酸性同功铁蛋白单克隆抗体免疫学特性的研究
作者：游上游① 张楚瑜 黄巍② 易先平②
单位：武汉大学生命科学院，武汉 430072
关键词：酸性同功铁蛋白；单克隆抗体；免疫组织化学
中国免疫学杂志991203 摘 要 目的：探讨抗不同组织酸性同功铁蛋白(AIF)单克隆抗体(McAb)的免疫学特性。方法：应用聚焦层析技术分别从人胎盘和原发性肝癌组织中分离出低pI值的AIF，常规制备McAb和进行免疫组织化学测定。结果：共筛选到5株抗人胎盘AIF和2株抗人原发性肝癌(PHC)AIF的McAb，即2f8、4g7、4g8、5c3、7a9和4c9、4e2。抗AIF McAbs均与各自AIF分子上不同抗原决定簇结合，其中针对不同组织AIF的McAb 5c3和4e2作用于同一抗原决定簇。使用McAb 2f8和4c9，对正常肝组织、慢性肝炎与肝硬化和PHC肝组织进行了免疫组织化学检查，其阳性率分别为2f8：0、10.0%、76.3%；4c9：0、6.7%、81.6%。结论：人胎盘和PHC组织AIF中存在着共同的抗原决定簇，抗PHC AIF McAb在免疫诊断中优于抗人胎盘AIF McAb。
, http://www.100md.com
中国图书分类号 R392.11
Study on immunological characteristics of anti-AIF McAbs
YOU Shang-You, ZHANG Chu-Yu, HUANG Wei et al.
Life Science College,Wuhan University,Wuhan 430072
Abstract Objective:Study on immunological characteristics of McAbs against human acidic isoferritin (AIF) from different tissues. Methods:Preparation of AIF with low pI value by chromatofocusing technique and McAb using hybridoma technique.Results: Seven hybridoma cell lines secreting specific monoclonal antibody(McAb),that is,five against human placental AIF(2f8,4g7,4g8,5c3,7a9)and two against primary hepatic carcinoma(PHC)AIF(4c9,4e2),were raised.Seven McAbs recognized different antigen epitopes of AIF from different tissues,but McAb 5c3 and 4e2 recognized the same antigen epitope of AIF. LSAB immunohistochemical study using McAb 2f8 and 4c9 shown that positive staining rates of liver tissue with normal, chronic hepatitis and cirrhosis, and PHC were 0,10.0%,76.3% and 0,6.7%,81.6% respectively. Conclusion:There is the same antigenic determanent between PHC AIF and placental AIF , and anti-PHC AIF McAb is better than anti-placental AIF McAb in immunodiagnosis of PHC.
, 百拇医药
Key words Acidic isoferritin Monoclonal antibody Immunohistochemistry
目前，一般认为酸性铁蛋白(Acidic ferritin,AF)是一种肿瘤相关抗原，证据之一是排除了铁负荷过多后，许多肿瘤患者血清铁蛋白浓度升高，而组织铁储量并未增加[1] ；证据之二是在移植有人肿瘤的裸鼠血清中检测到铁蛋白，而将肿瘤摘除后，血清中的铁蛋白亦消失，说明肿瘤细胞分泌胞外铁蛋白[2] 。AF可从人胎盘、心脏或恶性肿瘤等组织中制备、纯化。本文是在纯化了不同组织AF基础上，进一步分离出AF中更具癌胚性质的低等电点(pI)部分，称为酸性同功铁蛋白(Acidic isoferritin， AIF)，并以此为抗原，制备了特异性抗AIF单克隆抗体(McAb)，旨在研究这些McAb的免疫学特性，为抗AIF McAbs应用于临床提供依据。
1 材料与方法
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1.1 材料 多缓冲交换剂94、多缓冲液74、Sephadex G-200、聚焦电泳凝胶及pI标准购自Pharmacia公司；McAb制备成套试剂及各参考铁蛋白购自Sigma公司；酶标兔抗鼠Ig抗血清和免疫组织化学LSAB试剂盒购自Dako公司，McAb Ig亚类试剂盒购自宝灵曼公司，其余均为国产分析纯试剂。10例正常、30例慢性肝炎、肝硬化和38例PHC肝组织标本由武汉市第二医院及湖北省肿瘤医院病理科提供。
1.2 方法
1.2.1 人胎盘和PHC组织AIF的制备 组织匀浆加热至72℃，维持3～5 min，离心取上清，用醋酸溶液将上清液pH调至4.6，上清液经50%硫酸铵沉淀，过Sephadex G-200柱，收集纯化的AF,上样于多缓冲交换剂94柱，使用8～10倍床体积的多缓冲液74洗脱，对洗脱液同时进行紫外和pH值的监测。
1.2.2 AIF的鉴定 样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳后,对凝胶用0.2%亚铁氰化钾和0.1%考马斯亮兰分别进行铁和蛋白质染色，使用分析型聚焦电泳测定样品的pI值。
, 百拇医药
1.2.3 McAb制备 按常规方法进行Balb/c鼠的免疫、细胞融合、杂交瘤细胞筛选、阳性细胞株的克隆化以及腹水抗体的制备与纯化。
1.2.4 抗AIF McAb的鉴定 McAb特异性鉴定： 以AIF及各参考抗原作为包被抗原，包被浓度为5 μg/ml，酶标兔抗鼠Ig抗血清为第2抗体，使用间接ELISA法测定。参考抗原有碱性同功铁蛋白(BIF)、马脾铁蛋白、大鼠肝铁蛋白、人肝铁蛋白和人白蛋白。McAb Ig亚类测定：采用夹心ELISA法，按照试剂盒说明书进行操作。腹水抗体效价测定：采用间接ELISA法。AIF包被浓度为5 μg/ml，以测定孔A450 值>对照孔2倍的最大稀释度表示。McAbs表位特性的测定：采用抗体竞争抑制性结合ELISA法，测定McAb间的相互抑制率。
1.2.5 免疫组织化学染色 使用LSAB法，同时设置相关的阴性对照。
2 结果
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2.1 AIF的分离、纯化 铁蛋白粗提物经Sephadex G-200柱纯化，聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示2个洗脱峰均为单一区带，其中峰1电泳后，铁与蛋白质染色均为阳性，峰1为AF。AF经聚焦层析分离，洗脱液pH由6.2递减至4.0。我们将洗脱液pH≥5.2和≤4.7的部分分别称为BIF和AIF。用聚焦电泳分析BIF和AIF，图1显示BIF各区带分布在5.8～6.3之间，而AIF则分布在5.2～5.8之间。
2.2 抗AIF McAb细胞株的建立 经过数次细胞融合及克隆化，共筛选出 5 株抗人胎盘AIF McAb
(2f8、4g7、4g8、5c3、7a9)和2株抗PHC AIF McAb(4c9、4e2)。这些细胞株在体外连续培养4个月以上均能稳定分泌特异性McAb。
2.3 抗AIF McAb的免疫学特性
2.3.1 McAb的特异性 使用纯化的AIF及各种参考抗原来检测抗AIF McAb的特异性，结果发现7株McAbs与各对应组织AIF结合的A450 值均>1.20，而与各参考抗原几乎不反应，A450 值≤0.30(检测本底为0.15)。
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2.3.2 McAb亚类与效价 Ig亚类测定结果，7株McAb均属于IgG1型，轻链均为k链。各腹水抗体效价分别为：2f8 1.5×10-6，4g7 1.5×10-6，4g8 3.0×10-6 ，5c3 1.5×10-6,7a9 8.0×10-6,4c9 6.0×10-6,4e2 4.0×10-5。
图1 BIF和AIF的聚焦电泳图谱
Fig.1 BIF and AIF run on 1% Agarose IEF gel containing pharmalyte 4.0～6.0
, 百拇医药
表1 AIF在正常、良性和恶性肝组织中阳性表达结果的比较
Tab.1 Comparison of AIF positive expression among normal,benign and malignant liver tissues Group
n
McAb 2f8
McAb 4c9
Normal
10
0
0
Chronic hepatitis
, 百拇医药
and cirrhosis
30
10.0%
6.7%
Primary hepatic
carcinoma
38
76.3%
81.6%
2.3.3 McAb的表位特异性 7a9、4g8、5c3和2f84株McAb均可完全抑制其自身酶标抗体与胎盘AIF的反应，其抑制程度与所加的未标记抗体浓度呈依赖关系。5株抗人胎盘AIF McAb对HRP标记的非同种抗人胎盘AIF McAb与胎盘AIF的反应均无抑制作用或抑制率很低(<30%)。4e2亦不能抑制HRP标记的McAb 4c9与PHC AIF的结合。在分析2类McAb之间关系时发现，5c3能与PHC AIF发生反应，而4e2能与胎盘AIF进行反应，并且4e2对5c3同AIF的结合反应具有竞争性抑制作用。
, 百拇医药
2.4 免疫组织化学染色 选择McAb 2f8和4c9对共计78例正常肝组织、慢性肝炎与肝硬化及PHC肝组织分别进行了免疫组织化学检查，结果见表1。
3 讨论
70年代以来，研究人员曾通过测定血清碱性铁蛋白辅助诊断某些类型的肿瘤，其敏感性虽好，但假阳性率高[3,4] 。80年代中后期以来，国内外相继报道了抗AF多克隆抗体和单克隆抗体[4-7] 。
我们在纯化AF的基础上，成功地分离出仅同来源于AF的BIF有少量抗原交叉的低pI值AIF。以2种分别来源于恶性及胚胎组织的AIF为抗原，共制备了7株特异性抗AIF McAbs。对这些McAbs进行研究后，发现 2 株抗PHC AIF McAb和5株抗人胎盘AIF McAb分别结合于各自AIF分子上的不同抗原决定簇，同时我们发现PHC和人胎盘组织AIF中存在着共同的抗原决定簇，这为铁蛋白作为肿瘤相关抗原的研究提供了新的思路。应用2f8和4c9 2株McAbs作为一抗，分别对正常和良、恶性肝组织进行了免疫组织化学检测。结果提示，在诊断PHC中，抗PHC AIF McAb的效果要稍好于抗人胎盘AIF McAb。
, 百拇医药
肿瘤相关抗原及其McAb的制备与鉴定是其临床应用的前提和关键。本文结果提示，对于AIF的制备，人胎盘组织仅能部分取代PHC组织。我们制备的抗PHC AIF McAb特异性较好，为该McAbs用于PHC的血清学检测和放射免疫诊断奠定了基础。
①联系地址：武汉市汉口黎黄陂路47号医学科学研究所，武汉430014
②武汉市抗体研究中心，武汉430014
作者简介：游上游，男，39岁，在职博士生，副主任医师，主要从事抗体工程研究；张楚瑜，男，58岁，教授，博士生导师
参考文献
1 Dinari G, Zakan I, Marcus H et al. Placental ferritin in coeliac disease:relation to clinical stage,origin and possible role in the pathogenesis of malignancy. Gut，1991;32(9):999
, http://www.100md.com
2 Hann H W. Human ferritins present in the sera of nude mice transplanted with human HCC.Cancer Res, 1984;44:3898
3 Hann H W, Kim C Y,London W T et al. Increased serum ferritin in chronic liver discase: a risk factor for primary hepatocellular carcinoma.Int J Cancer, 1989;43:376
4 杨秉辉,汤钊猷.消化系统肿瘤的早期诊断.中华消化杂志,1989;9(1):40
5 Moroz C,Lantsltry Z, Sela O et al. Radioimmunodetetion of tumors with monoclonal antiplacental ferritin antibody,primary results.Oncology，1989;46:35
6 游上游,Goodall M.应用特异性单克隆抗体测定血清酸性铁蛋白. 中华医学检验杂志，1994;17(5):284
7 沈 薇. 血清胎盘酸性铁蛋白酶联火箭电泳法对原发性肝癌诊断的价值. 临床肝胆病杂志，1996;12(1):24
收稿1998-08-09 修回1999-02-04, 百拇医药
单位：武汉大学生命科学院，武汉 430072
关键词：酸性同功铁蛋白；单克隆抗体；免疫组织化学
中国免疫学杂志991203 摘 要 目的：探讨抗不同组织酸性同功铁蛋白(AIF)单克隆抗体(McAb)的免疫学特性。方法：应用聚焦层析技术分别从人胎盘和原发性肝癌组织中分离出低pI值的AIF，常规制备McAb和进行免疫组织化学测定。结果：共筛选到5株抗人胎盘AIF和2株抗人原发性肝癌(PHC)AIF的McAb，即2f8、4g7、4g8、5c3、7a9和4c9、4e2。抗AIF McAbs均与各自AIF分子上不同抗原决定簇结合，其中针对不同组织AIF的McAb 5c3和4e2作用于同一抗原决定簇。使用McAb 2f8和4c9，对正常肝组织、慢性肝炎与肝硬化和PHC肝组织进行了免疫组织化学检查，其阳性率分别为2f8：0、10.0%、76.3%；4c9：0、6.7%、81.6%。结论：人胎盘和PHC组织AIF中存在着共同的抗原决定簇，抗PHC AIF McAb在免疫诊断中优于抗人胎盘AIF McAb。
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中国图书分类号 R392.11
Study on immunological characteristics of anti-AIF McAbs
YOU Shang-You, ZHANG Chu-Yu, HUANG Wei et al.
Life Science College,Wuhan University,Wuhan 430072
Abstract Objective:Study on immunological characteristics of McAbs against human acidic isoferritin (AIF) from different tissues. Methods:Preparation of AIF with low pI value by chromatofocusing technique and McAb using hybridoma technique.Results: Seven hybridoma cell lines secreting specific monoclonal antibody(McAb),that is,five against human placental AIF(2f8,4g7,4g8,5c3,7a9)and two against primary hepatic carcinoma(PHC)AIF(4c9,4e2),were raised.Seven McAbs recognized different antigen epitopes of AIF from different tissues,but McAb 5c3 and 4e2 recognized the same antigen epitope of AIF. LSAB immunohistochemical study using McAb 2f8 and 4c9 shown that positive staining rates of liver tissue with normal, chronic hepatitis and cirrhosis, and PHC were 0,10.0%,76.3% and 0,6.7%,81.6% respectively. Conclusion:There is the same antigenic determanent between PHC AIF and placental AIF , and anti-PHC AIF McAb is better than anti-placental AIF McAb in immunodiagnosis of PHC.
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Key words Acidic isoferritin Monoclonal antibody Immunohistochemistry
目前，一般认为酸性铁蛋白(Acidic ferritin,AF)是一种肿瘤相关抗原，证据之一是排除了铁负荷过多后，许多肿瘤患者血清铁蛋白浓度升高，而组织铁储量并未增加[1] ；证据之二是在移植有人肿瘤的裸鼠血清中检测到铁蛋白，而将肿瘤摘除后，血清中的铁蛋白亦消失，说明肿瘤细胞分泌胞外铁蛋白[2] 。AF可从人胎盘、心脏或恶性肿瘤等组织中制备、纯化。本文是在纯化了不同组织AF基础上，进一步分离出AF中更具癌胚性质的低等电点(pI)部分，称为酸性同功铁蛋白(Acidic isoferritin， AIF)，并以此为抗原，制备了特异性抗AIF单克隆抗体(McAb)，旨在研究这些McAb的免疫学特性，为抗AIF McAbs应用于临床提供依据。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 材料 多缓冲交换剂94、多缓冲液74、Sephadex G-200、聚焦电泳凝胶及pI标准购自Pharmacia公司；McAb制备成套试剂及各参考铁蛋白购自Sigma公司；酶标兔抗鼠Ig抗血清和免疫组织化学LSAB试剂盒购自Dako公司，McAb Ig亚类试剂盒购自宝灵曼公司，其余均为国产分析纯试剂。10例正常、30例慢性肝炎、肝硬化和38例PHC肝组织标本由武汉市第二医院及湖北省肿瘤医院病理科提供。
1.2 方法
1.2.1 人胎盘和PHC组织AIF的制备 组织匀浆加热至72℃，维持3～5 min，离心取上清，用醋酸溶液将上清液pH调至4.6，上清液经50%硫酸铵沉淀，过Sephadex G-200柱，收集纯化的AF,上样于多缓冲交换剂94柱，使用8～10倍床体积的多缓冲液74洗脱，对洗脱液同时进行紫外和pH值的监测。
1.2.2 AIF的鉴定 样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳后,对凝胶用0.2%亚铁氰化钾和0.1%考马斯亮兰分别进行铁和蛋白质染色，使用分析型聚焦电泳测定样品的pI值。
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1.2.3 McAb制备 按常规方法进行Balb/c鼠的免疫、细胞融合、杂交瘤细胞筛选、阳性细胞株的克隆化以及腹水抗体的制备与纯化。
1.2.4 抗AIF McAb的鉴定 McAb特异性鉴定： 以AIF及各参考抗原作为包被抗原，包被浓度为5 μg/ml，酶标兔抗鼠Ig抗血清为第2抗体，使用间接ELISA法测定。参考抗原有碱性同功铁蛋白(BIF)、马脾铁蛋白、大鼠肝铁蛋白、人肝铁蛋白和人白蛋白。McAb Ig亚类测定：采用夹心ELISA法，按照试剂盒说明书进行操作。腹水抗体效价测定：采用间接ELISA法。AIF包被浓度为5 μg/ml，以测定孔A450 值>对照孔2倍的最大稀释度表示。McAbs表位特性的测定：采用抗体竞争抑制性结合ELISA法，测定McAb间的相互抑制率。
1.2.5 免疫组织化学染色 使用LSAB法，同时设置相关的阴性对照。
2 结果
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2.1 AIF的分离、纯化 铁蛋白粗提物经Sephadex G-200柱纯化，聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示2个洗脱峰均为单一区带，其中峰1电泳后，铁与蛋白质染色均为阳性，峰1为AF。AF经聚焦层析分离，洗脱液pH由6.2递减至4.0。我们将洗脱液pH≥5.2和≤4.7的部分分别称为BIF和AIF。用聚焦电泳分析BIF和AIF，图1显示BIF各区带分布在5.8～6.3之间，而AIF则分布在5.2～5.8之间。
2.2 抗AIF McAb细胞株的建立 经过数次细胞融合及克隆化，共筛选出 5 株抗人胎盘AIF McAb
(2f8、4g7、4g8、5c3、7a9)和2株抗PHC AIF McAb(4c9、4e2)。这些细胞株在体外连续培养4个月以上均能稳定分泌特异性McAb。
2.3 抗AIF McAb的免疫学特性
2.3.1 McAb的特异性 使用纯化的AIF及各种参考抗原来检测抗AIF McAb的特异性，结果发现7株McAbs与各对应组织AIF结合的A450 值均>1.20，而与各参考抗原几乎不反应，A450 值≤0.30(检测本底为0.15)。
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2.3.2 McAb亚类与效价 Ig亚类测定结果，7株McAb均属于IgG1型，轻链均为k链。各腹水抗体效价分别为：2f8 1.5×10-6，4g7 1.5×10-6，4g8 3.0×10-6 ，5c3 1.5×10-6,7a9 8.0×10-6,4c9 6.0×10-6,4e2 4.0×10-5。
图1 BIF和AIF的聚焦电泳图谱
Fig.1 BIF and AIF run on 1% Agarose IEF gel containing pharmalyte 4.0～6.0
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表1 AIF在正常、良性和恶性肝组织中阳性表达结果的比较
Tab.1 Comparison of AIF positive expression among normal,benign and malignant liver tissues Group
n
McAb 2f8
McAb 4c9
Normal
10
0
0
Chronic hepatitis
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and cirrhosis
30
10.0%
6.7%
Primary hepatic
carcinoma
38
76.3%
81.6%
2.3.3 McAb的表位特异性 7a9、4g8、5c3和2f84株McAb均可完全抑制其自身酶标抗体与胎盘AIF的反应，其抑制程度与所加的未标记抗体浓度呈依赖关系。5株抗人胎盘AIF McAb对HRP标记的非同种抗人胎盘AIF McAb与胎盘AIF的反应均无抑制作用或抑制率很低(<30%)。4e2亦不能抑制HRP标记的McAb 4c9与PHC AIF的结合。在分析2类McAb之间关系时发现，5c3能与PHC AIF发生反应，而4e2能与胎盘AIF进行反应，并且4e2对5c3同AIF的结合反应具有竞争性抑制作用。
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2.4 免疫组织化学染色 选择McAb 2f8和4c9对共计78例正常肝组织、慢性肝炎与肝硬化及PHC肝组织分别进行了免疫组织化学检查，结果见表1。
3 讨论
70年代以来，研究人员曾通过测定血清碱性铁蛋白辅助诊断某些类型的肿瘤，其敏感性虽好，但假阳性率高[3,4] 。80年代中后期以来，国内外相继报道了抗AF多克隆抗体和单克隆抗体[4-7] 。
我们在纯化AF的基础上，成功地分离出仅同来源于AF的BIF有少量抗原交叉的低pI值AIF。以2种分别来源于恶性及胚胎组织的AIF为抗原，共制备了7株特异性抗AIF McAbs。对这些McAbs进行研究后，发现 2 株抗PHC AIF McAb和5株抗人胎盘AIF McAb分别结合于各自AIF分子上的不同抗原决定簇，同时我们发现PHC和人胎盘组织AIF中存在着共同的抗原决定簇，这为铁蛋白作为肿瘤相关抗原的研究提供了新的思路。应用2f8和4c9 2株McAbs作为一抗，分别对正常和良、恶性肝组织进行了免疫组织化学检测。结果提示，在诊断PHC中，抗PHC AIF McAb的效果要稍好于抗人胎盘AIF McAb。
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肿瘤相关抗原及其McAb的制备与鉴定是其临床应用的前提和关键。本文结果提示，对于AIF的制备，人胎盘组织仅能部分取代PHC组织。我们制备的抗PHC AIF McAb特异性较好，为该McAbs用于PHC的血清学检测和放射免疫诊断奠定了基础。
①联系地址：武汉市汉口黎黄陂路47号医学科学研究所，武汉430014
②武汉市抗体研究中心，武汉430014
作者简介：游上游，男，39岁，在职博士生，副主任医师，主要从事抗体工程研究；张楚瑜，男，58岁，教授，博士生导师
参考文献
1 Dinari G, Zakan I, Marcus H et al. Placental ferritin in coeliac disease:relation to clinical stage,origin and possible role in the pathogenesis of malignancy. Gut，1991;32(9):999
, http://www.100md.com
2 Hann H W. Human ferritins present in the sera of nude mice transplanted with human HCC.Cancer Res, 1984;44:3898
3 Hann H W, Kim C Y,London W T et al. Increased serum ferritin in chronic liver discase: a risk factor for primary hepatocellular carcinoma.Int J Cancer, 1989;43:376
4 杨秉辉,汤钊猷.消化系统肿瘤的早期诊断.中华消化杂志,1989;9(1):40
5 Moroz C,Lantsltry Z, Sela O et al. Radioimmunodetetion of tumors with monoclonal antiplacental ferritin antibody,primary results.Oncology，1989;46:35
6 游上游,Goodall M.应用特异性单克隆抗体测定血清酸性铁蛋白. 中华医学检验杂志，1994;17(5):284
7 沈 薇. 血清胎盘酸性铁蛋白酶联火箭电泳法对原发性肝癌诊断的价值. 临床肝胆病杂志，1996;12(1):24
收稿1998-08-09 修回1999-02-04, 百拇医药