猪人异种移植超急性排斥反应补体激活途径的探讨
作者：矫文捷 陈玉平 李文 区颂雷 石镜 张志泰
单位：矫文捷(首都医科大学附属北京安贞医院胸外科 北京 100029)；陈玉平(首都医科大学附属北京安贞医院胸外科 北京 100029)；李 文(首都医科大学附属北京安贞医院胸外科 北京 100029)；区颂雷(首都医科大学附属北京安贞医院胸外科 北京 100029)；石 镜(首都医科大学附属北京安贞医院胸外科 北京 100029)
关键词：
中国免疫学杂志000215 分类号：R392.4
异种移植最大障碍是由体液免疫造成的超急性排斥反应(Hyperacute rejection，HAR)。本实验用猪胸主动脉血管内皮细胞和人血清建立HAR体外模型，LDH释放法检测补体依赖的细胞毒作用，探讨HAR中补体激活途径。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 猪血管内皮细胞的培养 手术取一段猪胸主动脉，使用胶原酶消化并制备内皮细胞悬液，接种于96孔平板中培养。
1.2 HAR模型的建立 在长满猪血管内皮细胞的96孔平板内，加入各种人血清。
1.3 LDH释放法检测补体依赖的细胞毒性反应 根据加入血清的不同，将实验分6组，即正常人血清组(HS)、灭活人血清组(HIHS)、IgM缺乏人血清组(IgM-D)、因子B缺乏人血清组(fB-D)、C1q缺乏人血清组(C1q-D)、猪血清组(PS)。在不同时间点取上清液200 μl用全自动生化仪读出LDH值，并换算出内皮细胞溶解率。
2 结果
HS组、fB-D组的内皮细胞溶解率明显高于PS组，而HIHS、IgM-D、C1q-D组的溶解率与PS组无显著差异；随着反应时间的延长，各组溶解率均有不同程度的升高，但在反应3～4 h后，均不再继续升高。另外，使用不同浓度血清与内皮细胞反应4 h，随着浓度的升高，PS组的溶解率无明显变化，而HS、fB-D组的溶解率逐渐增加(P<0.01)。
, 百拇医药
3 讨论
猪人异种器官移植最棘手的问题是HAR。资料表明克服非协调性异种移植HAR的关键在于阻断补体激活[见：Mckenzie I F C, Osman N, Cohney S et al. Strategies to overcome hyperacute rejection of pig-to-human xenografts. Transpl Proc, 1997； 29: 973.Dalmasso A P, Vercellotti G M, Platt J L et al. Inhibition of complement-mediated endothelial cell cytotoxicity by decay-accelerating factor. Transpl,1991； 52: 530]。我们选择缺乏IgM、C1q的血清阻断补体激活的经典途径，缺乏因子B的血清阻断补体激活的替代途径，用灭活人血清阻断2种途径。结果发现，通过灭活所有补体或清除C1q、IgM，可使内皮细胞溶解率大大低于灭活或清除前，提示这种处理方法可减弱或终止人血清对猪血管内皮细胞的细胞毒性；而清除B因子后，细胞溶解率仍维持高水平,不能减轻细胞毒作用。可见，补体在HAR中是必要的，而且在猪人异种移植中，补体激活主要通过经典途径而不是替代途径，补体并不直接损伤内皮细胞，需要天然抗体参加。
, 百拇医药
另外，在反应达3或4 h时，细胞溶解率在各组内不再继续升高，提示细胞毒性在3～4 h接近高峰，HAR已经很严重。
而正常人血清与内皮细胞反应4 h 时，随着血清浓度的升高,细胞溶解率逐渐增加(P<0.01)，当升至25%和50%时，毒性差别不大(P>0.05)，提示人补体的浓度越高，对猪血管内皮细胞的细胞毒性越大，若彻底或尽可能(至少75%)清除人血清中的补体，可有助于控制HAR。
由于在猪人异种移植HAR中，经经典途径激活补体是主要的方式，那么若要阻断补体激活，仅仅阻断C3是不够的，必须阻断C3水平之前的补体成分。■
①现在青岛大学医学院附属医院胸外科，青岛266003
作者简介：矫文捷，男，30岁，主治医师，硕士生，主要从事胸科肿瘤及肺移植方面的临床和实验研究；
陈玉平，男，64岁，主任医师，教授，肺移植专家，主要从事胸外科临床工作
作者单位：张志泰(首都医科大学附属北京安贞医院胸外科 北京 100029)
收稿日期：1999-07-20
修回日期：1999-08-25, 百拇医药
单位：矫文捷(首都医科大学附属北京安贞医院胸外科 北京 100029)；陈玉平(首都医科大学附属北京安贞医院胸外科 北京 100029)；李 文(首都医科大学附属北京安贞医院胸外科 北京 100029)；区颂雷(首都医科大学附属北京安贞医院胸外科 北京 100029)；石 镜(首都医科大学附属北京安贞医院胸外科 北京 100029)
关键词：
中国免疫学杂志000215 分类号：R392.4
异种移植最大障碍是由体液免疫造成的超急性排斥反应(Hyperacute rejection，HAR)。本实验用猪胸主动脉血管内皮细胞和人血清建立HAR体外模型，LDH释放法检测补体依赖的细胞毒作用，探讨HAR中补体激活途径。
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1 材料与方法
1.1 猪血管内皮细胞的培养 手术取一段猪胸主动脉，使用胶原酶消化并制备内皮细胞悬液，接种于96孔平板中培养。
1.2 HAR模型的建立 在长满猪血管内皮细胞的96孔平板内，加入各种人血清。
1.3 LDH释放法检测补体依赖的细胞毒性反应 根据加入血清的不同，将实验分6组，即正常人血清组(HS)、灭活人血清组(HIHS)、IgM缺乏人血清组(IgM-D)、因子B缺乏人血清组(fB-D)、C1q缺乏人血清组(C1q-D)、猪血清组(PS)。在不同时间点取上清液200 μl用全自动生化仪读出LDH值，并换算出内皮细胞溶解率。
2 结果
HS组、fB-D组的内皮细胞溶解率明显高于PS组，而HIHS、IgM-D、C1q-D组的溶解率与PS组无显著差异；随着反应时间的延长，各组溶解率均有不同程度的升高，但在反应3～4 h后，均不再继续升高。另外，使用不同浓度血清与内皮细胞反应4 h，随着浓度的升高，PS组的溶解率无明显变化，而HS、fB-D组的溶解率逐渐增加(P<0.01)。
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3 讨论
猪人异种器官移植最棘手的问题是HAR。资料表明克服非协调性异种移植HAR的关键在于阻断补体激活[见：Mckenzie I F C, Osman N, Cohney S et al. Strategies to overcome hyperacute rejection of pig-to-human xenografts. Transpl Proc, 1997； 29: 973.Dalmasso A P, Vercellotti G M, Platt J L et al. Inhibition of complement-mediated endothelial cell cytotoxicity by decay-accelerating factor. Transpl,1991； 52: 530]。我们选择缺乏IgM、C1q的血清阻断补体激活的经典途径，缺乏因子B的血清阻断补体激活的替代途径，用灭活人血清阻断2种途径。结果发现，通过灭活所有补体或清除C1q、IgM，可使内皮细胞溶解率大大低于灭活或清除前，提示这种处理方法可减弱或终止人血清对猪血管内皮细胞的细胞毒性；而清除B因子后，细胞溶解率仍维持高水平,不能减轻细胞毒作用。可见，补体在HAR中是必要的，而且在猪人异种移植中，补体激活主要通过经典途径而不是替代途径，补体并不直接损伤内皮细胞，需要天然抗体参加。
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另外，在反应达3或4 h时，细胞溶解率在各组内不再继续升高，提示细胞毒性在3～4 h接近高峰，HAR已经很严重。
而正常人血清与内皮细胞反应4 h 时，随着血清浓度的升高,细胞溶解率逐渐增加(P<0.01)，当升至25%和50%时，毒性差别不大(P>0.05)，提示人补体的浓度越高，对猪血管内皮细胞的细胞毒性越大，若彻底或尽可能(至少75%)清除人血清中的补体，可有助于控制HAR。
由于在猪人异种移植HAR中，经经典途径激活补体是主要的方式，那么若要阻断补体激活，仅仅阻断C3是不够的，必须阻断C3水平之前的补体成分。■
①现在青岛大学医学院附属医院胸外科，青岛266003
作者简介：矫文捷，男，30岁，主治医师，硕士生，主要从事胸科肿瘤及肺移植方面的临床和实验研究；
陈玉平，男，64岁，主任医师，教授，肺移植专家，主要从事胸外科临床工作
作者单位：张志泰(首都医科大学附属北京安贞医院胸外科 北京 100029)
收稿日期：1999-07-20
修回日期：1999-08-25, 百拇医药