多抗甲素与IL-2协同促进骨髓移植小鼠免疫功能重建
作者：陈冬志 姚爱敏 杨福祥 谢蜀生 龙振洲
单位：陈冬志 河北省职工医学院，保定 071000；谢蜀生 龙振洲 北京医科大学免疫系 北京 100083；姚爱敏 保定市妇幼保健院，保定 071000；杨福祥 保定市急救中心，保定 071000
关键词：多抗甲素；骨髓移植；免疫重建
中国免疫学杂志991104 中国图书分类号 R967 R392.4
摘 要 目的：为了探讨多抗甲素PAA与IL-2对骨髓移植(BMT)小鼠免疫功能重建的影响。 方法：用致死量照射的Balb/c小鼠移植同系小鼠骨髓细胞后, 分别给予PAA、IL-2或PAA+IL-2, 30 d后检查3组BMT小鼠免疫功能重建的情况。 结果：BMT后30 d,自然恢复小鼠免疫功能十分低下,但PAA及IL-2用药鼠脾细胞对丝裂原反应, 对SRBC特异的PFC数, 对同种异型小鼠脾细胞 DTH及MLR均明显高于移植对照组, 同时IL-2的产生能力也明显增强, 而PAA+IL-2组作用又明显强于PAA及IL-2单独用药组。结论：PAA及IL-2均能单独从多方面促进BMT后免疫功能重建,PAA+IL-2 则从多方面表现出一定的协同效应。
, 百拇医药
The combination of PAA plus IL-2 enhanced immunoconstitution of the lethally irradiated mice following syngeneic bone marrow transplantation
CHEN Dong-Zhi,YAO Ai-Min,YANG Fu-Xiang et al.Hebei Medical College for Continuing Education, Baoding 071000
Abstract Objective：To explore the effect of PAA and IL-2 enhanced immunoconstitution of the lethally irradiated mice following syngeneic bone marrow transplantation. Methods： The lethally irradiated Balb/c mice were engrafted with syngeneic bone marrow cells, then were injected with PAA or IL-2 or PAA+IL-2, for 7 days. On the thirtieth day after BMT, The authors detected the immunological function of BMT mice. Results： On the thirtieth day after BMT, the immunological functions of the BMT mice were seriously deficient, but the recovery of the immunologic functions such as proliferation of splenocytes to ConA and mixed lymphocyte reaction to allogeneic cell, the DTH responsibility to C57BL/C cells, anti-SRBC PFC and the production of IL-2 by the splenocytes in the mice that treated single with PAA or IL-2 post BMT were markedly enhanced than that of BMT mice, and the recovery of immunologic functions were markedly accelerated in the BMT mice treated with PAA plus IL-2, when compared with that of the BMT mice injected with PAA or IL-2 alone. Conclusion： PAA and IL-2 can markedly enhanced immunoconstitution of BMT mice when be used alone,furthermore, while the two drugs were applied simutaneously , the coordinate role will be shown.
, 百拇医药
Key words Poly actin A (PAA) Bone marrow transplantation (BMT) Immunoconstitution
骨髓移植后免疫功能的自然恢复是一个相当缓慢而复杂的过程。由于骨髓和胸腺微环境的损伤, GVHD的影响, 加上重建早期T抑制细胞功能亢进, 使BMT后患者免疫机能长期缺损,特别是T细胞功能缺损, 患者常因严重感染而死亡。因此促进BMT后免疫功能的重建是一个重要的研究课题。
近年来随着重组细胞因子及一些药物的出现,为研究BMT后免疫功能重建开辟了新的领域, 并已展示出广阔的应用前景。已有报道IL-2能明显促进BMT后免疫功能的恢复。多抗甲素(PAA)是一种很有效的造血刺激剂, 具有明显的免疫增强作用和促进骨髓造血的功能。本文通过体内实验报道了PAA与IL-2单独及协同对BMT小鼠免疫重建的促进作用, 并对其作用机理进行了初步探讨。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 Balb/c (H-2d), C57BL/6 (H-2b) 纯系小鼠, 10～14 周龄,雌雄皆有，北京医科大学动物部提供。
1.1.2 试剂及细胞株 刀豆蛋白A (ConA),细菌脂多糖(LPS), 丝裂霉素C 为Sigma公司产品。3H-TdR，中国科学院原子能研究所产品；Ly2-FITC，L3T4-PE，BD 公司产品；rhIL-2，北医免疫系马大龙教授提供。多抗甲素(PAA)系北京第三制药厂生产的10 ml×10 mg 口服液。
1.2 方法
1.2.1 PAA剂量试验 Balb/c小鼠20只, 随机分成4组, 腹腔注射PAA剂量分别为: 1 组12.5 mg/(kg.d), 2组25.0 mg/(kg.d), 3组50.0 mg/(kg.d), 4组100.0 mg/(kg.d)。 连续用药7 d, 同时另设正常对照组, 用生理盐水代药, 处理同上。第8 天小鼠断颈处死, 取脾细胞制悬液, 测定PFC/脾值。
, 百拇医药
1.2.2 骨髓移植 Balb/c小鼠脱颈处死后, 无菌取股骨和胫骨, 用RPMI 1640冲洗骨髓腔,过4号针头制成单个骨髓细胞悬液。 另取Balb/c小鼠40只,经60Co源750 Rad照射( 剂量率约90 Rad/min)后, 4 h内经尾静脉输入2×107个供体骨髓细胞,然后分组将小鼠置无菌饲养笼内饲养[1]。从第2天开始给药, 连续7 d, 至BMT 后30 d测定免疫功能,密切观察动物的状态。
1.2.3 细胞对丝裂原的增殖反应 取经照射的Balb/c小鼠进行随机分组, 第1组为BMT后生理盐水对照, 第2组为BMT后应用PAA实验组。 第3组为BMT后应用IL-2实验组, 第4组为BMT后应用PAA+IL-2实验组。 于BMT后30 d测定小鼠脾细胞对ConA、LPS的增殖反应,具体方法详见文献[2]。
1.2.4 溶血空斑实验(PFC) 分组同第4组, 方法为Cunningham小室法[3]；混合淋巴细胞反应(MLR)，分组同第4组, 方法见文献[4]；对异型小鼠脾细胞的迟发型超敏反应(DTH)，分组同第4组, 方法见文献[5]；白细胞介素2(IL-2)诱生，分组同第4组, 方法见文献[6]。
, 百拇医药
1.2.5 共同培养实验 处死骨髓移植小鼠无菌取脾制备单个细胞悬液, 用10%RPMI 1640液配成 2.5×106 ml或5.0×106 ml于正常Balb/c小鼠脾细胞悬液混合培养。检测对ConA 增殖反应及IL-2的产生。
1.2.6 T细胞表型分析 断颈处死小鼠, 然后取小鼠脾脏,制成单个脾细胞悬液。并经NH4Cl-Tris 去除红细胞, RPMI 1640洗2次, 计数并配成1×107ml-1, 取0.1 ml(含1×106个细胞)加入Eppendorff管中, 加FITC-抗LY2和PE-抗 L3T4 50μl, 在4℃,30min进行双荧光染色, 然后用1%NaN3-5%NCS-Hank's液洗2～3次,重悬于1 ml 保存液中再过尼龙膜去除细胞团, 作流式细胞分析(FACS)。
, 百拇医药 1.2.7 统计学处理 采用t检验。
2 结果
Balb/c小鼠连续腹腔注射PAA 7d, 各剂量用药组小鼠脾细胞对SRBC的IgM PFC数较正常未用药鼠增强, 且以50 mg/(kg.d)剂量下最为显著 ,故以后实验PAA用药剂量均定为50 mg/(kg.d)。BMT小鼠从移植后第2天开始给药: 1组腹腔注射生理盐水50 μl/(kg.d), 2组注射PAA 50 ml/(kg.d), 3组注射IL-2 5×104 U/(kg.d),以文献报道IL-2促进造血重建的剂量为参考, 选择5×104 U/(kg.d)为IL-2单独或与PAA联合用药的剂量), 4 组注射PAA 50 μl/(kg.d)+IL-2 5×104 U/(kg.d), 连续用药7 d。BMT后30 d测定免疫功能。
, 百拇医药
2.1 PAA及IL-2促进BMT小鼠脾细胞对ConA、LPS增殖反应的恢复 BMT后30 d, 受体小鼠脾细胞对ConA反应开始恢复, 但十分低下, 自然恢复仅为正常的1/10, 注射PAA组及IL-2组脾细胞经ConA刺激明显增殖, 较自然恢复组有显著差异(表1， P<0.01)。而PAA与IL-2联合用药组对ConA增殖反应更强, 相当于自然恢复对照的5～6倍。脾细胞对LPS的增殖反应在BMT后30 d恢复较快, 但还是明显低于正常。PAA和IL-2用药组均能促进脾细胞对LPS反应的恢复, 与对照相比有显著差异(P<0.01)。而PAA与IL-2联合用药组脾细胞对 LPS的增殖反应表现出协同作用,其反应能力较单独用PAA或IL-2组明显增强(P<0.01 )。
表1 BMT后30 d、PAA、IL-2单独及联合对骨髓移植小鼠脾细胞受ConA、LPS刺激的增殖反应的影响
Tab.1 The effect of PAA,IL-2 alone or in combination,on the proliferation response in splencytes of BMT mice to ConA and LPS at 30th day after BMT Group
, 百拇医药
n
Incorporation of 3H-Thymidine(cpm，
±s)
ConA LPS
Normal
5
32 032±2 952
12 264±2 240
BMT
6
3 628±593
, 百拇医药
6 508±598
PAA
6
8 085±4262)
8 135±8181)
IL-2
6
8 762±3352)
8 409±3182)
PAA+IL-2
6
, 百拇医药
12 241±1 7322)
12 680±1 2562)
Note：1)P<0.05，2)P<0.01 when compared with BMT mice表2 BMT后30 d、PAA、IL-2单独及联合对小鼠脾细胞PFC数的影响
Tab.2 The effect of PAA,IL-2 alone or in combination ,on PFC number in the spleen of BMT mice at 30th day after BMT Group
n
IgM PFC/spleen(±s)
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Normal
12
172 250±33 800
BMT
9
86 250±9 073
PAA
9
138 750±10 8941)
IL-2
9
133 750±9 3441)
, http://www.100md.com
PAA+IL-2
9
165 000±91 7962)
Note：1)P<0.05,2)P<0.01 when compared with BMT mice
图1 PAA、IL-2单独及联合对骨髓移植小鼠脾细胞MLR的影响
Fig.1 The effect of PAA,IL-2 alone or in combination on the MLR of splencytes of BMT mice
Note：1)P<0.01,compared with BMT mice
, 百拇医药
图2 PAA、IL-2单独及联合对骨髓移植小鼠脾细胞DTH的影响
Fig.2 The effect of PAA,IL-2 alone or in combination on the DTH of splencytes of BMT mice
Note：1)P<0.05，2)P<0.01 when compared with BMT mice
表3 BMT后30 d骨髓移植小鼠脾脏的T细胞亚类
Tab.3 The subsets of T cells in splenocytes of BMT mice at day 30 post BMT Group
Percentage of T cell subsets(±s)
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CD4+/CD8+
CD4-CD8+
CD4+CD8+
CD4-CD8-
CD4+CD8-
Normal mice
12.55±9.61
2.28±2.11
51.93±18.75
, 百拇医药
33.24±12.57
2.65
BMT mice
N.S
32.43±13.28
2.46±1.97
53.26±21.37
11.85±6.24
0.37
PAA
29.95±11.59
3.18±1.76
, 百拇医药
57.01±1.14
28.86±4.37
0.95
IL-2
23.66±14.62
2.13±1.26
47.63±22.62
26.58±14.46
1.12
PAA+IL-2
17.37±10.68
1.86±1.46
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50.82±16.13
29.95±12.38
1.72
2.2 PAA及IL-2促进BMT小鼠脾细胞对SRBC反应的抗体形成(PFC)反应 SRBC是T 细胞依赖性抗原, 其PFC反应需要Mφ、T、B 淋巴细胞共同参与。BMT后30 d, 小鼠脾细胞对SRBC反应的IgM PFC数很少, 只及正常鼠的20% (表2), PAA用药组和IL-2用药组PFC数均明显高于BMT对照组(P<0.05), 而PAA+IL-2组PFC数则不仅明显高于对照(P<0.01), 而且也明显高于两个单独用药组。
2.3 PAA及IL-2促进BMT小鼠脾细胞对异型抗原的MLR恢复 BMT后30 d, Balb/c小鼠对异型(C57)小鼠脾细胞的MLR恢复很慢, 自然恢复对照组脾细胞的MLR只相当正常的34%。PAA及IL-2用药组脾细胞的MLR均较对照组明显增强(P<0.01), 两者联合用药亦表现出相加的协同效应, MLR反应强度不仅明显高于BMT对照(P<0.01), 还高于PAA或IL-2单独用药组(图1)。
, 百拇医药
2.4 PAA及IL-2促进BMT小鼠对异型抗原的迟发变态反应 BMT后受体小鼠细胞免疫功能恢复较晚, 在BMT后30 d, 自然恢复对照组小鼠的足垫肿胀程度只达到正常Balb/c小鼠的1/10。PAA及IL-2用药组小鼠DTH反应强度较对照明显增强(P<0.05); 而PAA与IL-2共同作用, BMT小鼠对异型脾细胞的DTH强度不仅明显高于BMT对照(P<0.01), 而且高于PAA及IL-2单独用药组, 出现协同作用(图2)。
2.5 PAA及IL-2促进BMT小鼠脾细胞IL-2的产生 BMT后30 d, 受体小鼠脾细胞产生IL-2水平很低, PAA及IL-2用药组脾细胞产生IL-2较自然恢复对照组显著增加(P<0.01, P<0.05 ), PAA与IL-2合用组IL-2产生也较对照组明显增加(P<0.01 ), 并且高于单独用药组。
2.6 PAA及IL-2减弱BMT小鼠脾细胞对正常小鼠脾细胞功能的抑制作用 BMT后小鼠脾细胞与正常脾细胞共育后, 正常脾细胞对ConA 刺激后的增殖反应明显减弱(P<0.05)。提示BMT小鼠脾细胞中抑制细胞活性增强。 BMT后PAA用药组和IL-2用药组脾细胞与正常Balb/c脾细胞共育后, 对ConA 反应与BMT对照相比明显增强(P<0.05)。PAA与IL-2联合用药组对ConA的反应也较对照明显增强, 接近正常Balb/c小鼠水平。
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2.7 PAA及IL-2对BMT小鼠脾脏中T细胞亚类的影响 正常小鼠脾脏中CD4+/CD8+比值是1.5～2.0。在BMT后, 小鼠外周血CD4+T细胞数和CD8+T细胞数的比例发生变化, 导致CD4+/CD8+比例倒置, 在BMT后第30天,移植对照组小鼠CD4+/CD8+比值是0.37, PAA体内用药组小鼠的CD4+/CD8+比值略有增加达0.66, 而IL-2组及PAA+IL-2组小鼠CD4+/CD8+比值的恢复明显加快, 达1.12和1. 72。 说明PAA、IL-2单独或联合应用都可程度不同地加速BMT小鼠外周T 细胞亚类比例明显恢复(表3)。
3 讨论
BMT后免疫功能的恢复是一个重要的研究领域。 长期以来, 由于BMT 后免疫功能重建不全, 自然恢复过程十分缓慢, 患者因极易受到各种感染而导致移植失败[7,8] 。所以, 早期恢复免疫功能就成了临床骨髓移植治疗中一个亟待解决的问题。BMT后免疫功能缺损的原因, 与BMT后骨髓和胸腺微环境严重受损,T细胞发育、成熟障碍, 抑制功能亢进及IL-2严重缺乏等因素密切相关。
, 百拇医药
PAA是甲型链球菌代谢产物, 临床应用于抗肿瘤辅助治疗, 也用于再生障碍性贫血、 白细胞减少症和感染性疾病的治疗。文献报道, PAA不仅能促进骨髓干细胞分化、发育, 刺激外周血白细胞数量增加, 而且还能促进胸腺细胞的核酸、 蛋白质及多糖类物质的合成代谢, 提示 PAA对胸腺淋巴细胞的分化、 发育和增殖有直接的促进作用[9,10]。
本实验结果证明, PAA及IL-2能从许多途径促进BMT后免疫功能的重建: ①能直接增强免疫应答, 促进抗体生成。 ②促进T 辅助细胞分化、 成熟, 包括数量的增多和功能恢复。③抑制Ts细胞活性, 拮抗Ts对Th的抑制作用。④从而使IL-2生成增加。 PAA+IL-2不仅能促进BMT小鼠如上免疫功能重建, 而且其作用明显强于PAA及IL-2单独用药组, PAA+IL-2促进BMT后小鼠脾细胞IL-2的生成, 并增强脾细胞对IL-2的反应性;明显抑制BMT后脾细胞中抑制细胞活性, 且作用强于PAA及IL-2单独用药组。 提示PAA+IL-2在促进BMT小鼠免疫功能重建上, 表现出一定的协同效应。 推测PAA与IL-2配伍, 应用于BMT后免疫重建, 会有广泛前景。
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作者简介：陈冬志，男，36岁，硕士,副教授，从事移植免疫及免疫药理学研究；
谢蜀生，男, 54岁, 博士生导师，从事移植免疫及免疫调节等研究
4 参考文献
1 谢蜀生，龙振洲，杨 骏. 异基因BMT小鼠免疫缺损机制的探讨.中国免疫学杂志, 1990；6(3):142
2 谢蜀生，Erwin D. T细胞特异的免疫毒素应用于小鼠异基因骨髓移植预防 GVHD. 中华微生物和免疫学杂志, 1988; 8(8):1
3 Cunningham A,Shifferly G et al. Further improvenment in plaque technique for detecting antibody forming cell.Immnunology， 1968;14:496
, 百拇医药
4 张和君. 单克隆抗体及细胞免疫实验技术. 云南：云南科技出版 社， 1986； 115-116
5 秦凤华,谢蜀生，叶建平.白花蛇舌草对小鼠免疫功能的增强作用.上海免疫学杂志， 1990；10(6):321
6 Mishell R I,Gerber A,Dixon F L et al. Prevention of the invitro myelos- uppressive effect of glucocorticos teroids by Interlukine -2. J Immunol, 1982;128:1614
7 Leshem B ,Cochrance C G,Peter K et al. Bone-marrow transplantation with T-cell -depleted grafts. Transplantation， 1987；43: 814
, 百拇医药
8 Noel D R ,Reinhold I L,Brieve F et al . Does graft-versus-host disease influence the temte of immunological recovery after allogeneic human marrow transplantation ? An observation on 56 long-term surviors. Blood， 1978；51:1087
9 胡其乐. 一种具有免疫调节作用的抗肿瘤新药Bestatin . 国外医药*抗生素分册， 1990;11(3):222
10 曾详元，张 莹. 多抗甲素对骨髓造血干细胞影响的实验研究. 中华血液学杂志， 1987;8(9):53
收稿1998-10-29 修回1999-01-20, 百拇医药
单位：陈冬志 河北省职工医学院，保定 071000；谢蜀生 龙振洲 北京医科大学免疫系 北京 100083；姚爱敏 保定市妇幼保健院，保定 071000；杨福祥 保定市急救中心，保定 071000
关键词：多抗甲素；骨髓移植；免疫重建
中国免疫学杂志991104 中国图书分类号 R967 R392.4
摘 要 目的：为了探讨多抗甲素PAA与IL-2对骨髓移植(BMT)小鼠免疫功能重建的影响。 方法：用致死量照射的Balb/c小鼠移植同系小鼠骨髓细胞后, 分别给予PAA、IL-2或PAA+IL-2, 30 d后检查3组BMT小鼠免疫功能重建的情况。 结果：BMT后30 d,自然恢复小鼠免疫功能十分低下,但PAA及IL-2用药鼠脾细胞对丝裂原反应, 对SRBC特异的PFC数, 对同种异型小鼠脾细胞 DTH及MLR均明显高于移植对照组, 同时IL-2的产生能力也明显增强, 而PAA+IL-2组作用又明显强于PAA及IL-2单独用药组。结论：PAA及IL-2均能单独从多方面促进BMT后免疫功能重建,PAA+IL-2 则从多方面表现出一定的协同效应。
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The combination of PAA plus IL-2 enhanced immunoconstitution of the lethally irradiated mice following syngeneic bone marrow transplantation
CHEN Dong-Zhi,YAO Ai-Min,YANG Fu-Xiang et al.Hebei Medical College for Continuing Education, Baoding 071000
Abstract Objective：To explore the effect of PAA and IL-2 enhanced immunoconstitution of the lethally irradiated mice following syngeneic bone marrow transplantation. Methods： The lethally irradiated Balb/c mice were engrafted with syngeneic bone marrow cells, then were injected with PAA or IL-2 or PAA+IL-2, for 7 days. On the thirtieth day after BMT, The authors detected the immunological function of BMT mice. Results： On the thirtieth day after BMT, the immunological functions of the BMT mice were seriously deficient, but the recovery of the immunologic functions such as proliferation of splenocytes to ConA and mixed lymphocyte reaction to allogeneic cell, the DTH responsibility to C57BL/C cells, anti-SRBC PFC and the production of IL-2 by the splenocytes in the mice that treated single with PAA or IL-2 post BMT were markedly enhanced than that of BMT mice, and the recovery of immunologic functions were markedly accelerated in the BMT mice treated with PAA plus IL-2, when compared with that of the BMT mice injected with PAA or IL-2 alone. Conclusion： PAA and IL-2 can markedly enhanced immunoconstitution of BMT mice when be used alone,furthermore, while the two drugs were applied simutaneously , the coordinate role will be shown.
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Key words Poly actin A (PAA) Bone marrow transplantation (BMT) Immunoconstitution
骨髓移植后免疫功能的自然恢复是一个相当缓慢而复杂的过程。由于骨髓和胸腺微环境的损伤, GVHD的影响, 加上重建早期T抑制细胞功能亢进, 使BMT后患者免疫机能长期缺损,特别是T细胞功能缺损, 患者常因严重感染而死亡。因此促进BMT后免疫功能的重建是一个重要的研究课题。
近年来随着重组细胞因子及一些药物的出现,为研究BMT后免疫功能重建开辟了新的领域, 并已展示出广阔的应用前景。已有报道IL-2能明显促进BMT后免疫功能的恢复。多抗甲素(PAA)是一种很有效的造血刺激剂, 具有明显的免疫增强作用和促进骨髓造血的功能。本文通过体内实验报道了PAA与IL-2单独及协同对BMT小鼠免疫重建的促进作用, 并对其作用机理进行了初步探讨。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 Balb/c (H-2d), C57BL/6 (H-2b) 纯系小鼠, 10～14 周龄,雌雄皆有，北京医科大学动物部提供。
1.1.2 试剂及细胞株 刀豆蛋白A (ConA),细菌脂多糖(LPS), 丝裂霉素C 为Sigma公司产品。3H-TdR，中国科学院原子能研究所产品；Ly2-FITC，L3T4-PE，BD 公司产品；rhIL-2，北医免疫系马大龙教授提供。多抗甲素(PAA)系北京第三制药厂生产的10 ml×10 mg 口服液。
1.2 方法
1.2.1 PAA剂量试验 Balb/c小鼠20只, 随机分成4组, 腹腔注射PAA剂量分别为: 1 组12.5 mg/(kg.d), 2组25.0 mg/(kg.d), 3组50.0 mg/(kg.d), 4组100.0 mg/(kg.d)。 连续用药7 d, 同时另设正常对照组, 用生理盐水代药, 处理同上。第8 天小鼠断颈处死, 取脾细胞制悬液, 测定PFC/脾值。
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1.2.2 骨髓移植 Balb/c小鼠脱颈处死后, 无菌取股骨和胫骨, 用RPMI 1640冲洗骨髓腔,过4号针头制成单个骨髓细胞悬液。 另取Balb/c小鼠40只,经60Co源750 Rad照射( 剂量率约90 Rad/min)后, 4 h内经尾静脉输入2×107个供体骨髓细胞,然后分组将小鼠置无菌饲养笼内饲养[1]。从第2天开始给药, 连续7 d, 至BMT 后30 d测定免疫功能,密切观察动物的状态。
1.2.3 细胞对丝裂原的增殖反应 取经照射的Balb/c小鼠进行随机分组, 第1组为BMT后生理盐水对照, 第2组为BMT后应用PAA实验组。 第3组为BMT后应用IL-2实验组, 第4组为BMT后应用PAA+IL-2实验组。 于BMT后30 d测定小鼠脾细胞对ConA、LPS的增殖反应,具体方法详见文献[2]。
1.2.4 溶血空斑实验(PFC) 分组同第4组, 方法为Cunningham小室法[3]；混合淋巴细胞反应(MLR)，分组同第4组, 方法见文献[4]；对异型小鼠脾细胞的迟发型超敏反应(DTH)，分组同第4组, 方法见文献[5]；白细胞介素2(IL-2)诱生，分组同第4组, 方法见文献[6]。
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1.2.5 共同培养实验 处死骨髓移植小鼠无菌取脾制备单个细胞悬液, 用10%RPMI 1640液配成 2.5×106 ml或5.0×106 ml于正常Balb/c小鼠脾细胞悬液混合培养。检测对ConA 增殖反应及IL-2的产生。
1.2.6 T细胞表型分析 断颈处死小鼠, 然后取小鼠脾脏,制成单个脾细胞悬液。并经NH4Cl-Tris 去除红细胞, RPMI 1640洗2次, 计数并配成1×107ml-1, 取0.1 ml(含1×106个细胞)加入Eppendorff管中, 加FITC-抗LY2和PE-抗 L3T4 50μl, 在4℃,30min进行双荧光染色, 然后用1%NaN3-5%NCS-Hank's液洗2～3次,重悬于1 ml 保存液中再过尼龙膜去除细胞团, 作流式细胞分析(FACS)。
, 百拇医药 1.2.7 统计学处理 采用t检验。
2 结果
Balb/c小鼠连续腹腔注射PAA 7d, 各剂量用药组小鼠脾细胞对SRBC的IgM PFC数较正常未用药鼠增强, 且以50 mg/(kg.d)剂量下最为显著 ,故以后实验PAA用药剂量均定为50 mg/(kg.d)。BMT小鼠从移植后第2天开始给药: 1组腹腔注射生理盐水50 μl/(kg.d), 2组注射PAA 50 ml/(kg.d), 3组注射IL-2 5×104 U/(kg.d),以文献报道IL-2促进造血重建的剂量为参考, 选择5×104 U/(kg.d)为IL-2单独或与PAA联合用药的剂量), 4 组注射PAA 50 μl/(kg.d)+IL-2 5×104 U/(kg.d), 连续用药7 d。BMT后30 d测定免疫功能。
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2.1 PAA及IL-2促进BMT小鼠脾细胞对ConA、LPS增殖反应的恢复 BMT后30 d, 受体小鼠脾细胞对ConA反应开始恢复, 但十分低下, 自然恢复仅为正常的1/10, 注射PAA组及IL-2组脾细胞经ConA刺激明显增殖, 较自然恢复组有显著差异(表1， P<0.01)。而PAA与IL-2联合用药组对ConA增殖反应更强, 相当于自然恢复对照的5～6倍。脾细胞对LPS的增殖反应在BMT后30 d恢复较快, 但还是明显低于正常。PAA和IL-2用药组均能促进脾细胞对LPS反应的恢复, 与对照相比有显著差异(P<0.01)。而PAA与IL-2联合用药组脾细胞对 LPS的增殖反应表现出协同作用,其反应能力较单独用PAA或IL-2组明显增强(P<0.01 )。
表1 BMT后30 d、PAA、IL-2单独及联合对骨髓移植小鼠脾细胞受ConA、LPS刺激的增殖反应的影响
Tab.1 The effect of PAA,IL-2 alone or in combination,on the proliferation response in splencytes of BMT mice to ConA and LPS at 30th day after BMT Group
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n
Incorporation of 3H-Thymidine(cpm，
±s)ConA LPS
Normal
5
32 032±2 952
12 264±2 240
BMT
6
3 628±593
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6 508±598
PAA
6
8 085±4262)
8 135±8181)
IL-2
6
8 762±3352)
8 409±3182)
PAA+IL-2
6
, 百拇医药
12 241±1 7322)
12 680±1 2562)
Note：1)P<0.05，2)P<0.01 when compared with BMT mice表2 BMT后30 d、PAA、IL-2单独及联合对小鼠脾细胞PFC数的影响
Tab.2 The effect of PAA,IL-2 alone or in combination ,on PFC number in the spleen of BMT mice at 30th day after BMT Group
n
IgM PFC/spleen(
±s), http://www.100md.com
Normal
12
172 250±33 800
BMT
9
86 250±9 073
PAA
9
138 750±10 8941)
IL-2
9
133 750±9 3441)
, http://www.100md.com
PAA+IL-2
9
165 000±91 7962)
Note：1)P<0.05,2)P<0.01 when compared with BMT mice
图1 PAA、IL-2单独及联合对骨髓移植小鼠脾细胞MLR的影响
Fig.1 The effect of PAA,IL-2 alone or in combination on the MLR of splencytes of BMT mice
Note：1)P<0.01,compared with BMT mice
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图2 PAA、IL-2单独及联合对骨髓移植小鼠脾细胞DTH的影响
Fig.2 The effect of PAA,IL-2 alone or in combination on the DTH of splencytes of BMT mice
Note：1)P<0.05，2)P<0.01 when compared with BMT mice
表3 BMT后30 d骨髓移植小鼠脾脏的T细胞亚类
Tab.3 The subsets of T cells in splenocytes of BMT mice at day 30 post BMT Group
Percentage of T cell subsets(
±s), http://www.100md.com
CD4+/CD8+
CD4-CD8+
CD4+CD8+
CD4-CD8-
CD4+CD8-
Normal mice
12.55±9.61
2.28±2.11
51.93±18.75
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33.24±12.57
2.65
BMT mice
N.S
32.43±13.28
2.46±1.97
53.26±21.37
11.85±6.24
0.37
PAA
29.95±11.59
3.18±1.76
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57.01±1.14
28.86±4.37
0.95
IL-2
23.66±14.62
2.13±1.26
47.63±22.62
26.58±14.46
1.12
PAA+IL-2
17.37±10.68
1.86±1.46
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50.82±16.13
29.95±12.38
1.72
2.2 PAA及IL-2促进BMT小鼠脾细胞对SRBC反应的抗体形成(PFC)反应 SRBC是T 细胞依赖性抗原, 其PFC反应需要Mφ、T、B 淋巴细胞共同参与。BMT后30 d, 小鼠脾细胞对SRBC反应的IgM PFC数很少, 只及正常鼠的20% (表2), PAA用药组和IL-2用药组PFC数均明显高于BMT对照组(P<0.05), 而PAA+IL-2组PFC数则不仅明显高于对照(P<0.01), 而且也明显高于两个单独用药组。
2.3 PAA及IL-2促进BMT小鼠脾细胞对异型抗原的MLR恢复 BMT后30 d, Balb/c小鼠对异型(C57)小鼠脾细胞的MLR恢复很慢, 自然恢复对照组脾细胞的MLR只相当正常的34%。PAA及IL-2用药组脾细胞的MLR均较对照组明显增强(P<0.01), 两者联合用药亦表现出相加的协同效应, MLR反应强度不仅明显高于BMT对照(P<0.01), 还高于PAA或IL-2单独用药组(图1)。
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2.4 PAA及IL-2促进BMT小鼠对异型抗原的迟发变态反应 BMT后受体小鼠细胞免疫功能恢复较晚, 在BMT后30 d, 自然恢复对照组小鼠的足垫肿胀程度只达到正常Balb/c小鼠的1/10。PAA及IL-2用药组小鼠DTH反应强度较对照明显增强(P<0.05); 而PAA与IL-2共同作用, BMT小鼠对异型脾细胞的DTH强度不仅明显高于BMT对照(P<0.01), 而且高于PAA及IL-2单独用药组, 出现协同作用(图2)。
2.5 PAA及IL-2促进BMT小鼠脾细胞IL-2的产生 BMT后30 d, 受体小鼠脾细胞产生IL-2水平很低, PAA及IL-2用药组脾细胞产生IL-2较自然恢复对照组显著增加(P<0.01, P<0.05 ), PAA与IL-2合用组IL-2产生也较对照组明显增加(P<0.01 ), 并且高于单独用药组。
2.6 PAA及IL-2减弱BMT小鼠脾细胞对正常小鼠脾细胞功能的抑制作用 BMT后小鼠脾细胞与正常脾细胞共育后, 正常脾细胞对ConA 刺激后的增殖反应明显减弱(P<0.05)。提示BMT小鼠脾细胞中抑制细胞活性增强。 BMT后PAA用药组和IL-2用药组脾细胞与正常Balb/c脾细胞共育后, 对ConA 反应与BMT对照相比明显增强(P<0.05)。PAA与IL-2联合用药组对ConA的反应也较对照明显增强, 接近正常Balb/c小鼠水平。
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2.7 PAA及IL-2对BMT小鼠脾脏中T细胞亚类的影响 正常小鼠脾脏中CD4+/CD8+比值是1.5～2.0。在BMT后, 小鼠外周血CD4+T细胞数和CD8+T细胞数的比例发生变化, 导致CD4+/CD8+比例倒置, 在BMT后第30天,移植对照组小鼠CD4+/CD8+比值是0.37, PAA体内用药组小鼠的CD4+/CD8+比值略有增加达0.66, 而IL-2组及PAA+IL-2组小鼠CD4+/CD8+比值的恢复明显加快, 达1.12和1. 72。 说明PAA、IL-2单独或联合应用都可程度不同地加速BMT小鼠外周T 细胞亚类比例明显恢复(表3)。
3 讨论
BMT后免疫功能的恢复是一个重要的研究领域。 长期以来, 由于BMT 后免疫功能重建不全, 自然恢复过程十分缓慢, 患者因极易受到各种感染而导致移植失败[7,8] 。所以, 早期恢复免疫功能就成了临床骨髓移植治疗中一个亟待解决的问题。BMT后免疫功能缺损的原因, 与BMT后骨髓和胸腺微环境严重受损,T细胞发育、成熟障碍, 抑制功能亢进及IL-2严重缺乏等因素密切相关。
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PAA是甲型链球菌代谢产物, 临床应用于抗肿瘤辅助治疗, 也用于再生障碍性贫血、 白细胞减少症和感染性疾病的治疗。文献报道, PAA不仅能促进骨髓干细胞分化、发育, 刺激外周血白细胞数量增加, 而且还能促进胸腺细胞的核酸、 蛋白质及多糖类物质的合成代谢, 提示 PAA对胸腺淋巴细胞的分化、 发育和增殖有直接的促进作用[9,10]。
本实验结果证明, PAA及IL-2能从许多途径促进BMT后免疫功能的重建: ①能直接增强免疫应答, 促进抗体生成。 ②促进T 辅助细胞分化、 成熟, 包括数量的增多和功能恢复。③抑制Ts细胞活性, 拮抗Ts对Th的抑制作用。④从而使IL-2生成增加。 PAA+IL-2不仅能促进BMT小鼠如上免疫功能重建, 而且其作用明显强于PAA及IL-2单独用药组, PAA+IL-2促进BMT后小鼠脾细胞IL-2的生成, 并增强脾细胞对IL-2的反应性;明显抑制BMT后脾细胞中抑制细胞活性, 且作用强于PAA及IL-2单独用药组。 提示PAA+IL-2在促进BMT小鼠免疫功能重建上, 表现出一定的协同效应。 推测PAA与IL-2配伍, 应用于BMT后免疫重建, 会有广泛前景。
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作者简介：陈冬志，男，36岁，硕士,副教授，从事移植免疫及免疫药理学研究；
谢蜀生，男, 54岁, 博士生导师，从事移植免疫及免疫调节等研究
4 参考文献
1 谢蜀生，龙振洲，杨 骏. 异基因BMT小鼠免疫缺损机制的探讨.中国免疫学杂志, 1990；6(3):142
2 谢蜀生，Erwin D. T细胞特异的免疫毒素应用于小鼠异基因骨髓移植预防 GVHD. 中华微生物和免疫学杂志, 1988; 8(8):1
3 Cunningham A,Shifferly G et al. Further improvenment in plaque technique for detecting antibody forming cell.Immnunology， 1968;14:496
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4 张和君. 单克隆抗体及细胞免疫实验技术. 云南：云南科技出版 社， 1986； 115-116
5 秦凤华,谢蜀生，叶建平.白花蛇舌草对小鼠免疫功能的增强作用.上海免疫学杂志， 1990；10(6):321
6 Mishell R I,Gerber A,Dixon F L et al. Prevention of the invitro myelos- uppressive effect of glucocorticos teroids by Interlukine -2. J Immunol, 1982;128:1614
7 Leshem B ,Cochrance C G,Peter K et al. Bone-marrow transplantation with T-cell -depleted grafts. Transplantation， 1987；43: 814
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8 Noel D R ,Reinhold I L,Brieve F et al . Does graft-versus-host disease influence the temte of immunological recovery after allogeneic human marrow transplantation ? An observation on 56 long-term surviors. Blood， 1978；51:1087
9 胡其乐. 一种具有免疫调节作用的抗肿瘤新药Bestatin . 国外医药*抗生素分册， 1990;11(3):222
10 曾详元，张 莹. 多抗甲素对骨髓造血干细胞影响的实验研究. 中华血液学杂志， 1987;8(9):53
收稿1998-10-29 修回1999-01-20, 百拇医药