et al. 结晶紫比色法检测表皮生长因子生物活性的探讨.中华微生物学和免疫学杂志，1997；17(2)：154
收稿1998-05-25 二次修回1999-02-10, 百拇医药