用PCR-SSP分析HLA-B位点血清学分型困难标本
作者：杨颖 冯哲 张雁征 张工梁 冯明亮
单位：杨颖(上海血液中心，上海200051)；冯哲(上海血液中心，上海200051)；张雁征(上海血液中心，上海200051)；张工梁(上海血液中心，上海200051)；冯明亮(上海血液中心，上海200051)
关键词：血清学分型；HLA-B位点；PCR-SSP基因分型
中国免疫学杂志000606 摘 要 目的：对血清学HLA-B位点分型困难标本用PCR-SSP方法分析，并寻找血清分型效果不佳原因。方法：用本室建立的PCR-SSP方法对100株标准细胞及91份血清学分型困难标本分别作HLA-B位点分析，前者作为PCR-SSP方法的参考对照品。结果：100株标准细胞分析结果与已知结果一致；91份疑问标本均顺利地用PCR-SSP分型，结果共有70种等位基因格局，其中36种与血清学完全不同，占52%。PCR-SSP还检出了一些原先认为上海人中空白的基因，如B49。结论：从PCR-SSP分型结果推断血清学部分标本分型结果不佳的原因是缺少单价抗血清；同一交叉反应组内错检；反应强度不当，导致结果难辨；操作中跨孔污染。而PCR-SSP就没有这方面的问题。证实了本室建立的PCR-SSP法可作为准确可靠的HLA-B位点分型手段。
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中国图书分类号 R371.33
The analysis of ambiguous sera-typing for HLA-B locus with PCR-SSP
YANG Ying,FENG Zhe,ZHANG Yan-Zheng et al
(Department of Immunology,Shanghai Blood Center,Shanghai 200051)
Abstract Objective:To analyse HLA-B locus of 91 ambiguous sera-typing samples with PCR-SSP method and find out what cause sera-typing ambiguous.Methods:HLA-B locus of 91 ambiguous sera-typing samples and 100 reference cell lines as reference were analysed with PCR-SSP method which was established in the lab.Results:91 samples were successfully typed with PCR-SSP,totally 70 different result patterns were gotten,among which 36 patterns were different from those of sera-typing,counting for 52%.Besides,PCR-SSP can detect some alleles which were formerly thought as blank in shanghaiese ,for example B49.Conclusion:The reasons for the differences were deduced as:no mono-specific anti-sera was available.Mistyping among cross reactive group antigens.The too strong or weak reactions between antigens and antisera interfered with the determination of results.The cross over within different wells in operating.PCR-SSP is free from these problems listed above and the accuracy of PCR-SSP was demonstrated by the completely result coincidence with reference cell lines.PCR-SSP is confirmed as a more accurate and reliable method for HLA-B typing,satisfying the clinical needs.
, 百拇医药
Key words Sera-typing HLA-B locus PCR-SSP genotyping
HLA(人类白细胞抗原)编码系统位于人类6号染色体短臂，主要有A，B，C，DR，DQ，DP等位点，其中与移植密切相关且作为临床配型指标主要有A，B，DR等[1]。B位点是其中最复杂，多态性最多的区域，其高变区各等位基因差异仅在几个碱基，且只有极少等位基因某个高变区具有独特的碱基顺序[2]，导致很少有单价抗血清，且交叉反应众多，使得血清学B位点分型往往出现错检，漏检，定型困难。本文采用PCR-SSP(Polymerase chain reaction-sequence specific primers)方法，针对不同高变区不同碱基顺序，设计若干相应引物，调整PCR反应体系，添加PCR反应增效剂，从而达到分型目的。
1 材料与方法
1.1 标本 选取标准细胞株100株，其A，B位点特异性已知，正常无关人群及白血病人家属共91名，其A，B位点均作过血清学分型，但其B位点分型困难或结果有疑问。
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1.2 试剂与仪器
1.2.1 HLA抗血清 购自美国TRANS-TYPE公司，部分血清盘购自美国ONE-LAMBDA公司。
1.2.2 引物设计 引物顺序参考文献[3]，特异性参见文献[4]，委托中科院上海植物生理研究所合成。Taq-gold酶购自PE公司。扩增仪为M.J.Research公司生产的PCT-100TM及PE公司9600型。
1.3 方法
1.3.1 抽提DNA 取外周血1 ml，ACD或5%EDTA抗凝，用酚-氯仿法抽提DNA。
1.3.2 PCR扩增 PCR反应体系为25 μl，其中67 mmol/L Tris-Cl pH8.8，16.6 mmol/L硫酸铵，2 mmol/L Mg2+,0.01%Tween-20，0.2 mmol/L dNTP，2 μmol/L 3.4 μmol/L特异性引物浓度，1～2 μmol/L内对照引物，5%DMSO或10%甘油，1 U AmpliTaq-Gold酶。
, 百拇医药
1.3.3 PCR反应参数 PCT-100TM为95℃ 8 min；94℃ 50 s,68℃ 1 min，72℃ 1 min，5个循环；94℃ 50 s,65℃ 50 s,72℃ 1 min，25个循环；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，8个循环；72℃ 5 min。9600型为：94℃ 8 min；94℃ 30 s，67℃ 30 s，72℃ 40 s，5个循环：94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 40 s，24个循环；94℃ 40 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，4个循环；72℃ 5 min。
1.3.4 检测 PCR产物于2%琼脂糖凝胶，0.5×TBE，100 V电压下电泳0.5 h，紫外下观察结果。
2 结果
2.1 100株标准细胞本法得到B位点分型结果与已知结果符合率为100%，说明本法分型可靠性及特异性较高。
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2.2 91份血清学B位点分型有疑问标本PCR-SSP均能分型，共有70种情况，总结见表1。2种方法完全一致率为21%：基本一致，即宽特异性基本相同而窄特异性错检或漏检为27%；有1个或2个位点差错检或漏检共为36种，占52%，其原因分析见讨论。
2.3 在3号情况(仅1个标本)时，PCR-SSP检出为B*4901，15号情况(仅1个标本)时，检出为B*5301，用其它标本，包括B59，B35，B5，B50等与上述位点有血清学交叉反应者，作PCR-SSP HLA-B位点分析，确认无非特异反应及交叉反应产生，并肯定了上述结果的重复性。
表1 70种血清学B位点分型困难的PCR-SSP结果
Tab.1 The results of PCR-SSP for B locus in the ambiguous sera-typing samples No.
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Results of
sera-typing
Results of
PCR-SSP
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Results of
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Results of
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Note:1)results of two methods are concordant；2)serotyping results only detected broad specificity while PCR-SSP deteced split-specificity;3)results between two methods are incordant;4)there doesn't include known B*53,B*49 reference in control panel
3 讨论
由于HLA-B位点各等位基因间高变区核苷酸顺序差别往往只有一至几个碱基，分型比其它位点困难，反应在血清学上为多交叉反应及无良好高特异抗血清，且血清学受实验因素影响较多，反应偏强或偏弱，均会导致分型困难。
, 百拇医药
本实验中这些血清学结果与PCR-SSP的分型结果不同，主要有以下几个原因：①血清分型试剂中缺少高特异抗血清，如无B48的抗血清，而B48与B40有交叉反应，故错把B48定为B40，如31，32号，因无B49抗血清而错检3号；②众多交叉反应，如B15，35，5之间；B27，7，37；B16，22，67；B15，46；B8，B59等往往有交叉反应，导致错检、漏检或无法判明；③反应偏强，导致漏检。另外，实验操作中抗血清的跨孔污染也会导致结果的难辨或差错。1～10号的差错原因可能为第2，3种原因，11～22号可能为第2，4种原因，23～30号，33，34主要为第2种原因，35，36号主要为第1种原因。跨孔污染则使上述情况更为复杂。
PCR-SSP实验步骤较少，试剂来源广泛，结果判读容易，容易推广。本文所有标本均能临床应用，可靠程度高于血清学。与血清学相比，它能明确得出结论，且分辨率更高，能检出亚型或等位基因，这在表1中可见，并且不受标本来源及健康状况影响，如疾病、化疗、陈旧血等。在排除上述原因后，必须考虑有无罕见或新抗原，如这次检出原先认为上海人群中空白的B*4901，较罕见的B*5301等[5]。
, 百拇医药
由于本文标本是从500余份血清标本中挑选出有疑问者，故血清分型不足可能被放大，这点在实际中需被考虑而不致误导，毕竟PCR-SSP分型需众多引物和较昂贵的DNA多聚酶。若以PCR-SSP分析血清分型的困难标本，则可收事半功倍的效果。
本文在建立HLA-B位点PCR-SSP法时，发现与文献相比，必须加用反应增效剂，否则无法顺利扩增，增效剂可选用DMSO或甘油，两者相比，DMSO可减少酶用量，但扩增效率似以甘油为佳，而反应缓冲液也必须采用简单缓冲对Tris-Cl、硫酸铵、Tween-20，而非市售时配置的含K+PCR缓冲液，目前国内许多实验室无法重复国外文献类似实验，可能原因就在于以上几点，笔者希望本室的经验会对其它单位有所帮助。
上海市卫生局青年科研基金课题(编号 131954Y4)
作者简介：杨颖，女，33岁，助理研究员，主要从事免疫遗传及移植免疫研究
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参考文献
1，Cho Y W,Cecka J M,Terasaki P I.HLA matching effects:better survival rates and graft quality.In:Tterasali P I,Ccecka J M E eds.Clinical transplants.Los Angeles:UCLA tissue typing laboratory,1995:435-449
2，Arnett K L,Parham P.HLA class I nuleotide sequences.Tissue Antigens,1995;45:217
3，Bunce M,O'neill C M,Barnardo M C N M et al.Phototyping comprehensive DNA typing for HLA-A，B，C，DRB1，DRB3，DRB&5DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilizing sequence-specific primer(PCR-SSP).Tissue Antigens,1995;46:355
4，杨 颖，冯 哲,张雁征 et al.用PCR-SSP作 HLA-B位点分型及B22亚型分析.中国免疫学杂志，2000；16(2)：91
5，赵桐茂编著.人类血型遗传学.北京：科学出版社，1987：136-169
1999-12-11
2000-02-12, 百拇医药
单位：杨颖(上海血液中心，上海200051)；冯哲(上海血液中心，上海200051)；张雁征(上海血液中心，上海200051)；张工梁(上海血液中心，上海200051)；冯明亮(上海血液中心，上海200051)
关键词：血清学分型；HLA-B位点；PCR-SSP基因分型
中国免疫学杂志000606 摘 要 目的：对血清学HLA-B位点分型困难标本用PCR-SSP方法分析，并寻找血清分型效果不佳原因。方法：用本室建立的PCR-SSP方法对100株标准细胞及91份血清学分型困难标本分别作HLA-B位点分析，前者作为PCR-SSP方法的参考对照品。结果：100株标准细胞分析结果与已知结果一致；91份疑问标本均顺利地用PCR-SSP分型，结果共有70种等位基因格局，其中36种与血清学完全不同，占52%。PCR-SSP还检出了一些原先认为上海人中空白的基因，如B49。结论：从PCR-SSP分型结果推断血清学部分标本分型结果不佳的原因是缺少单价抗血清；同一交叉反应组内错检；反应强度不当，导致结果难辨；操作中跨孔污染。而PCR-SSP就没有这方面的问题。证实了本室建立的PCR-SSP法可作为准确可靠的HLA-B位点分型手段。
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中国图书分类号 R371.33
The analysis of ambiguous sera-typing for HLA-B locus with PCR-SSP
YANG Ying,FENG Zhe,ZHANG Yan-Zheng et al
(Department of Immunology,Shanghai Blood Center,Shanghai 200051)
Abstract Objective:To analyse HLA-B locus of 91 ambiguous sera-typing samples with PCR-SSP method and find out what cause sera-typing ambiguous.Methods:HLA-B locus of 91 ambiguous sera-typing samples and 100 reference cell lines as reference were analysed with PCR-SSP method which was established in the lab.Results:91 samples were successfully typed with PCR-SSP,totally 70 different result patterns were gotten,among which 36 patterns were different from those of sera-typing,counting for 52%.Besides,PCR-SSP can detect some alleles which were formerly thought as blank in shanghaiese ,for example B49.Conclusion:The reasons for the differences were deduced as:no mono-specific anti-sera was available.Mistyping among cross reactive group antigens.The too strong or weak reactions between antigens and antisera interfered with the determination of results.The cross over within different wells in operating.PCR-SSP is free from these problems listed above and the accuracy of PCR-SSP was demonstrated by the completely result coincidence with reference cell lines.PCR-SSP is confirmed as a more accurate and reliable method for HLA-B typing,satisfying the clinical needs.
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Key words Sera-typing HLA-B locus PCR-SSP genotyping
HLA(人类白细胞抗原)编码系统位于人类6号染色体短臂，主要有A，B，C，DR，DQ，DP等位点，其中与移植密切相关且作为临床配型指标主要有A，B，DR等[1]。B位点是其中最复杂，多态性最多的区域，其高变区各等位基因差异仅在几个碱基，且只有极少等位基因某个高变区具有独特的碱基顺序[2]，导致很少有单价抗血清，且交叉反应众多，使得血清学B位点分型往往出现错检，漏检，定型困难。本文采用PCR-SSP(Polymerase chain reaction-sequence specific primers)方法，针对不同高变区不同碱基顺序，设计若干相应引物，调整PCR反应体系，添加PCR反应增效剂，从而达到分型目的。
1 材料与方法
1.1 标本 选取标准细胞株100株，其A，B位点特异性已知，正常无关人群及白血病人家属共91名，其A，B位点均作过血清学分型，但其B位点分型困难或结果有疑问。
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1.2 试剂与仪器
1.2.1 HLA抗血清 购自美国TRANS-TYPE公司，部分血清盘购自美国ONE-LAMBDA公司。
1.2.2 引物设计 引物顺序参考文献[3]，特异性参见文献[4]，委托中科院上海植物生理研究所合成。Taq-gold酶购自PE公司。扩增仪为M.J.Research公司生产的PCT-100TM及PE公司9600型。
1.3 方法
1.3.1 抽提DNA 取外周血1 ml，ACD或5%EDTA抗凝，用酚-氯仿法抽提DNA。
1.3.2 PCR扩增 PCR反应体系为25 μl，其中67 mmol/L Tris-Cl pH8.8，16.6 mmol/L硫酸铵，2 mmol/L Mg2+,0.01%Tween-20，0.2 mmol/L dNTP，2 μmol/L 3.4 μmol/L特异性引物浓度，1～2 μmol/L内对照引物，5%DMSO或10%甘油，1 U AmpliTaq-Gold酶。
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1.3.3 PCR反应参数 PCT-100TM为95℃ 8 min；94℃ 50 s,68℃ 1 min，72℃ 1 min，5个循环；94℃ 50 s,65℃ 50 s,72℃ 1 min，25个循环；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，8个循环；72℃ 5 min。9600型为：94℃ 8 min；94℃ 30 s，67℃ 30 s，72℃ 40 s，5个循环：94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 40 s，24个循环；94℃ 40 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，4个循环；72℃ 5 min。
1.3.4 检测 PCR产物于2%琼脂糖凝胶，0.5×TBE，100 V电压下电泳0.5 h，紫外下观察结果。
2 结果
2.1 100株标准细胞本法得到B位点分型结果与已知结果符合率为100%，说明本法分型可靠性及特异性较高。
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2.2 91份血清学B位点分型有疑问标本PCR-SSP均能分型，共有70种情况，总结见表1。2种方法完全一致率为21%：基本一致，即宽特异性基本相同而窄特异性错检或漏检为27%；有1个或2个位点差错检或漏检共为36种，占52%，其原因分析见讨论。
2.3 在3号情况(仅1个标本)时，PCR-SSP检出为B*4901，15号情况(仅1个标本)时，检出为B*5301，用其它标本，包括B59，B35，B5，B50等与上述位点有血清学交叉反应者，作PCR-SSP HLA-B位点分析，确认无非特异反应及交叉反应产生，并肯定了上述结果的重复性。
表1 70种血清学B位点分型困难的PCR-SSP结果
Tab.1 The results of PCR-SSP for B locus in the ambiguous sera-typing samples No.
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46，511)
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37，57
37，582)
Note:1)results of two methods are concordant；2)serotyping results only detected broad specificity while PCR-SSP deteced split-specificity;3)results between two methods are incordant;4)there doesn't include known B*53,B*49 reference in control panel
3 讨论
由于HLA-B位点各等位基因间高变区核苷酸顺序差别往往只有一至几个碱基，分型比其它位点困难，反应在血清学上为多交叉反应及无良好高特异抗血清，且血清学受实验因素影响较多，反应偏强或偏弱，均会导致分型困难。
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本实验中这些血清学结果与PCR-SSP的分型结果不同，主要有以下几个原因：①血清分型试剂中缺少高特异抗血清，如无B48的抗血清，而B48与B40有交叉反应，故错把B48定为B40，如31，32号，因无B49抗血清而错检3号；②众多交叉反应，如B15，35，5之间；B27，7，37；B16，22，67；B15，46；B8，B59等往往有交叉反应，导致错检、漏检或无法判明；③反应偏强，导致漏检。另外，实验操作中抗血清的跨孔污染也会导致结果的难辨或差错。1～10号的差错原因可能为第2，3种原因，11～22号可能为第2，4种原因，23～30号，33，34主要为第2种原因，35，36号主要为第1种原因。跨孔污染则使上述情况更为复杂。
PCR-SSP实验步骤较少，试剂来源广泛，结果判读容易，容易推广。本文所有标本均能临床应用，可靠程度高于血清学。与血清学相比，它能明确得出结论，且分辨率更高，能检出亚型或等位基因，这在表1中可见，并且不受标本来源及健康状况影响，如疾病、化疗、陈旧血等。在排除上述原因后，必须考虑有无罕见或新抗原，如这次检出原先认为上海人群中空白的B*4901，较罕见的B*5301等[5]。
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由于本文标本是从500余份血清标本中挑选出有疑问者，故血清分型不足可能被放大，这点在实际中需被考虑而不致误导，毕竟PCR-SSP分型需众多引物和较昂贵的DNA多聚酶。若以PCR-SSP分析血清分型的困难标本，则可收事半功倍的效果。
本文在建立HLA-B位点PCR-SSP法时，发现与文献相比，必须加用反应增效剂，否则无法顺利扩增，增效剂可选用DMSO或甘油，两者相比，DMSO可减少酶用量，但扩增效率似以甘油为佳，而反应缓冲液也必须采用简单缓冲对Tris-Cl、硫酸铵、Tween-20，而非市售时配置的含K+PCR缓冲液，目前国内许多实验室无法重复国外文献类似实验，可能原因就在于以上几点，笔者希望本室的经验会对其它单位有所帮助。
上海市卫生局青年科研基金课题(编号 131954Y4)
作者简介：杨颖，女，33岁，助理研究员，主要从事免疫遗传及移植免疫研究
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参考文献
1，Cho Y W,Cecka J M,Terasaki P I.HLA matching effects:better survival rates and graft quality.In:Tterasali P I,Ccecka J M E eds.Clinical transplants.Los Angeles:UCLA tissue typing laboratory,1995:435-449
2，Arnett K L,Parham P.HLA class I nuleotide sequences.Tissue Antigens,1995;45:217
3，Bunce M,O'neill C M,Barnardo M C N M et al.Phototyping comprehensive DNA typing for HLA-A，B，C，DRB1，DRB3，DRB&5DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilizing sequence-specific primer(PCR-SSP).Tissue Antigens,1995;46:355
4，杨 颖，冯 哲,张雁征 et al.用PCR-SSP作 HLA-B位点分型及B22亚型分析.中国免疫学杂志，2000；16(2)：91
5，赵桐茂编著.人类血型遗传学.北京：科学出版社，1987：136-169
1999-12-11
2000-02-12, 百拇医药