人成纤维细胞生长因子13基因在酵母细胞中的表达
作者：孙蒙 于永利
单位：孙蒙(白求恩医科大学免疫学教研室，长春130021)；于永利(白求恩医科大学免疫学教研室，长春130021)
关键词：人成纤维细胞生长因子13(hFGF13)；酵母；表达
中国免疫学杂志000801 摘 要 目的：用酵母细胞表达重组人成纤维细胞生长因子(hFGF13)蛋白并检测其活性。方法：通过RT-PCR从流产胎儿脑组织中钓取hFGF13cDNA，将其克隆入pYEX4T-1载体质粒。在酵母细胞表达GST-hFGF13融合蛋白。以细胞增殖实验测定酵母表达蛋白粗提物的活性。结果：GST-hFGF13融合蛋白在酵母细胞中得到表达；GST-hFGF13融合蛋白能刺激NIH3T3细胞的增殖，而且此活性能够被FGFR1细胞外段所拮抗。结论：所获得的重组hFGF13能与FGFR1特异性结合，并具有促有丝分裂活性。
, http://www.100md.com
中国图书分类号 R392.33
The expression of human fibroblast growth factor 13 in Yeast cells
SUN Meng, YU Yong-Li.
Department of Immunology, Norman Bethune University of Medical Sciences Changchun 130021
Abstract Objective：To recombinant hFGF13 protein and detemine is activyty.Methods: The cNDA of human FGF13 was isolated from fetal brain by RT-PCR and into pYEX4T-1 plasmid. Then the recombinant pYEX4T-1-hFGF13 plasmid was transfected into yeast cell (DY150) and the expression of hFGF13 was induced by Cu++. The dialyzed protein released from ultrasonic-lysed yeast cell was used for the determination of biological activity of recombinant GST-FGF13. Results: Western-blot analysis showed that hFGF13 was expressed in yeast cell as GST-FGF13 fusion protein. The GST-FGF13 protein can stimulate the proliferation of NIH3T3 cells and this aetivity could be antagonized by recombinant extracellular part of FGFR1. Conclusion: Obtained recombinant hFGF13 can bind to FGFR1 specifically and have the mitogenic activity.
, 百拇医药
Key words Human FGF13(hFGF13) Yeast cell Expression
成纤维细胞生长因子家族(FGFs)是结构上有一定同源性的一组蛋白质，目前包括19个成员[1]。FGFs通过作用于成纤维细胞生长因子受体(FGFRs)而发挥其生物学功能。FGF受体是免疫球蛋白超家族的成员。FGFs对源于中胚层和神经外胚层的细胞都有促增殖分化作用，因而参与胚胎发育、损伤修复、血管生成、神经再生以及肿瘤形成等生理和病理生理过程。FGF13是新近发现的一个FGF家族成员。研究表明，小鼠FGF13在小鼠的胚胎发育，特别是神经系统的发育过程中可能发挥重要作用[2]。为研究人FGF13的功能，我们自胎儿脑组织以逆转录PCR的方法获取编码人FGF13的cDNA，将此cDNA克隆入酵母表达系统进行表达，并对表达产物进行活性测定。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 酶、质粒、菌株、主要试剂及实验标本 EcoRⅠ、SalⅠ、PstⅠ、T4DNA 连接酶购于宝泰克生物公司；逆转录酶、Taq DNA聚合酶购于Promega公司。pCRTMⅡ质粒、INVαF菌购自Invitrogen公司；hFGF13特异性PCR引物由上海生工合成；Rnase购于华美生物工程公司；酶标驴抗兔抗体由本室提供。逆转录试剂盒，购于美国Promega公司；Gene Clean Ⅱ试剂盒，由白求恩医科大学分子生物学教研室惠赠；纯化质粒DNA所用的试剂盒(Wizard)购于美国BIO 101公司；YEXpressTMYeast表达系统购自CLONTECH Laboratories，INC。流产胎儿脑组织由白求恩医科大学中日联谊医院妇产科提供。
1.2 hFGF13 cDNA的获得及重组pYEX4T-1-hFGF13质粒的构建 取流产胎儿脑组织约0.2克，用Trizol试剂提取细胞总RNA，经逆转录得到cDNA以此为模板，用FGF13特异性引物(5’端引物ATTAGAATTCATGGCGGCGGCTATCGCCAT；3’端引物ACAGGTCGACCTACGTTGATTCATTGTGGC)进行回收之后克隆入pCRTMⅡ质粒。用EcoR和SalⅠ双酶切pCRTMⅡ重组质粒，将释放出的特异性DNA片段次级克隆入pYEX4T-1质粒。用DNA测序仪对重组pYEX4T-1质粒内的外源基因进行序列测定。
, 百拇医药
1.3 hFGF13基因在酵母中表达 将重组pYEX4T-1-hFGF13质粒转染酵母细胞DY150，筛选阳性转化菌进行培养。当培养物的OD600值达到0.8～1.2时，加入5 μl 1 mol/L CuSO4进行诱导，诱导1 h后收集细胞。
1.4 表达产物的SDS-PAGE鉴定 550×g离心5 min以收集诱导的酵母细胞。弃上清，重悬细胞沉淀于1 ml冰预冷的50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，10 000 r/min 离心1 min。弃上清，向细胞沉淀中加入75 μl酵母裂解缓冲液(50 mmol/L pH8.0的Tris-HCl，0.1% Triton-100，0.5% SDS)。剧烈震荡30 s，冰上放置1 min，重复5次。加入75μl 2×SDS凝胶加样缓冲液，煮沸5 min。10 000 r/min 离心1 min，将上清转移至另一管中，取适量进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色后观察。
, 百拇医药
1.5 表达产物的Western-blot鉴定 通过电转移法将经过SDS-PAGE分离的蛋白转移到硝酸纤维素膜上。以兔源抗谷胱甘肽转移酶(GST)的多克隆抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记的驴抗兔抗体为二抗，二氨基联苯胺为显色底物进行Western-blot分析[3]。
1.6 表达产物的粗提 收集经过诱导的酵母细胞，重悬于2 ml裂解液(50 mmol/L Tris-HCl pH8.0；1 mmol/L EDTA；100 mmol/L NaCl；1 mmol/L PMSF)。超声破碎细胞2 min。10 000 r/min 离心2 min。将上清转移至透析袋内，置0.01 mol/L pH7.2的PBS溶液中透析24 h，后用蔗糖反透析2 h，再置生理盐水内透析24 h。
1.7 表达产物的活性测定 用含0.5%小牛血清的IMDM培养液在96孔板内培养NIH3T3细胞，每孔约5×104个细胞，37℃培养24 h。加入粗提的酵母表达产物100 μl，同时设立阴性对照、空白对照以及拮抗实验。分别采用MTT法和 3 H-TdR掺入法测定NIH3T3细胞的增殖情况。
, 百拇医药
2 结果
2.1 hFGF13 cDNA的获得及重组pYEX4T-1-hFGF13质粒的构建 自流产胎儿脑组织提取总RNA，将其逆转录成cDNA。用2个hFGF13特异性引物做PCR。取PCR产物做2%琼脂糖凝胶电泳，放大的特异性cDNA片段大小约760 bp，与预期的片段长度相符(图1A)。将得到的特异性cDNA克隆入pCRTMⅡ质粒，EcoRⅠ酶切鉴定筛选阳性重组质粒。由于hFGF13 cDNA序列内含两个PstⅠ酶切点，因此用PstⅠ酶可将hFGF13 cDNA切割为251、322、165 bp 3个片段，据此可进一步鉴定此片段的正确性。经PstⅠ和EcoRⅠ酶切重组pCRTMⅡ质粒，在琼脂糖凝胶电泳显示有170、250、320 bp 3条区带，这与预测的一致，更证实了此片段的正确性。将此片段次级克隆入pYEX4T-1质粒，EcoR和SalⅠ双酶切鉴定筛选阳性重组质粒(图1B)。用DNA序列分析仪对重组pYEX4T-1质粒中的外源片段进行测序。结果表明，我们所获得的cDNA片段与已发表的FGF13cDNA的序列完全相符。
, 百拇医药
图1 hFGF13特异性cDNA的琼脂糖凝胶电泳分析
Fig.1 Electrophoretic analysis of hFGF13 cDNA
Note:(A)1.DL2 000 DNA marker; 2.RT-PCR product amplified by hFGF13 specific primer;(B) 1.recombinant pYEX4T-1 hFGF13 plamid digested with EcoR Ⅰ and Sal Ⅰ; 2.DL 2000 DNA marker
图2 hFGF13在酵母中表达产物的SDS-PAGE分析鉴定
Fig.2 SDS-PAGE analysis of the expressed protein of pYEX4T-1-hFGF13 recombinant plasmid-contained yeast cell
, 百拇医药
Note:1.induced by Cu++;2.uninduced; 3.protein marker 2.2 hFGF13基因在酵母细胞中表达产物的SDS-PAGE和Western-blot分析 用pYEX4T-hFGF13重组质粒转染酵母细胞，筛选阳性转化菌进行培养，硫酸铜诱导表达。细胞裂解物的SDS-PAGE结果显示，经诱导和未经诱导的酵母细胞裂解物在经考马斯亮蓝染色的凝胶上形成的区带无明显差异(图 2)。这有2种可能：①人FGF13在此酵母表达系统中的表达量较低，造成区带颜色甚浅或被其他同分子量的蛋白区带所掩盖而难以分辨；②hFGF13根本没有得到表达。为进一步明确FGF13在酵母细胞中是否得到表达，我们采用同样的标本做Western-blot，经硫酸铜诱导组的酵母细胞表达一分子量约为58 kD的特异性蛋白质。GST的分子量为27 kD，FGF13的分子量为31 kD，58 kD正是GST-FGF13融合蛋白的预期分子量。由此可见，FGF-hFGF13 cDNA在酵母中以GST融合蛋白的形式得到了表达(图略)。
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2.3 hFGF13基因在酵母细胞中表达产物的活性测定 将hFGF13在酵母中的表达产物超声裂解后，经透析得到重组hFGF13粗提物，分别通过MTT法和 3 H掺入法测定其活性(图 3)。结果表明，重组hFGF13对成纤维细胞NIH3T3有一定的促有丝分裂作用，而且这种作用能被FGFR 1的细胞外段所拮抗。说明酵母中表达了具有功能活性的FGF13蛋白，而且此蛋白能与FGFR1特异性结合。
图3 表达FGFG13的酵母细胞的粗提物的活性测定
Fig.3 The mitogenic activity of dialyzed products released from ultrasonic-lysed yeasts containing hFGF13-pYEX4T-1 recombinant plasmid on 3T3 cells
, 百拇医药
Note:A.3H-thymidine inorporation assays；B.MTT assays
3 讨论
迄今为止，关于FGF13的文章甚少，其生物学活性尚不清楚。Helge Hartung等用 35 S标记的小鼠FGF13 cDNA为探针对小鼠胚胎进行原位杂交，发现FGF13在胚胎期的中枢神经系统和外周神经系统都有表达，在脊神经节、脑神经节及肠道神经系统中表达程度尤高[2]，这提示FGF13在神经系统的发育过程中可能发挥重要作用。我们用酵母细胞表达了人FGF13融合蛋白，这种融合蛋白可促进小鼠NIH3T3细胞的增殖，此活性可被重组FGFR1细胞外段拮抗。我们的结果表明：①人FGF13和其它的FGF一样可刺激成纤维细胞的增殖，因此它在体内可能表现促进损伤修复的功效；②人FGF13通过作用FGFR1而发挥促进成纤维细胞增殖的生物学活性。我们将对人FGF的生物学活性进行进一步的研究。
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本课题受国家自然科学基金(批准号3957019)和香港求是基金会资助
作者简介：孙 蒙，男，29岁，在读免疫学博士；
指导教师：于永利，男，45岁，教授，博士导师
4 参考文献
[1]Nishimura T, Utsunomiya Y, Hoshikawa M et al.Structure and expression of a novel human FGF,FGF-19 expressed in the fetal brain. Biochim Biophys Acta，1999;1444(1):148
[2]Helge Hartung,Ben jamin feldman,Heike Lovec et al. Murine FGF-12 and FGF13:expression in embryonic neruous system,connective tissue and heart. Mechanisms Development，1997；(64)：31
[3]金冬雁，黎孟枫，侯云德et al译.分子克隆实验指南.北京：科学出版社，1996：888-897
[收稿1999-11-28 修回2000-04-24], http://www.100md.com
单位：孙蒙(白求恩医科大学免疫学教研室，长春130021)；于永利(白求恩医科大学免疫学教研室，长春130021)
关键词：人成纤维细胞生长因子13(hFGF13)；酵母；表达
中国免疫学杂志000801 摘 要 目的：用酵母细胞表达重组人成纤维细胞生长因子(hFGF13)蛋白并检测其活性。方法：通过RT-PCR从流产胎儿脑组织中钓取hFGF13cDNA，将其克隆入pYEX4T-1载体质粒。在酵母细胞表达GST-hFGF13融合蛋白。以细胞增殖实验测定酵母表达蛋白粗提物的活性。结果：GST-hFGF13融合蛋白在酵母细胞中得到表达；GST-hFGF13融合蛋白能刺激NIH3T3细胞的增殖，而且此活性能够被FGFR1细胞外段所拮抗。结论：所获得的重组hFGF13能与FGFR1特异性结合，并具有促有丝分裂活性。
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中国图书分类号 R392.33
The expression of human fibroblast growth factor 13 in Yeast cells
SUN Meng, YU Yong-Li.
Department of Immunology, Norman Bethune University of Medical Sciences Changchun 130021
Abstract Objective：To recombinant hFGF13 protein and detemine is activyty.Methods: The cNDA of human FGF13 was isolated from fetal brain by RT-PCR and into pYEX4T-1 plasmid. Then the recombinant pYEX4T-1-hFGF13 plasmid was transfected into yeast cell (DY150) and the expression of hFGF13 was induced by Cu++. The dialyzed protein released from ultrasonic-lysed yeast cell was used for the determination of biological activity of recombinant GST-FGF13. Results: Western-blot analysis showed that hFGF13 was expressed in yeast cell as GST-FGF13 fusion protein. The GST-FGF13 protein can stimulate the proliferation of NIH3T3 cells and this aetivity could be antagonized by recombinant extracellular part of FGFR1. Conclusion: Obtained recombinant hFGF13 can bind to FGFR1 specifically and have the mitogenic activity.
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Key words Human FGF13(hFGF13) Yeast cell Expression
成纤维细胞生长因子家族(FGFs)是结构上有一定同源性的一组蛋白质，目前包括19个成员[1]。FGFs通过作用于成纤维细胞生长因子受体(FGFRs)而发挥其生物学功能。FGF受体是免疫球蛋白超家族的成员。FGFs对源于中胚层和神经外胚层的细胞都有促增殖分化作用，因而参与胚胎发育、损伤修复、血管生成、神经再生以及肿瘤形成等生理和病理生理过程。FGF13是新近发现的一个FGF家族成员。研究表明，小鼠FGF13在小鼠的胚胎发育，特别是神经系统的发育过程中可能发挥重要作用[2]。为研究人FGF13的功能，我们自胎儿脑组织以逆转录PCR的方法获取编码人FGF13的cDNA，将此cDNA克隆入酵母表达系统进行表达，并对表达产物进行活性测定。
1 材料与方法
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1.1 酶、质粒、菌株、主要试剂及实验标本 EcoRⅠ、SalⅠ、PstⅠ、T4DNA 连接酶购于宝泰克生物公司；逆转录酶、Taq DNA聚合酶购于Promega公司。pCRTMⅡ质粒、INVαF菌购自Invitrogen公司；hFGF13特异性PCR引物由上海生工合成；Rnase购于华美生物工程公司；酶标驴抗兔抗体由本室提供。逆转录试剂盒，购于美国Promega公司；Gene Clean Ⅱ试剂盒，由白求恩医科大学分子生物学教研室惠赠；纯化质粒DNA所用的试剂盒(Wizard)购于美国BIO 101公司；YEXpressTMYeast表达系统购自CLONTECH Laboratories，INC。流产胎儿脑组织由白求恩医科大学中日联谊医院妇产科提供。
1.2 hFGF13 cDNA的获得及重组pYEX4T-1-hFGF13质粒的构建 取流产胎儿脑组织约0.2克，用Trizol试剂提取细胞总RNA，经逆转录得到cDNA以此为模板，用FGF13特异性引物(5’端引物ATTAGAATTCATGGCGGCGGCTATCGCCAT；3’端引物ACAGGTCGACCTACGTTGATTCATTGTGGC)进行回收之后克隆入pCRTMⅡ质粒。用EcoR和SalⅠ双酶切pCRTMⅡ重组质粒，将释放出的特异性DNA片段次级克隆入pYEX4T-1质粒。用DNA测序仪对重组pYEX4T-1质粒内的外源基因进行序列测定。
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1.3 hFGF13基因在酵母中表达 将重组pYEX4T-1-hFGF13质粒转染酵母细胞DY150，筛选阳性转化菌进行培养。当培养物的OD600值达到0.8～1.2时，加入5 μl 1 mol/L CuSO4进行诱导，诱导1 h后收集细胞。
1.4 表达产物的SDS-PAGE鉴定 550×g离心5 min以收集诱导的酵母细胞。弃上清，重悬细胞沉淀于1 ml冰预冷的50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，10 000 r/min 离心1 min。弃上清，向细胞沉淀中加入75 μl酵母裂解缓冲液(50 mmol/L pH8.0的Tris-HCl，0.1% Triton-100，0.5% SDS)。剧烈震荡30 s，冰上放置1 min，重复5次。加入75μl 2×SDS凝胶加样缓冲液，煮沸5 min。10 000 r/min 离心1 min，将上清转移至另一管中，取适量进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色后观察。
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1.5 表达产物的Western-blot鉴定 通过电转移法将经过SDS-PAGE分离的蛋白转移到硝酸纤维素膜上。以兔源抗谷胱甘肽转移酶(GST)的多克隆抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记的驴抗兔抗体为二抗，二氨基联苯胺为显色底物进行Western-blot分析[3]。
1.6 表达产物的粗提 收集经过诱导的酵母细胞，重悬于2 ml裂解液(50 mmol/L Tris-HCl pH8.0；1 mmol/L EDTA；100 mmol/L NaCl；1 mmol/L PMSF)。超声破碎细胞2 min。10 000 r/min 离心2 min。将上清转移至透析袋内，置0.01 mol/L pH7.2的PBS溶液中透析24 h，后用蔗糖反透析2 h，再置生理盐水内透析24 h。
1.7 表达产物的活性测定 用含0.5%小牛血清的IMDM培养液在96孔板内培养NIH3T3细胞，每孔约5×104个细胞，37℃培养24 h。加入粗提的酵母表达产物100 μl，同时设立阴性对照、空白对照以及拮抗实验。分别采用MTT法和 3 H-TdR掺入法测定NIH3T3细胞的增殖情况。
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2 结果
2.1 hFGF13 cDNA的获得及重组pYEX4T-1-hFGF13质粒的构建 自流产胎儿脑组织提取总RNA，将其逆转录成cDNA。用2个hFGF13特异性引物做PCR。取PCR产物做2%琼脂糖凝胶电泳，放大的特异性cDNA片段大小约760 bp，与预期的片段长度相符(图1A)。将得到的特异性cDNA克隆入pCRTMⅡ质粒，EcoRⅠ酶切鉴定筛选阳性重组质粒。由于hFGF13 cDNA序列内含两个PstⅠ酶切点，因此用PstⅠ酶可将hFGF13 cDNA切割为251、322、165 bp 3个片段，据此可进一步鉴定此片段的正确性。经PstⅠ和EcoRⅠ酶切重组pCRTMⅡ质粒，在琼脂糖凝胶电泳显示有170、250、320 bp 3条区带，这与预测的一致，更证实了此片段的正确性。将此片段次级克隆入pYEX4T-1质粒，EcoR和SalⅠ双酶切鉴定筛选阳性重组质粒(图1B)。用DNA序列分析仪对重组pYEX4T-1质粒中的外源片段进行测序。结果表明，我们所获得的cDNA片段与已发表的FGF13cDNA的序列完全相符。
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图1 hFGF13特异性cDNA的琼脂糖凝胶电泳分析
Fig.1 Electrophoretic analysis of hFGF13 cDNA
Note:(A)1.DL2 000 DNA marker; 2.RT-PCR product amplified by hFGF13 specific primer;(B) 1.recombinant pYEX4T-1 hFGF13 plamid digested with EcoR Ⅰ and Sal Ⅰ; 2.DL 2000 DNA marker
图2 hFGF13在酵母中表达产物的SDS-PAGE分析鉴定
Fig.2 SDS-PAGE analysis of the expressed protein of pYEX4T-1-hFGF13 recombinant plasmid-contained yeast cell
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Note:1.induced by Cu++;2.uninduced; 3.protein marker 2.2 hFGF13基因在酵母细胞中表达产物的SDS-PAGE和Western-blot分析 用pYEX4T-hFGF13重组质粒转染酵母细胞，筛选阳性转化菌进行培养，硫酸铜诱导表达。细胞裂解物的SDS-PAGE结果显示，经诱导和未经诱导的酵母细胞裂解物在经考马斯亮蓝染色的凝胶上形成的区带无明显差异(图 2)。这有2种可能：①人FGF13在此酵母表达系统中的表达量较低，造成区带颜色甚浅或被其他同分子量的蛋白区带所掩盖而难以分辨；②hFGF13根本没有得到表达。为进一步明确FGF13在酵母细胞中是否得到表达，我们采用同样的标本做Western-blot，经硫酸铜诱导组的酵母细胞表达一分子量约为58 kD的特异性蛋白质。GST的分子量为27 kD，FGF13的分子量为31 kD，58 kD正是GST-FGF13融合蛋白的预期分子量。由此可见，FGF-hFGF13 cDNA在酵母中以GST融合蛋白的形式得到了表达(图略)。
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2.3 hFGF13基因在酵母细胞中表达产物的活性测定 将hFGF13在酵母中的表达产物超声裂解后，经透析得到重组hFGF13粗提物，分别通过MTT法和 3 H掺入法测定其活性(图 3)。结果表明，重组hFGF13对成纤维细胞NIH3T3有一定的促有丝分裂作用，而且这种作用能被FGFR 1的细胞外段所拮抗。说明酵母中表达了具有功能活性的FGF13蛋白，而且此蛋白能与FGFR1特异性结合。
图3 表达FGFG13的酵母细胞的粗提物的活性测定
Fig.3 The mitogenic activity of dialyzed products released from ultrasonic-lysed yeasts containing hFGF13-pYEX4T-1 recombinant plasmid on 3T3 cells
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Note:A.3H-thymidine inorporation assays；B.MTT assays
3 讨论
迄今为止，关于FGF13的文章甚少，其生物学活性尚不清楚。Helge Hartung等用 35 S标记的小鼠FGF13 cDNA为探针对小鼠胚胎进行原位杂交，发现FGF13在胚胎期的中枢神经系统和外周神经系统都有表达，在脊神经节、脑神经节及肠道神经系统中表达程度尤高[2]，这提示FGF13在神经系统的发育过程中可能发挥重要作用。我们用酵母细胞表达了人FGF13融合蛋白，这种融合蛋白可促进小鼠NIH3T3细胞的增殖，此活性可被重组FGFR1细胞外段拮抗。我们的结果表明：①人FGF13和其它的FGF一样可刺激成纤维细胞的增殖，因此它在体内可能表现促进损伤修复的功效；②人FGF13通过作用FGFR1而发挥促进成纤维细胞增殖的生物学活性。我们将对人FGF的生物学活性进行进一步的研究。
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本课题受国家自然科学基金(批准号3957019)和香港求是基金会资助
作者简介：孙 蒙，男，29岁，在读免疫学博士；
指导教师：于永利，男，45岁，教授，博士导师
4 参考文献
[1]Nishimura T, Utsunomiya Y, Hoshikawa M et al.Structure and expression of a novel human FGF,FGF-19 expressed in the fetal brain. Biochim Biophys Acta，1999;1444(1):148
[2]Helge Hartung,Ben jamin feldman,Heike Lovec et al. Murine FGF-12 and FGF13:expression in embryonic neruous system,connective tissue and heart. Mechanisms Development，1997；(64)：31
[3]金冬雁，黎孟枫，侯云德et al译.分子克隆实验指南.北京：科学出版社，1996：888-897
[收稿1999-11-28 修回2000-04-24], http://www.100md.com