双歧杆菌对裸鼠腹腔巨噬细胞产生IL-6、IL-12及NO的影响
作者：王立生 潘令嘉 施理 李明松 孙勇 张亚历 周殿元
单位：周殿元，男，70岁，博士生导师，主要从事大肠癌基础与临床研究；王立生(第一军医大学南方医院全军消化内科研究所，广州 510515)；潘令嘉(第一军医大学南方医院全军消化内科研究所，广州 510515)；施理(第一军医大学南方医院全军消化内科研究所，广州 510515)；李明松(第一军医大学南方医院全军消化内科研究所，广州 510515)
关键词：
中国免疫学杂志000604 中国图书分类号 R117 R392.12
双歧杆菌是人体肠道内最主要的生理性细菌。目前证实它能激活机体免疫系统中的巨噬细胞、NK细胞及其它免疫效应细胞，使之分泌IL-1、TNF-α及IFN-γ等细胞毒性效应分子[1]。本文以ELISA及Griess试剂分别检测了青春型双歧杆菌刺激裸鼠腹腔巨噬细胞分泌的IL-6、IL-12和NO的含量，旨在探讨它们在双歧杆菌调节免疫反应中的作用。
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1 材料与方法
1.1 菌种来源及其培养 双歧杆菌系本所从健康婴儿粪便中分离培养所得，经API-20A及TAB系统(英国)和多次生化反应鉴定为青春型。实验时将双歧杆菌接种至硫乙醇酸盐肉汤中,置厌氧培养箱37℃培养72 h，含菌培养液3 000 r/min 离心10 min，去上清，沉渣以PBS液洗3次，调细菌数为1×1010ml-1。
1.2 实验动物 Balb/c(nu/nu)，6～8周龄，雌雄各半，体重约18～23 g，购于本校实验动物中心，饲养于SPF级动物室。
1.3 实验分组及双歧杆菌的处理措施 实验动物分2组。双歧杆菌注射组：10只裸小鼠，于实验的第1天向裸鼠腹腔注射10%硫乙醇酸盐肉汤2 ml，第2天起腹腔注射双歧杆菌2×109(0.2 ml)，1次/d，连续5 d；对照组：动物数量及第1天的处理措施均同双歧杆菌注射组，不同之处为第2天起向其腹腔注射PBS液0.2 ml，1次/d，连续5 d。
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1.4 巨噬细胞的收集及培养 于实验的第7天按常规收集裸鼠腹腔巨噬细胞，调细胞数为1×106ml-1，加入 LPS(终浓度为10 ng/ml)培养诱导24 h后收集培养上清，置-30℃保存。
1.5 IL-6含量的测定 采用ELISA法。试剂盒购自法国IMMUNOTECH公司。操作程序为：将不同稀释度的待测血清及IL-6标准品加至已包被抗鼠IL-6单抗的96孔细胞培养板中，100 μl/孔，室温孵育90 min；加入乙酰胆碱酯酶标记的二抗，100 μl/孔，室温孵育120 min；吸弃孔内液体，洗涤，扣干；加入200 μl反应底物(含乙酰胆碱的磷酸钾缓冲液，pH7.4)，避光室温孵育30 min；加入终止液，50 μl/孔；于酶标仪上读取405 nm处的吸光值(A值)。
1.6 IL-12含量的测定 采用ELISA法，试剂盒购自上述公司。操作程序为：将不同稀释度的IL-12标准品及待测上清加至已包被抗鼠IL-12单抗的96孔细胞培养板中，100 μl/孔，室温孵育120 min；吸弃孔内液体，洗涤，扣干；加入生物素化二抗，500 μl/孔，然后再加入辣根过氧化物酶标链酶亲和素(HPR-avidin)，100 μl/孔，室温下孵育30 min；反复冲洗，扣干；加入反应底物TMB，100 μl/孔，室温下避光反应30 min；加入终止液(1 mol/L H2SO4)，50 μl/孔；于酶标仪上读取450 nm处的吸光值(A值)。
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1.7 Griess试剂 以蒸馏水配制0.1%盐酸萘乙二胺(Sigma产品)，5%磷酸配制1%磺胺嘧啶(Sigma产品)。临用前两者等量混合即可。
1.8 NO2标准曲线的制备 将1 mmol/L的NaNO2 对倍稀释后，加入等体积的Griess试剂，室温下轻摇10 min，于酶标仪上读取波长550 nm处的 A值，每一样品设3个复孔，取其平均值。
1.9 NO水平的测定 取待测上清100 μl，加入30%硫酸锌5 μl去除蛋白质，5 000 r/min 离心10 min，收集其上清，与等体积的Griess试剂混合。室温下轻摇10 min，于酶标仪上读取波长550 nm的吸光值(A值)。
1.10 统计学处理 所得结果采用t检验。
2 结果
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2.1 双歧杆菌对裸鼠腹腔巨噬细胞产生IL-6及IL-12的影响 ELISA法检测的结果显示，双歧杆菌注射组巨噬细胞分泌的IL-6及IL-12含量均明显高于对照组(P<0.01)。具体见表1。
表1 双歧杆菌对裸鼠腹腔巨噬细胞产生IL-6、IL-12及NO的影响(
±s)
Tab.1 Influence of bifidobacterium on IL-6，IL-12 and
NO produced by peritoneal macrophages of nude mice (±s) Groups
n
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IL-6(pg/ml)
IL-12(pg/ml)
NO(μmol/L)
Bifidobacterium injection group
10
819.80±201.401)
834.29±116.471)
0.55±0.0241)
Control group
10
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303.78±171.75
510.27±123.46
0.34±0.021
Note:Bifidobacterium injection group versus control group, 1) P<0.01
2.2 双歧杆菌刺激裸鼠腹腔巨噬细胞产生NO的含量 将一系列不同浓度的NaNO2标准品与测定的对应A值进行直线相关回归分析，得出其直线回归方程为Y＝0.013+0.022X，r=0.999。再将不同标本测得的A值代入该直线回归方程中，即得到相应的NO含量。经统计学处理发现双歧杆菌注射组的裸鼠腹腔巨噬细胞产生NO的量显著高于对照组(P<0.01)，具体见表1。
3 讨论
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双歧杆菌在体内发挥着生物学屏障、抗感染、抗衰老、抗突变及抗肿瘤等多种重要生理功能。此外它还能激活巨噬细胞，使之分泌多种一定量的细胞因子以及重要介质。Sekine等证实婴儿型双歧杆菌的完整肽聚糖能激活小鼠腹腔巨噬细胞，使其IL-1、IL-6及TNF-α的mRNA表达增强[1]。Nicaise等也阐明了青春型双歧杆菌能刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生大量的IL-1、IL-6及TNF-α[2]。本文结果中，双歧杆菌注射组裸鼠腹腔巨噬细胞产生的IL-6、IL-12及NO含量显著高于对照组，提示青春型双歧杆菌能激活巨噬细胞，使之分泌多量的IL-6、IL-12及NO。IL-6能促进B淋巴细胞的分化成熟及分泌抗体，亦能直接诱导静止的T 淋巴细胞的增殖与活化。IL-12能激活T 淋巴细胞及NK细胞,使之产生大量的IFN-γ，也可诱生LAK及CTL 细胞。它们在体内外均具有广谱的杀瘤活性。NO也能通过诱导肿瘤细胞凋亡及使它的DNA合成的限速酶核糖核酸还原酶失活等多种途径来抑制肿瘤的生长。已知双歧杆菌在体内能显著抑制多种肿瘤的生长，如Meth A维肉瘤、结肠癌、肝癌以及黑色素瘤等[3]。由于双歧杆菌能激活巨噬细胞产生大量的IL-6、IL-12及NO,而这些效应分子体内外均具有显著的抑瘤作用，因此它们的诱生可能介导了双歧杆菌的抗肿瘤作用。
, 百拇医药
作者简介：王立生，男，31岁，医学博士，主要研究胃肠道微生态学；
潘令嘉，女，62岁，博士生导师，主要研究微生态学；
孙勇(第一军医大学南方医院全军消化内科研究所，广州 510515)
张亚历(第一军医大学南方医院全军消化内科研究所，广州 510515)
周殿元(第一军医大学南方医院全军消化内科研究所，广州 510515)
参考文献
1，Sekine K,Ohta J,Pnishi M et al.Analysis of antitumor propertiers of effector cells stimulated with a cell wall preparation (WPG) of bifidobacterium infantis.Biol Pharm Bull,1995;18(1):148
2，Nicaise P,Gleizes A,Forestier F et al.Influence of intestinal bacterial flora on cytokine (IL-1,IL-6 and TNF-α)production by mouse peritoneal macrophages.Eur Cytokine Netw，1993;4(2):133
3，王立生，潘令嘉，施 理et al.双歧杆菌对实验性大肠癌的抑制作用及其机制的探讨.华人消化杂志，1998；6(5)：456
收稿1998-12-07 修回1999-03-25, 百拇医药
单位：周殿元，男，70岁，博士生导师，主要从事大肠癌基础与临床研究；王立生(第一军医大学南方医院全军消化内科研究所，广州 510515)；潘令嘉(第一军医大学南方医院全军消化内科研究所，广州 510515)；施理(第一军医大学南方医院全军消化内科研究所，广州 510515)；李明松(第一军医大学南方医院全军消化内科研究所，广州 510515)
关键词：
中国免疫学杂志000604 中国图书分类号 R117 R392.12
双歧杆菌是人体肠道内最主要的生理性细菌。目前证实它能激活机体免疫系统中的巨噬细胞、NK细胞及其它免疫效应细胞，使之分泌IL-1、TNF-α及IFN-γ等细胞毒性效应分子[1]。本文以ELISA及Griess试剂分别检测了青春型双歧杆菌刺激裸鼠腹腔巨噬细胞分泌的IL-6、IL-12和NO的含量，旨在探讨它们在双歧杆菌调节免疫反应中的作用。
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1 材料与方法
1.1 菌种来源及其培养 双歧杆菌系本所从健康婴儿粪便中分离培养所得，经API-20A及TAB系统(英国)和多次生化反应鉴定为青春型。实验时将双歧杆菌接种至硫乙醇酸盐肉汤中,置厌氧培养箱37℃培养72 h，含菌培养液3 000 r/min 离心10 min，去上清，沉渣以PBS液洗3次，调细菌数为1×1010ml-1。
1.2 实验动物 Balb/c(nu/nu)，6～8周龄，雌雄各半，体重约18～23 g，购于本校实验动物中心，饲养于SPF级动物室。
1.3 实验分组及双歧杆菌的处理措施 实验动物分2组。双歧杆菌注射组：10只裸小鼠，于实验的第1天向裸鼠腹腔注射10%硫乙醇酸盐肉汤2 ml，第2天起腹腔注射双歧杆菌2×109(0.2 ml)，1次/d，连续5 d；对照组：动物数量及第1天的处理措施均同双歧杆菌注射组，不同之处为第2天起向其腹腔注射PBS液0.2 ml，1次/d，连续5 d。
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1.4 巨噬细胞的收集及培养 于实验的第7天按常规收集裸鼠腹腔巨噬细胞，调细胞数为1×106ml-1，加入 LPS(终浓度为10 ng/ml)培养诱导24 h后收集培养上清，置-30℃保存。
1.5 IL-6含量的测定 采用ELISA法。试剂盒购自法国IMMUNOTECH公司。操作程序为：将不同稀释度的待测血清及IL-6标准品加至已包被抗鼠IL-6单抗的96孔细胞培养板中，100 μl/孔，室温孵育90 min；加入乙酰胆碱酯酶标记的二抗，100 μl/孔，室温孵育120 min；吸弃孔内液体，洗涤，扣干；加入200 μl反应底物(含乙酰胆碱的磷酸钾缓冲液，pH7.4)，避光室温孵育30 min；加入终止液，50 μl/孔；于酶标仪上读取405 nm处的吸光值(A值)。
1.6 IL-12含量的测定 采用ELISA法，试剂盒购自上述公司。操作程序为：将不同稀释度的IL-12标准品及待测上清加至已包被抗鼠IL-12单抗的96孔细胞培养板中，100 μl/孔，室温孵育120 min；吸弃孔内液体，洗涤，扣干；加入生物素化二抗，500 μl/孔，然后再加入辣根过氧化物酶标链酶亲和素(HPR-avidin)，100 μl/孔，室温下孵育30 min；反复冲洗，扣干；加入反应底物TMB，100 μl/孔，室温下避光反应30 min；加入终止液(1 mol/L H2SO4)，50 μl/孔；于酶标仪上读取450 nm处的吸光值(A值)。
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1.7 Griess试剂 以蒸馏水配制0.1%盐酸萘乙二胺(Sigma产品)，5%磷酸配制1%磺胺嘧啶(Sigma产品)。临用前两者等量混合即可。
1.8 NO2标准曲线的制备 将1 mmol/L的NaNO2 对倍稀释后，加入等体积的Griess试剂，室温下轻摇10 min，于酶标仪上读取波长550 nm处的 A值，每一样品设3个复孔，取其平均值。
1.9 NO水平的测定 取待测上清100 μl，加入30%硫酸锌5 μl去除蛋白质，5 000 r/min 离心10 min，收集其上清，与等体积的Griess试剂混合。室温下轻摇10 min，于酶标仪上读取波长550 nm的吸光值(A值)。
1.10 统计学处理 所得结果采用t检验。
2 结果
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2.1 双歧杆菌对裸鼠腹腔巨噬细胞产生IL-6及IL-12的影响 ELISA法检测的结果显示，双歧杆菌注射组巨噬细胞分泌的IL-6及IL-12含量均明显高于对照组(P<0.01)。具体见表1。
表1 双歧杆菌对裸鼠腹腔巨噬细胞产生IL-6、IL-12及NO的影响(
±s)Tab.1 Influence of bifidobacterium on IL-6，IL-12 and
NO produced by peritoneal macrophages of nude mice (
±s) Groupsn
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IL-6(pg/ml)
IL-12(pg/ml)
NO(μmol/L)
Bifidobacterium injection group
10
819.80±201.401)
834.29±116.471)
0.55±0.0241)
Control group
10
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303.78±171.75
510.27±123.46
0.34±0.021
Note:Bifidobacterium injection group versus control group, 1) P<0.01
2.2 双歧杆菌刺激裸鼠腹腔巨噬细胞产生NO的含量 将一系列不同浓度的NaNO2标准品与测定的对应A值进行直线相关回归分析，得出其直线回归方程为Y＝0.013+0.022X，r=0.999。再将不同标本测得的A值代入该直线回归方程中，即得到相应的NO含量。经统计学处理发现双歧杆菌注射组的裸鼠腹腔巨噬细胞产生NO的量显著高于对照组(P<0.01)，具体见表1。
3 讨论
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双歧杆菌在体内发挥着生物学屏障、抗感染、抗衰老、抗突变及抗肿瘤等多种重要生理功能。此外它还能激活巨噬细胞，使之分泌多种一定量的细胞因子以及重要介质。Sekine等证实婴儿型双歧杆菌的完整肽聚糖能激活小鼠腹腔巨噬细胞，使其IL-1、IL-6及TNF-α的mRNA表达增强[1]。Nicaise等也阐明了青春型双歧杆菌能刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生大量的IL-1、IL-6及TNF-α[2]。本文结果中，双歧杆菌注射组裸鼠腹腔巨噬细胞产生的IL-6、IL-12及NO含量显著高于对照组，提示青春型双歧杆菌能激活巨噬细胞，使之分泌多量的IL-6、IL-12及NO。IL-6能促进B淋巴细胞的分化成熟及分泌抗体，亦能直接诱导静止的T 淋巴细胞的增殖与活化。IL-12能激活T 淋巴细胞及NK细胞,使之产生大量的IFN-γ，也可诱生LAK及CTL 细胞。它们在体内外均具有广谱的杀瘤活性。NO也能通过诱导肿瘤细胞凋亡及使它的DNA合成的限速酶核糖核酸还原酶失活等多种途径来抑制肿瘤的生长。已知双歧杆菌在体内能显著抑制多种肿瘤的生长，如Meth A维肉瘤、结肠癌、肝癌以及黑色素瘤等[3]。由于双歧杆菌能激活巨噬细胞产生大量的IL-6、IL-12及NO,而这些效应分子体内外均具有显著的抑瘤作用，因此它们的诱生可能介导了双歧杆菌的抗肿瘤作用。
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作者简介：王立生，男，31岁，医学博士，主要研究胃肠道微生态学；
潘令嘉，女，62岁，博士生导师，主要研究微生态学；
孙勇(第一军医大学南方医院全军消化内科研究所，广州 510515)
张亚历(第一军医大学南方医院全军消化内科研究所，广州 510515)
周殿元(第一军医大学南方医院全军消化内科研究所，广州 510515)
参考文献
1，Sekine K,Ohta J,Pnishi M et al.Analysis of antitumor propertiers of effector cells stimulated with a cell wall preparation (WPG) of bifidobacterium infantis.Biol Pharm Bull,1995;18(1):148
2，Nicaise P,Gleizes A,Forestier F et al.Influence of intestinal bacterial flora on cytokine (IL-1,IL-6 and TNF-α)production by mouse peritoneal macrophages.Eur Cytokine Netw，1993;4(2):133
3，王立生，潘令嘉，施 理et al.双歧杆菌对实验性大肠癌的抑制作用及其机制的探讨.华人消化杂志，1998；6(5)：456
收稿1998-12-07 修回1999-03-25, 百拇医药