细胞因子受体的信号传导
作者：张 平1 综述 章崇杰1审阅3s, http://www.100md.com
单位：华西医科大学免疫学教研室 成都 6100413s, http://www.100md.com
关键词：3s, http://www.100md.com
免疫学杂志990118 摘 要 以低渗沉淀方法制备的豚鼠血清功能纯C1及人血清为实验材料，建立C2溶血活性检测方法，经CM-Sephadex C50离子交换色谱分离纯化豚鼠血清功能纯C2分子。经鉴定，所得功能纯C2具有良好活性，无C1及C3～C9活性成份，可用于体外组装经典途径C3转化酶。本工作为进一步研究经典途径C3转化酶的补体调控蛋白奠定了基础。3s, http://www.100md.com
中图号 Q513s, http://www.100md.com
PREPARATION AND IDENTIFICATION OF THE FUNCTIONA-LLY PURE C2 IN GUINEA-PIG SERUM3s, http://www.100md.com
Zou Qiang， Xie Peirong， Zheng Ping3s, http://www.100md.com
(Department of Immunology，The Third Military Medical University， Chongqing 400038)3s, http://www.100md.com
Abstract Haemolytic assays for the second component of complement was established by using human fresh serum and functionally pure C1gp prepared by euglobulin precipitatoin. Functionally pure C2 without C1 and C3～C9 activity was prepared by ion-exchange chromatography on CM-Sephadex C50. Assembly of the classical pathway C3 convertase in vitro using functionally pure gp-C1， gp-C2 and EAC4hu enable us to further investigate the function of complement regulatory proteins.
Key words Guinea-pig， C2， Preparationyee, 百拇医药
目前发现的多种补体调控蛋白均可作用于经典途径C3转化酶，从而调节补体系统的活化。这些蛋白包括：衰变加速因子(decay-accelerating factor， DAF)、CR1、膜辅蛋白(membrane cofactor protein， MCP)及C4结合蛋白(C4 binding protein， C4bp)等[1]。为检测他们的调控作用，均需建立体外组装经典途径C3转化酶(C4bC2a)的方法。为此制备纯化的C1及C2分子是先决条件。yee, 百拇医药
人血清C2分子也可用于组装C3转化酶，但C4huC2hu极易衰变，很不稳定，其半衰期小于1min[2]，而C4gpC2hu则完全没有裂解C3的作用。相比较而言，C4huC2gp要稳定得多，其活性是C4huC2hu的10倍[3]，且对人及豚鼠C3均有裂解作用，因而豚鼠C2成为首选的实验材料。本文利用低渗沉淀优球蛋白的方法制备豚鼠血清功能纯C1，在此基础上建立C2活性检测方法，经CM-Sephadex C50分离纯化假球蛋白中的C2分子，所得功能纯C2可在体外形成较稳定的经典途径C3转化酶。yee, 百拇医药
1 材料与方法yee, 百拇医药
1.1 主要试剂 溶血素为本室制备；PMSF购自E.Merck；CM-Sephadex C50为Pharmaica产品；豚鼠血清及绵羊红细胞由本校动物中心提供。正常新鲜人血清购自西南医院。溶血反应所需巴比妥缓冲液DGVB2+及EDTA-GVB均按文献[4]配制。豚鼠血清1∶30稀释于40mmol EDTA-GVB(C-EDTA)作为C3～C9的来源。yee, 百拇医药
1.2 微量CH50的测定 参照文献[5]方法，将反应总体积确定为300μl，所有操作在清洁的旧酶联板或小塑料管中进行。酶联板检测仪(Bio-Red，Model 3550)测定波长415nm处的光密度值(OD415)。yee, 百拇医药
1.3 豚鼠血清C2溶血活性检测方法的建立
1.3.1 低渗沉淀优球蛋白：按文献[3]方法，所得优球蛋白经37°C孵育30min激活C1后即为功能纯C1。所得假球蛋白备作功能纯C2的来源。%., http://www.100md.com
1.3.2 EAC4的制备：参照文献[6]进行。溶血素致敏的绵羊红细胞(EA，5×108/ml)与饱和用量优球蛋白溶液30°C孵育15min，制成EAC1。另取饱和用量新鲜人血清稀释于4倍体积的EDTA-GVB，与EAC1混匀，在冰水浴中孵育20min。所得EAC4经EDTA-GVB洗涤3次后37°C继续孵育10min，以促使残留C1及C2分子衰变。调整细胞浓度至5×108/ml，重悬于DGVB2+备用。%., http://www.100md.com
1.3.3 功能纯C1及EAC4的鉴定：15μl EAC4与饱和用量优球蛋白分别稀释于37.5μl DGVB2+，混匀后30°C孵育15min，加入饱和用量假球蛋白(事先用DGVB2+调整体积至75μl)，30°C共同孵育5min，继续加入C-EDTA150μl，37°C孵育1h。测定每管溶血率。对照管则分别以DGVB2+替代优球蛋白及假球蛋白，以EDTA-GVB替代C-EDTA。具体设置见表1。%., http://www.100md.com
表1 功能纯C1及EAC4的鉴定%., http://www.100md.com
Tab 1 Identification of functionally pure C1 and intermediate EAC4hu%., http://www.100md.com
Test%., http://www.100md.com
tube%., http://www.100md.com
Control 1%., http://www.100md.com
Control 2%., http://www.100md.com
Control 3%., http://www.100md.com
Control 4%., http://www.100md.com
Control 5%., http://www.100md.com
EAC4%., http://www.100md.com
15μl%., http://www.100md.com
15μl?[, 百拇医药
15μl?[, 百拇医药
15μl?[, 百拇医药
15μl?[, 百拇医药
15μl?[, 百拇医药
Euglobulin?[, 百拇医药
0.15μl?[, 百拇医药
0.15μl?[, 百拇医药
—?[, 百拇医药
—?[, 百拇医药
0.15μl?[, 百拇医药
—?[, 百拇医药
Pseudoglobulin?[, 百拇医药
20μl?[, 百拇医药
20μl?[, 百拇医药
20μl?[, 百拇医药
20μl?[, 百拇医药
—?[, 百拇医药
—?[, 百拇医药
C-EDTA?[, 百拇医药
150μl?[, 百拇医药
—?[, 百拇医药
150μl?[, 百拇医药
—?[, 百拇医药
150μl?[, 百拇医药
150?[, 百拇医药
EDTA-GVB?[, 百拇医药
—?[, 百拇医药
150μl?[, 百拇医药
—?[, 百拇医药
150μl
—4q, 百拇医药
—4q, 百拇医药
Hemolysis(%)4q, 百拇医药
96.34q, 百拇医药
95.54q, 百拇医药
144q, 百拇医药
124q, 百拇医药
2.14q, 百拇医药
2.34q, 百拇医药
1.3.4 EAC14的制备：将EAC4与饱和用量的功能纯C1混匀，30°C孵育15min。离心后重悬于DGVB2+，调整细胞浓度至1×108/ml。所得EAC14须立即使用。4q, 百拇医药
1.3.5 洗脱液中C2分子溶血活性的检测：取10μl分部收集的洗脱液稀释于215μl DGVB2+，与75μl EAC14在30°C2共同孵育5min。离心后每管弃上清150μl，与150μl C-EDTA37°C继续孵育1h，测定每管溶血率。4q, 百拇医药
1.4 豚鼠血清功能纯C2分子的制备[3] 假球蛋白在含有1mmol EDTA的平衡液(0.1mol PB，pH6.0)中透析过夜，加至已充分平衡的CM-Sephadx C-50(10cm×2.5cm)离子交换柱，夹闭2h后，以200ml平衡液淋洗，除去未结合的蛋白质。接着进行0.1～0.25mol PB缓冲液(pH6.0)线性梯度洗脱。所有平衡液及洗脱液中均含有5mmol PMSF以减少蛋白水解的发生。流速为4～8ml/min。分部收集，2ml/管。逐管检测洗脱液中C2活性及波长280nm处的光密度(OD280)，并将具有C2活性的组份合并，即得功能纯C2。4q, 百拇医药
1.5 豚鼠血清功能纯C2分子的鉴定4q, 百拇医药
1.5.1 C2溶血滴定测定[4]：75μl倍比稀释的功能纯C2与75μl EAC14混匀，在30°C摇床中共同孵育5min，再分别加入150μl C-EDTA继续孵育1h，测定每管上清OD415，计算每毫升功能纯C2中所含溶血位点形成单位(Site forming units， SFU)。
1.5.2 C3转化酶的组装及自发性衰变：EAC14与稀释于等体积DGVB2+中的功能纯C2分别预温至37°C，迅速混匀，每隔一定时间取出混和液150μl，与150μl C-EDTA在37°C继续孵育1h。测定每管溶血率。&|, 百拇医药
2 结果&|, 百拇医药
2.1 豚鼠血清C2溶血活性检测方法的建立&|, 百拇医药
2.1.1 功能纯C1及EAC4 鉴定：C2溶血活性检测方法的基础是制备功能纯C1及溶血中间体EAC4。为鉴定优球蛋白中C1活性和EAC4的活性及其是否残留C1及C2，我们设置了多组对照，观察各管的溶血百分率。表1的结果显示，所得优球蛋白中明确具有C1活性(对照2，3)；EAC4中间体无残留C2分子(对照4，5)；假球蛋白中不仅有C2活性，尚有C3～C9活性(对照1)；对照2，3中有少量溶血发生，其原因可能是EAC4或假球蛋白中残留少量C1。无论是上述哪一种情况，少量C1的残存都对C2活性检测没有影响。&|, 百拇医药
2.1.2 C2溶血活性检测方法敏感性实验：为估计检测方法的敏感性，我们将不同稀释度的假球蛋白与EAC4反应来模拟洗脱液中C2活性的检测。从图1可见，0.04μl的假球蛋白即可导致15μl EAC4 60%的溶血率，完全可以满足分离纯化时检测的要求。
&|, 百拇医药
图1 假球蛋白中C2溶血活性的测定&|, 百拇医药
Fig 1 Plot of haemolytic titration for C2 in&|, 百拇医药
pseuduoglobin&|, 百拇医药
2.2 豚鼠血清功能纯C2分子的制备 假球蛋白溶液中通常含有10%～20%的C1活性[7]，因而在作进一步的纯化前，首先在假球蛋白中加入EDTA，阻止残余C1或其他酯酶对C4和C2的水解作用。假球蛋白在CM-Sephadex C-50中的洗脱情况见图2。C2通常在梯度的中段被洗脱，位于蛋白峰的下降支，说明已得到部份纯化。
&|, 百拇医药
图2 CM-Sephadex C50色谱分离功能纯C2
Fig 2 Chromatography of functionally pure C2 on CMsephadex C50j, 百拇医药
2.3 豚鼠功能纯C2分子的鉴定j, 百拇医药
2.3.1 功能纯C2溶血滴度测定：结果表明，随功能纯C2用量的增加溶血率逐步增加，呈明确的剂量效应关系(见图3)，经换算，其滴度为10 996SFU/ml，具有良好的溶血活性。
j, 百拇医药
图3 豚鼠功能纯C2溶血滴度的测定j, 百拇医药
Fig 3 Titration of functionally pure guinea-pigC2j, 百拇医药
2.3.2 功能纯C2纯度鉴定：为了解功能纯C2中是否残留C1及C3～C9，我们在测定C2溶血滴度时，分别以DGVB2+替代优球蛋白及功能纯C2，以EDTA-GVB替代C-EDTA设置了3个对照组(见表2)，实验结果显示：功能纯的C2制品中不含有C3～C9的活性(对照1)；其中残留C1的活性也明显低于假球蛋白，而EAC4中无残留C1(对照3)。j, 百拇医药
表2 功能纯C2中的C1、C3～C9活性的检测j, 百拇医药
Tab 2 Detection of C1，C3～C9 activity in functionally pure C2j, 百拇医药
Test tubej, 百拇医药
Control 1j, 百拇医药
Control 2j, 百拇医药
Control 3j, 百拇医药
Euglobulinj, 百拇医药
0.15μlj, 百拇医药
0.15μlj, 百拇医药
0.15μlj, 百拇医药
—
EAC471z?f#0, 百拇医药
15μl71z?f#0, 百拇医药
15μl71z?f#0, 百拇医药
15μl71z?f#0, 百拇医药
15μl71z?f#0, 百拇医药
C271z?f#0, 百拇医药
1μl71z?f#0, 百拇医药
1μl71z?f#0, 百拇医药
—71z?f#0, 百拇医药
1μl71z?f#0, 百拇医药
C-EDTA71z?f#0, 百拇医药
100μl71z?f#0, 百拇医药
—71z?f#0, 百拇医药
100μl71z?f#0, 百拇医药
100μl71z?f#0, 百拇医药
EDTA-GVB71z?f#0, 百拇医药
—71z?f#0, 百拇医药
100μl71z?f#0, 百拇医药
—71z?f#0, 百拇医药
—71z?f#0, 百拇医药
Hemolysis(%)71z?f#0, 百拇医药
99.571z?f#0, 百拇医药
2.071z?f#0, 百拇医药
2.571z?f#0, 百拇医药
2.671z?f#0, 百拇医药
2.3.3 C3转化酶的组装及自发性衰变：EAC1gp4hu2gp在37°C的组装及自发性衰变过程见图4，从中可以看出，EAC14与C2混和后迅速组装成EAC142，约在7min达高峰，以后随时间推移而自发性衰变，表现出与生理条件下的经典途径C3转化酶相同的特性。
图4 EAC1gp4hu2gp的组装及自发性衰变过程ttr, 百拇医药
Fig 4 Assembly and decay of EAC1gp4hu2gpttr, 百拇医药
3 讨论ttr, 百拇医药
CH50的检测是判定血清补体总活性的经典方法，单一补体成份以及补体调节蛋白的活性检测方法均在此基础上建立，因而是所有补体溶血实验的基础。经典的操作在试管中进行[4]，用分光光度计测定光密度。采用微量CH50测定法[5]，可节省试剂用量，并在提高检测精确性的基础上简化操作步骤，缩短操作时间。我们在所有的补体溶血活性实验中都采用了这种微量测定方法。但在操作中需注意，由于酶联板热传导性差，如果反应需要在10min内完成或添加新的试剂，则应在小塑料试管中进行，否则影响反应进程，且酶联板周围孔与中间孔的结果有明显差别。另外，使用酶联板进行较长时间孵育时，须每隔20min振荡一次，以保证红细胞处于悬浮状态。ttr, 百拇医药
检测C2溶血活性的方法有两种：一是将致敏的绵羊红细胞与纯化的C4及Cls按一定的比例和顺序混合，形成EAC14，再加入含C2的待检样品及C-EDTA[2]；另一种方法是制备可在较长时间内保存的EAC4中间体，检测时再加入C1、待检样品和C-EDTA。前者操作简便，但需要纯化的C1及C4分子，后者只需功能纯C1及含有C4的全血清即可，但不易控制批间差异。我们根据本室条件和后续实验的要求，选用了后一种方法。通过对每一个环节的质量控制，最终也获得了满意的结果。ttr, 百拇医药
EAC4的制备过程中，需要确定优球蛋白及人血清的用量，为此我们使用了“饱和用量”的概念。以人血清用量的确定为例，首先用微量CH50方法测定所用人血清的CH50单位，即可导致一定数量绵羊红细胞50%溶破所需的人血清的用量。再以5倍CH50单位作为针对单位数量绵羊红细胞的饱和用量。对于优球蛋白，由于它是从豚鼠血清经低渗沉淀所得，考虑到分离过程中可能发生的活性丢失，以优球蛋白相应豚鼠血清10倍CH50单位作为优球蛋白的饱和用量。“饱和用量”概念的引入，使我们虽然不能准确测定C1及C4滴度，也能制备高活性的EAC4，不失为一种简易可行的技术路线。ttr, 百拇医药
所谓“功能纯C2”的含义是：①不含有C1及C4，不能自发形成EAC1gp4gp2gp；②不含有C3～C9的活性，即形成后必须补加C-EDTA才能导致靶细胞的溶破。对功能纯C2分子鉴定的结果表明，本实验所采用的技术方法是完全可行的，所得高活性的C2分子符合功能纯要求；功能纯C1、C2及EAC4共同形成的EAC1gp4hu2gp可模拟生理条件下的经典途径C3转化酶。这为我们建立C3转化酶衰变加速活性的检测方法奠定了良好基础。
由于人和豚鼠C2分子的高度同源性及其在理化性质上的相似性，同样的分离方法也可用于人血清中功能纯C2分子的纯化。在本实验所建立的C2活性检测方法，无须作任何更改即可用于人血清C2分子的检测。稍加改变，得到的功能纯C1、C2分子及EAC4还可用于检测人血清及豚鼠血清中的C1或C4分子。因而具有较广泛的应用价值。g, 百拇医药
*国家自然科学基金资助项目(39500031)g, 百拇医药
第一作者：男，28岁，博士g, 百拇医药
参考文献g, 百拇医药
[1] Morgan BP.Complement regulatory molecules：application to therapy and transplantation. Immunol Today， 1995，16：257g, 百拇医药
[2] Kerr MA.The human complemant system：assembly of the classical pathway C3 convertase. J Biochem，1980， 189：173g, 百拇医药
[3] Kerr MA， Gagnon J.The purification and properties of the second compoent of guinea pig complement. J Biochem，1982，205：59g, 百拇医药
[4] Harrison RA，Lachmann PJ.Complement technology. In： Weir DM， Herzenberg LA， Blackwell C， eds. Handbook of experimental immunology. Oxford： Blackwell Scientific Publication Ltd， 1986g, 百拇医药
[5] 白 云，朱锡华.微量反应性溶血测定法.免疫学杂志，1994，10：127g, 百拇医药
[6] Borsos T，Rapp HJ.Immune hemolysis： a simplified method for the preparation of EAC4 with guinea pig or with human complement. J Immunol， 1967，99：263g, 百拇医药
[7] Gigli I，Porter RR，Sim RB. The unactivated form of the first component of human complement， C1. J Biochem，1976，157：541g, 百拇医药
(1998-05-18收稿；1998-08-23修回)(张 平1 综述 章崇杰1审阅)
单位：华西医科大学免疫学教研室 成都 6100413s, http://www.100md.com
关键词：3s, http://www.100md.com
免疫学杂志990118 摘 要 以低渗沉淀方法制备的豚鼠血清功能纯C1及人血清为实验材料，建立C2溶血活性检测方法，经CM-Sephadex C50离子交换色谱分离纯化豚鼠血清功能纯C2分子。经鉴定，所得功能纯C2具有良好活性，无C1及C3～C9活性成份，可用于体外组装经典途径C3转化酶。本工作为进一步研究经典途径C3转化酶的补体调控蛋白奠定了基础。3s, http://www.100md.com
中图号 Q513s, http://www.100md.com
PREPARATION AND IDENTIFICATION OF THE FUNCTIONA-LLY PURE C2 IN GUINEA-PIG SERUM3s, http://www.100md.com
Zou Qiang， Xie Peirong， Zheng Ping3s, http://www.100md.com
(Department of Immunology，The Third Military Medical University， Chongqing 400038)3s, http://www.100md.com
Abstract Haemolytic assays for the second component of complement was established by using human fresh serum and functionally pure C1gp prepared by euglobulin precipitatoin. Functionally pure C2 without C1 and C3～C9 activity was prepared by ion-exchange chromatography on CM-Sephadex C50. Assembly of the classical pathway C3 convertase in vitro using functionally pure gp-C1， gp-C2 and EAC4hu enable us to further investigate the function of complement regulatory proteins.
Key words Guinea-pig， C2， Preparationyee, 百拇医药
目前发现的多种补体调控蛋白均可作用于经典途径C3转化酶，从而调节补体系统的活化。这些蛋白包括：衰变加速因子(decay-accelerating factor， DAF)、CR1、膜辅蛋白(membrane cofactor protein， MCP)及C4结合蛋白(C4 binding protein， C4bp)等[1]。为检测他们的调控作用，均需建立体外组装经典途径C3转化酶(C4bC2a)的方法。为此制备纯化的C1及C2分子是先决条件。yee, 百拇医药
人血清C2分子也可用于组装C3转化酶，但C4huC2hu极易衰变，很不稳定，其半衰期小于1min[2]，而C4gpC2hu则完全没有裂解C3的作用。相比较而言，C4huC2gp要稳定得多，其活性是C4huC2hu的10倍[3]，且对人及豚鼠C3均有裂解作用，因而豚鼠C2成为首选的实验材料。本文利用低渗沉淀优球蛋白的方法制备豚鼠血清功能纯C1，在此基础上建立C2活性检测方法，经CM-Sephadex C50分离纯化假球蛋白中的C2分子，所得功能纯C2可在体外形成较稳定的经典途径C3转化酶。yee, 百拇医药
1 材料与方法yee, 百拇医药
1.1 主要试剂 溶血素为本室制备；PMSF购自E.Merck；CM-Sephadex C50为Pharmaica产品；豚鼠血清及绵羊红细胞由本校动物中心提供。正常新鲜人血清购自西南医院。溶血反应所需巴比妥缓冲液DGVB2+及EDTA-GVB均按文献[4]配制。豚鼠血清1∶30稀释于40mmol EDTA-GVB(C-EDTA)作为C3～C9的来源。yee, 百拇医药
1.2 微量CH50的测定 参照文献[5]方法，将反应总体积确定为300μl，所有操作在清洁的旧酶联板或小塑料管中进行。酶联板检测仪(Bio-Red，Model 3550)测定波长415nm处的光密度值(OD415)。yee, 百拇医药
1.3 豚鼠血清C2溶血活性检测方法的建立
1.3.1 低渗沉淀优球蛋白：按文献[3]方法，所得优球蛋白经37°C孵育30min激活C1后即为功能纯C1。所得假球蛋白备作功能纯C2的来源。%., http://www.100md.com
1.3.2 EAC4的制备：参照文献[6]进行。溶血素致敏的绵羊红细胞(EA，5×108/ml)与饱和用量优球蛋白溶液30°C孵育15min，制成EAC1。另取饱和用量新鲜人血清稀释于4倍体积的EDTA-GVB，与EAC1混匀，在冰水浴中孵育20min。所得EAC4经EDTA-GVB洗涤3次后37°C继续孵育10min，以促使残留C1及C2分子衰变。调整细胞浓度至5×108/ml，重悬于DGVB2+备用。%., http://www.100md.com
1.3.3 功能纯C1及EAC4的鉴定：15μl EAC4与饱和用量优球蛋白分别稀释于37.5μl DGVB2+，混匀后30°C孵育15min，加入饱和用量假球蛋白(事先用DGVB2+调整体积至75μl)，30°C共同孵育5min，继续加入C-EDTA150μl，37°C孵育1h。测定每管溶血率。对照管则分别以DGVB2+替代优球蛋白及假球蛋白，以EDTA-GVB替代C-EDTA。具体设置见表1。%., http://www.100md.com
表1 功能纯C1及EAC4的鉴定%., http://www.100md.com
Tab 1 Identification of functionally pure C1 and intermediate EAC4hu%., http://www.100md.com
Test%., http://www.100md.com
tube%., http://www.100md.com
Control 1%., http://www.100md.com
Control 2%., http://www.100md.com
Control 3%., http://www.100md.com
Control 4%., http://www.100md.com
Control 5%., http://www.100md.com
EAC4%., http://www.100md.com
15μl%., http://www.100md.com
15μl?[, 百拇医药
15μl?[, 百拇医药
15μl?[, 百拇医药
15μl?[, 百拇医药
15μl?[, 百拇医药
Euglobulin?[, 百拇医药
0.15μl?[, 百拇医药
0.15μl?[, 百拇医药
—?[, 百拇医药
—?[, 百拇医药
0.15μl?[, 百拇医药
—?[, 百拇医药
Pseudoglobulin?[, 百拇医药
20μl?[, 百拇医药
20μl?[, 百拇医药
20μl?[, 百拇医药
20μl?[, 百拇医药
—?[, 百拇医药
—?[, 百拇医药
C-EDTA?[, 百拇医药
150μl?[, 百拇医药
—?[, 百拇医药
150μl?[, 百拇医药
—?[, 百拇医药
150μl?[, 百拇医药
150?[, 百拇医药
EDTA-GVB?[, 百拇医药
—?[, 百拇医药
150μl?[, 百拇医药
—?[, 百拇医药
150μl
—4q, 百拇医药
—4q, 百拇医药
Hemolysis(%)4q, 百拇医药
96.34q, 百拇医药
95.54q, 百拇医药
144q, 百拇医药
124q, 百拇医药
2.14q, 百拇医药
2.34q, 百拇医药
1.3.4 EAC14的制备：将EAC4与饱和用量的功能纯C1混匀，30°C孵育15min。离心后重悬于DGVB2+，调整细胞浓度至1×108/ml。所得EAC14须立即使用。4q, 百拇医药
1.3.5 洗脱液中C2分子溶血活性的检测：取10μl分部收集的洗脱液稀释于215μl DGVB2+，与75μl EAC14在30°C2共同孵育5min。离心后每管弃上清150μl，与150μl C-EDTA37°C继续孵育1h，测定每管溶血率。4q, 百拇医药
1.4 豚鼠血清功能纯C2分子的制备[3] 假球蛋白在含有1mmol EDTA的平衡液(0.1mol PB，pH6.0)中透析过夜，加至已充分平衡的CM-Sephadx C-50(10cm×2.5cm)离子交换柱，夹闭2h后，以200ml平衡液淋洗，除去未结合的蛋白质。接着进行0.1～0.25mol PB缓冲液(pH6.0)线性梯度洗脱。所有平衡液及洗脱液中均含有5mmol PMSF以减少蛋白水解的发生。流速为4～8ml/min。分部收集，2ml/管。逐管检测洗脱液中C2活性及波长280nm处的光密度(OD280)，并将具有C2活性的组份合并，即得功能纯C2。4q, 百拇医药
1.5 豚鼠血清功能纯C2分子的鉴定4q, 百拇医药
1.5.1 C2溶血滴定测定[4]：75μl倍比稀释的功能纯C2与75μl EAC14混匀，在30°C摇床中共同孵育5min，再分别加入150μl C-EDTA继续孵育1h，测定每管上清OD415，计算每毫升功能纯C2中所含溶血位点形成单位(Site forming units， SFU)。
1.5.2 C3转化酶的组装及自发性衰变：EAC14与稀释于等体积DGVB2+中的功能纯C2分别预温至37°C，迅速混匀，每隔一定时间取出混和液150μl，与150μl C-EDTA在37°C继续孵育1h。测定每管溶血率。&|, 百拇医药
2 结果&|, 百拇医药
2.1 豚鼠血清C2溶血活性检测方法的建立&|, 百拇医药
2.1.1 功能纯C1及EAC4 鉴定：C2溶血活性检测方法的基础是制备功能纯C1及溶血中间体EAC4。为鉴定优球蛋白中C1活性和EAC4的活性及其是否残留C1及C2，我们设置了多组对照，观察各管的溶血百分率。表1的结果显示，所得优球蛋白中明确具有C1活性(对照2，3)；EAC4中间体无残留C2分子(对照4，5)；假球蛋白中不仅有C2活性，尚有C3～C9活性(对照1)；对照2，3中有少量溶血发生，其原因可能是EAC4或假球蛋白中残留少量C1。无论是上述哪一种情况，少量C1的残存都对C2活性检测没有影响。&|, 百拇医药
2.1.2 C2溶血活性检测方法敏感性实验：为估计检测方法的敏感性，我们将不同稀释度的假球蛋白与EAC4反应来模拟洗脱液中C2活性的检测。从图1可见，0.04μl的假球蛋白即可导致15μl EAC4 60%的溶血率，完全可以满足分离纯化时检测的要求。
&|, 百拇医药图1 假球蛋白中C2溶血活性的测定&|, 百拇医药
Fig 1 Plot of haemolytic titration for C2 in&|, 百拇医药
pseuduoglobin&|, 百拇医药
2.2 豚鼠血清功能纯C2分子的制备 假球蛋白溶液中通常含有10%～20%的C1活性[7]，因而在作进一步的纯化前，首先在假球蛋白中加入EDTA，阻止残余C1或其他酯酶对C4和C2的水解作用。假球蛋白在CM-Sephadex C-50中的洗脱情况见图2。C2通常在梯度的中段被洗脱，位于蛋白峰的下降支，说明已得到部份纯化。
&|, 百拇医药图2 CM-Sephadex C50色谱分离功能纯C2
Fig 2 Chromatography of functionally pure C2 on CMsephadex C50j, 百拇医药
2.3 豚鼠功能纯C2分子的鉴定j, 百拇医药
2.3.1 功能纯C2溶血滴度测定：结果表明，随功能纯C2用量的增加溶血率逐步增加，呈明确的剂量效应关系(见图3)，经换算，其滴度为10 996SFU/ml，具有良好的溶血活性。
j, 百拇医药图3 豚鼠功能纯C2溶血滴度的测定j, 百拇医药
Fig 3 Titration of functionally pure guinea-pigC2j, 百拇医药
2.3.2 功能纯C2纯度鉴定：为了解功能纯C2中是否残留C1及C3～C9，我们在测定C2溶血滴度时，分别以DGVB2+替代优球蛋白及功能纯C2，以EDTA-GVB替代C-EDTA设置了3个对照组(见表2)，实验结果显示：功能纯的C2制品中不含有C3～C9的活性(对照1)；其中残留C1的活性也明显低于假球蛋白，而EAC4中无残留C1(对照3)。j, 百拇医药
表2 功能纯C2中的C1、C3～C9活性的检测j, 百拇医药
Tab 2 Detection of C1，C3～C9 activity in functionally pure C2j, 百拇医药
Test tubej, 百拇医药
Control 1j, 百拇医药
Control 2j, 百拇医药
Control 3j, 百拇医药
Euglobulinj, 百拇医药
0.15μlj, 百拇医药
0.15μlj, 百拇医药
0.15μlj, 百拇医药
—
EAC471z?f#0, 百拇医药
15μl71z?f#0, 百拇医药
15μl71z?f#0, 百拇医药
15μl71z?f#0, 百拇医药
15μl71z?f#0, 百拇医药
C271z?f#0, 百拇医药
1μl71z?f#0, 百拇医药
1μl71z?f#0, 百拇医药
—71z?f#0, 百拇医药
1μl71z?f#0, 百拇医药
C-EDTA71z?f#0, 百拇医药
100μl71z?f#0, 百拇医药
—71z?f#0, 百拇医药
100μl71z?f#0, 百拇医药
100μl71z?f#0, 百拇医药
EDTA-GVB71z?f#0, 百拇医药
—71z?f#0, 百拇医药
100μl71z?f#0, 百拇医药
—71z?f#0, 百拇医药
—71z?f#0, 百拇医药
Hemolysis(%)71z?f#0, 百拇医药
99.571z?f#0, 百拇医药
2.071z?f#0, 百拇医药
2.571z?f#0, 百拇医药
2.671z?f#0, 百拇医药
2.3.3 C3转化酶的组装及自发性衰变：EAC1gp4hu2gp在37°C的组装及自发性衰变过程见图4，从中可以看出，EAC14与C2混和后迅速组装成EAC142，约在7min达高峰，以后随时间推移而自发性衰变，表现出与生理条件下的经典途径C3转化酶相同的特性。
图4 EAC1gp4hu2gp的组装及自发性衰变过程ttr, 百拇医药
Fig 4 Assembly and decay of EAC1gp4hu2gpttr, 百拇医药
3 讨论ttr, 百拇医药
CH50的检测是判定血清补体总活性的经典方法，单一补体成份以及补体调节蛋白的活性检测方法均在此基础上建立，因而是所有补体溶血实验的基础。经典的操作在试管中进行[4]，用分光光度计测定光密度。采用微量CH50测定法[5]，可节省试剂用量，并在提高检测精确性的基础上简化操作步骤，缩短操作时间。我们在所有的补体溶血活性实验中都采用了这种微量测定方法。但在操作中需注意，由于酶联板热传导性差，如果反应需要在10min内完成或添加新的试剂，则应在小塑料试管中进行，否则影响反应进程，且酶联板周围孔与中间孔的结果有明显差别。另外，使用酶联板进行较长时间孵育时，须每隔20min振荡一次，以保证红细胞处于悬浮状态。ttr, 百拇医药
检测C2溶血活性的方法有两种：一是将致敏的绵羊红细胞与纯化的C4及Cls按一定的比例和顺序混合，形成EAC14，再加入含C2的待检样品及C-EDTA[2]；另一种方法是制备可在较长时间内保存的EAC4中间体，检测时再加入C1、待检样品和C-EDTA。前者操作简便，但需要纯化的C1及C4分子，后者只需功能纯C1及含有C4的全血清即可，但不易控制批间差异。我们根据本室条件和后续实验的要求，选用了后一种方法。通过对每一个环节的质量控制，最终也获得了满意的结果。ttr, 百拇医药
EAC4的制备过程中，需要确定优球蛋白及人血清的用量，为此我们使用了“饱和用量”的概念。以人血清用量的确定为例，首先用微量CH50方法测定所用人血清的CH50单位，即可导致一定数量绵羊红细胞50%溶破所需的人血清的用量。再以5倍CH50单位作为针对单位数量绵羊红细胞的饱和用量。对于优球蛋白，由于它是从豚鼠血清经低渗沉淀所得，考虑到分离过程中可能发生的活性丢失，以优球蛋白相应豚鼠血清10倍CH50单位作为优球蛋白的饱和用量。“饱和用量”概念的引入，使我们虽然不能准确测定C1及C4滴度，也能制备高活性的EAC4，不失为一种简易可行的技术路线。ttr, 百拇医药
所谓“功能纯C2”的含义是：①不含有C1及C4，不能自发形成EAC1gp4gp2gp；②不含有C3～C9的活性，即形成后必须补加C-EDTA才能导致靶细胞的溶破。对功能纯C2分子鉴定的结果表明，本实验所采用的技术方法是完全可行的，所得高活性的C2分子符合功能纯要求；功能纯C1、C2及EAC4共同形成的EAC1gp4hu2gp可模拟生理条件下的经典途径C3转化酶。这为我们建立C3转化酶衰变加速活性的检测方法奠定了良好基础。
由于人和豚鼠C2分子的高度同源性及其在理化性质上的相似性，同样的分离方法也可用于人血清中功能纯C2分子的纯化。在本实验所建立的C2活性检测方法，无须作任何更改即可用于人血清C2分子的检测。稍加改变，得到的功能纯C1、C2分子及EAC4还可用于检测人血清及豚鼠血清中的C1或C4分子。因而具有较广泛的应用价值。g, 百拇医药
*国家自然科学基金资助项目(39500031)g, 百拇医药
第一作者：男，28岁，博士g, 百拇医药
参考文献g, 百拇医药
[1] Morgan BP.Complement regulatory molecules：application to therapy and transplantation. Immunol Today， 1995，16：257g, 百拇医药
[2] Kerr MA.The human complemant system：assembly of the classical pathway C3 convertase. J Biochem，1980， 189：173g, 百拇医药
[3] Kerr MA， Gagnon J.The purification and properties of the second compoent of guinea pig complement. J Biochem，1982，205：59g, 百拇医药
[4] Harrison RA，Lachmann PJ.Complement technology. In： Weir DM， Herzenberg LA， Blackwell C， eds. Handbook of experimental immunology. Oxford： Blackwell Scientific Publication Ltd， 1986g, 百拇医药
[5] 白 云，朱锡华.微量反应性溶血测定法.免疫学杂志，1994，10：127g, 百拇医药
[6] Borsos T，Rapp HJ.Immune hemolysis： a simplified method for the preparation of EAC4 with guinea pig or with human complement. J Immunol， 1967，99：263g, 百拇医药
[7] Gigli I，Porter RR，Sim RB. The unactivated form of the first component of human complement， C1. J Biochem，1976，157：541g, 百拇医药
(1998-05-18收稿；1998-08-23修回)(张 平1 综述 章崇杰1审阅)