脾内免疫法制备抗α2-抗纤溶酶单克隆抗体
作者：王玉亮 黄繁墙 穆红 彭林 李家增 武文杰
单位：王玉亮(天津第一中心医院血栓与止血研究所 天津 300192)；黄繁墙(天津第一中心医院血栓与止血研究所 天津 300192)；穆 红(天津第一中心医院血栓与止血研究所 天津 300192)；彭 林(天津第一中心医院血栓与止血研究所 天津 300192)；李家增(天津第一中心医院血栓与止血研究所 天津 300192)；武文杰(天津第一中心医院血栓与止血研究所 天津 300192)
关键词：
中国免疫学杂志000209 分类号：R392-33
α2-抗纤溶酶(α2-Antiplasmin， α2-AP)是由肝脏合成分泌的，含有452个氨基酸的单链糖蛋白，分子量为70 000。α2-AP属于丝氨酸酶抑制物家族成员之一，在人血浆中α2-AP是主要的纤溶酶抑制物，在控制纤溶中起关键作用[1]。为此制备α2-AP单克隆抗体，建立ELISA方法用于纤溶系统的监测，为进一步提高抗原的免疫原性，减少抗原用量，延长抗原释放时间，用大分子惰性物质如硝酸纤维素膜(NC膜)作为抗原载体进行脾内包埋免疫。我们将抗原吸附于NC膜上，沿小鼠左肩正中线下胸背部纵形切口1 cm长，逐层入腹，轻轻牵出脾脏，以刀尖沿脾纵轴轻划一小口，置入1个三角形载有α2-AP抗原的NC膜，使之完全包埋于脾脏内，观察无出血后回纳脾脏，依次缝合伤口。间隔3 w后，用同样方法再进行1次，于加强免疫后第3天取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(5∶1)，用PEG-4000常规方法进行融合[2,3]，HAT培养基选择培养，当克隆长至1/10孔大小时，采用间接ELISA法筛选分泌抗体阳性杂交瘤细胞株，并采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，建立了2株稳定分泌抗-α2-AP单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为3H4和2E3，并用α2-AP采用常规方法免疫家兔，制备抗-α2-AP多克隆抗体血清。对其中的1株3H4进行研究，其杂交瘤染色体众数为96.37±1.90，分泌的抗体为IgG1亚类，kappa型。ELISA检测腹水效价1∶106，采用饱和硫酸铵盐析法从腹水纯化McAb 3H4,SDS-PAGE检测有较高纯度。3H4抗体对α2-AP标准品为阳性反应，而对ATIII及纤维蛋白原均为阴性，说明对其无交叉反应。此杂交瘤细胞株3 d传1代，体外传代培养6个月以上，ELISA检测抗体滴度无明显降低。采用ELISA法检测正常人血浆α2-AP含量，以纯化的McAb 3H4包板，兔抗α2-AP为多抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG作为三抗，以ABTS为底物，ELISA法检测了30名正常人枸缘酸钠抗凝血浆(1∶9)α2-AP含量，其结果为(98±1.99) mg/L。由此可见，制备α2-抗纤溶酶单克隆抗体用以检测α2-AP，对于了解肝病、血栓性疾病、DIC等许多疾病纤溶改变有着广泛的应用前景，并可用于溶栓治疗监测[4]。■
, 百拇医药
①中国医学科学院血液学研究所，天津300000
作者简介：王玉亮，男，26岁，技师，从事细胞及分子生物学方面的研究
参考文献：
[1]李家增，贺石林，王鸿利主编. 血栓病学. 北京：科学出版社，1998：75-76
[2]黄传书，金伯泉. 一种用于制备McAb杂交瘤的体内和体外联合免疫诱导法. 单克隆抗体通讯，1993；9(1)：54
[3]鄂 征主编. 组织培养和分子细胞学技术. 北京：北京出版社，1995：193-198
[4]Wohl R C，Sinio L，Robbins K C.Methods for studying fibrinolytic pathway components in human plasma .Thromb Res,1981;22:281
收稿日期：1999-05-19
修回日期：1999-08-11, 百拇医药
单位：王玉亮(天津第一中心医院血栓与止血研究所 天津 300192)；黄繁墙(天津第一中心医院血栓与止血研究所 天津 300192)；穆 红(天津第一中心医院血栓与止血研究所 天津 300192)；彭 林(天津第一中心医院血栓与止血研究所 天津 300192)；李家增(天津第一中心医院血栓与止血研究所 天津 300192)；武文杰(天津第一中心医院血栓与止血研究所 天津 300192)
关键词：
中国免疫学杂志000209 分类号：R392-33
α2-抗纤溶酶(α2-Antiplasmin， α2-AP)是由肝脏合成分泌的，含有452个氨基酸的单链糖蛋白，分子量为70 000。α2-AP属于丝氨酸酶抑制物家族成员之一，在人血浆中α2-AP是主要的纤溶酶抑制物，在控制纤溶中起关键作用[1]。为此制备α2-AP单克隆抗体，建立ELISA方法用于纤溶系统的监测，为进一步提高抗原的免疫原性，减少抗原用量，延长抗原释放时间，用大分子惰性物质如硝酸纤维素膜(NC膜)作为抗原载体进行脾内包埋免疫。我们将抗原吸附于NC膜上，沿小鼠左肩正中线下胸背部纵形切口1 cm长，逐层入腹，轻轻牵出脾脏，以刀尖沿脾纵轴轻划一小口，置入1个三角形载有α2-AP抗原的NC膜，使之完全包埋于脾脏内，观察无出血后回纳脾脏，依次缝合伤口。间隔3 w后，用同样方法再进行1次，于加强免疫后第3天取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(5∶1)，用PEG-4000常规方法进行融合[2,3]，HAT培养基选择培养，当克隆长至1/10孔大小时，采用间接ELISA法筛选分泌抗体阳性杂交瘤细胞株，并采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，建立了2株稳定分泌抗-α2-AP单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为3H4和2E3，并用α2-AP采用常规方法免疫家兔，制备抗-α2-AP多克隆抗体血清。对其中的1株3H4进行研究，其杂交瘤染色体众数为96.37±1.90，分泌的抗体为IgG1亚类，kappa型。ELISA检测腹水效价1∶106，采用饱和硫酸铵盐析法从腹水纯化McAb 3H4,SDS-PAGE检测有较高纯度。3H4抗体对α2-AP标准品为阳性反应，而对ATIII及纤维蛋白原均为阴性，说明对其无交叉反应。此杂交瘤细胞株3 d传1代，体外传代培养6个月以上，ELISA检测抗体滴度无明显降低。采用ELISA法检测正常人血浆α2-AP含量，以纯化的McAb 3H4包板，兔抗α2-AP为多抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG作为三抗，以ABTS为底物，ELISA法检测了30名正常人枸缘酸钠抗凝血浆(1∶9)α2-AP含量，其结果为(98±1.99) mg/L。由此可见，制备α2-抗纤溶酶单克隆抗体用以检测α2-AP，对于了解肝病、血栓性疾病、DIC等许多疾病纤溶改变有着广泛的应用前景，并可用于溶栓治疗监测[4]。■
, 百拇医药
①中国医学科学院血液学研究所，天津300000
作者简介：王玉亮，男，26岁，技师，从事细胞及分子生物学方面的研究
参考文献：
[1]李家增，贺石林，王鸿利主编. 血栓病学. 北京：科学出版社，1998：75-76
[2]黄传书，金伯泉. 一种用于制备McAb杂交瘤的体内和体外联合免疫诱导法. 单克隆抗体通讯，1993；9(1)：54
[3]鄂 征主编. 组织培养和分子细胞学技术. 北京：北京出版社，1995：193-198
[4]Wohl R C，Sinio L，Robbins K C.Methods for studying fibrinolytic pathway components in human plasma .Thromb Res,1981;22:281
收稿日期：1999-05-19
修回日期：1999-08-11, 百拇医药