IL-2在体内抗弓形虫作用机制的研究
作者：方艳秋1 谭 岩1 杨贵贞1w'(y\1, 百拇医药
单位：白求恩医科大学免疫学教研室，第一临床学院中心实验室 长春 130021w'(y\1, 百拇医药
关键词：弓形虫 NK细胞 LAK细胞 IL-2w'(y\1, 百拇医药
免疫学杂志990110 摘 要 为观察IL-2在小鼠体内抗弓形虫中的作用，应用3H-尿嘧啶(3H-U)特异性标记的弓形虫在小鼠腹腔巨噬细胞(Mouse peritoneal macrophage，MPM)内的增殖实验及125I-尿嘧啶核苷(125I-UdR)标记的细胞毒实验，观察IL-2的抗弓形虫作用。结果：IL-2对MPM的抗弓形虫作用及对IFN-γ诱导的MPM抗弓形虫作用无明显影响；IL-2体内应用可明显增强小鼠抗急性弓形虫感染的能力，延长小鼠生存时间；IL-2治疗组小鼠脾细胞杀伤肿瘤细胞及杀伤弓形虫自身感染靶细胞的能力，均明显高于对照组；同时也发现，对照组小鼠脾细胞几乎不能杀伤弓形虫感染的自体靶细胞。提示IL-2体内应用的抗弓形虫w'(y\1, 百拇医药
机制在于提高机体免疫细胞杀伤弓形虫感染细胞的能力。w'(y\1, 百拇医药
中图号 R531.8w'(y\1, 百拇医药
THE EFFECTS OF IL-2 AGAINST TOXOPLASMA GONDIIw'(y\1, 百拇医药
INFECTION IN VIVOw'(y\1, 百拇医药
Fang Yanqiu，Tan Yan，Yang Guizhenw'(y\1, 百拇医药
(Central Lab，First Hospital，Bethune University of Medical Sciences， Changchun 130021)w'(y\1, 百拇医药
Abstract In vitro，IL-2 did not induce the toxoplasmastatic activity of mouse peritoneal macrophage(MPM)combining with various concentrations of IFN-γ，IL-2 did not enhance these effector functions more than IFN-γ alone.However in vivo 700U IL-2 could made mice prolonge survival time compared with control mice after infection with 100 tachyzoites of RH strain(P<0.05).Studies on the protective mechanism demonstrated that IL-2 could significantly enhance the NK and LAK activity to kill tumor target cells and LAK activity to kill autologous spleen cells infected with Toxoplasma gondii but not NK activity.
Key words Toxoplasma gondii，NK cell，LAK cell，IL-2a&8n, 百拇医药
弓形虫是分布广泛的专性细胞内寄生原虫，其速殖子主要存在于急性感染的宿主细胞内，可以迅速增殖引起弓形虫病，如果妊娠期间母亲感染弓形虫，则常导致胎儿的流产、早产、甚至胎儿死亡；有弓形虫感染的胎儿出生后，常伴有先天性心脏病、眼病及智力发育不全等多种病症。弓形虫病的治疗，当前主要以乙胺嘧啶和磺胺类药物的联合应用为主，但副作用很大。因此，寻找新的替代疗法，已经成为临床急需解决的问题。1985年，Sharma等人首次报道了体内应用IL-2可以延长弓形虫感染小鼠生存时间，但至今其机制尚不清楚。本文通过体内外实验，探讨其作用机制。a&8n, 百拇医药
1 材料和方法a&8n, 百拇医药
1.1 实验动物、虫株及细胞 C57BL/6纯系雌性小鼠6～8周龄，购自白求恩医科大学实验动物部，经PCR检测试剂盒检测为弓形虫阴性；弓形虫RH株，为常用标准强毒株，小鼠腹腔传代；Yac-1细胞，白求恩医科大学基础医学院免疫教研室提供，10%小牛血清的IMDM培养液中，37°C，5%CO2传代培养。a&8n, 百拇医药
1.2 试剂 人重组IL-2(1×107U/ml)、小鼠重组IFN-γ(1×107U/ml)，均由德国MPG免疫研究所赠送，以无血清IMDM培养液稀释到所需浓度，经检测LPS含量低于可检测水平；125Ⅰ-UdR购于北京中国原子能研究所。a&8n, 百拇医药
1.3 弓形虫速殖子制备 速殖子1000个/ml，经腹腔接种到C57BL/6小鼠，2～3d后，收集腹腔液，离心、洗涤，过滤，纯化，以含10%小牛血清IMDM培养液配制成1×106个/ml浓度。a&8n, 百拇医药
1.4 MPM的制备 断颈处死小鼠，无菌剖腹，吸取腹腔液，离心，洗涤，去除非粘附细胞，收集MPM，调细胞浓度至1×105个/ml。a&8n, 百拇医药
1.5 弓形虫增殖实验 在96孔无菌细胞培养板中加入MPM(设3个复孔，每孔1×104/100μl)，再加入不同浓度细胞因子，5% CO2 37°C 24h，洗涤2次，加入弓形虫速殖子1×105/100μl，再培养2h后加入2.5μCi/50μl 3 H-U，继续培养16h，去除未摄入的3H-U及没有感染MPM的弓形虫速殖子(此时，被感染的MPM尚未开始溶解)，加0.1% SDS 100μl/孔，室温0.5h，加3mol的三氯乙酸50μl/孔。收集细胞，液闪测定，结果由cpm值表示，每次实验均设弓形虫阴性对照孔。
1.6 NK细胞杀伤活性测定[1] 弓形虫感染的小鼠淋巴母细胞制备：无菌制备小鼠脾细胞，细胞数为5×106/ml，加入ConA 5μg/ml，培养72h，去除休止期小淋巴细胞[2]，感染2h后分层离心去除未感染的弓形虫速殖子，光镜下观察感染率大于70%，可用作标记。标记方法同上。mr{&%, 百拇医药
1.7 LAK细胞活性测定 见文献[3]。mr{&%, 百拇医药
2 结果mr{&%, 百拇医药
2.1 IL-2对MPM及对IFN-γ诱导的MPM抗弓形虫作用的影响 用不同浓度的IL-2单独或与IFN-γ共同在弓形虫感染前24h处理MPM，观察弓形虫在MPM内的增殖情况(见图1)。结果表明，IL-2对弓形虫在MPM内增殖及对IFN-γ诱导的MPM抗弓形虫效应均无影响。
mr{&%, 百拇医药
图1 IL-2对MPM及IL-2对IFN-γ诱导的MPM抗弓形虫效应mr{&%, 百拇医药
Fig 1Effect of IL-2 and IL-2 on IFN-γ induced inhibition of T.gondii growth on MPMmr{&%, 百拇医药
2.2 IL-2对弓形虫感染小鼠存活时间的影响 将20只 C57BL/6小鼠随机分成2组，实验组自1×102个弓形虫感染前2d至感染后第4d，每天腹腔注射100U IL-2(0.1ml)，共700U，对照组注射等量的PBS，结果如图2。
mr{&%, 百拇医药
图2 IL-2对急性弓形虫感染小鼠生存时间的影响mr{&%, 百拇医药
Fig 2Effect of IL-2 on the survival time of T.gondii infected micemr{&%, 百拇医药
2.3 IL-2对急性弓形虫感染小鼠脾细胞杀伤活性的影响 在1×102个弓形虫感染小鼠前后-2d，-1d，0d，+1d，+2d，实验组小鼠每只每次注射100U IL-2(0.1ml)，对照组注射等量的PBS，感染后3d测小鼠脾细胞杀伤肿瘤细胞及受弓形虫感染的自身脾脏淋巴母细胞的能力，结果如表1。
表1 IL-2对急性弓形虫感染小鼠脾细胞杀伤活性的影响h&ahdq, 百拇医药
Tab 1 Effect of IL-2 on cytotoxic activity of murine spleen cells from acute T.gondii growth infected mice Yac-1h&ahdq, 百拇医药
T.gondii infected cellsh&ahdq, 百拇医药
E∶Th&ahdq, 百拇医药
0∶1h&ahdq, 百拇医药
50∶1h&ahdq, 百拇医药
100∶1h&ahdq, 百拇医药
0∶1h&ahdq, 百拇医药
50∶1h&ahdq, 百拇医药
100∶1h&ahdq, 百拇医药
Experimenth&ahdq, 百拇医药
2±0.4h&ahdq, 百拇医药
24±2.3h&ahdq, 百拇医药
50±3.7h&ahdq, 百拇医药
3.5±0.6h&ahdq, 百拇医药
18±2.1h&ahdq, 百拇医药
40±2.7h&ahdq, 百拇医药
Controlh&ahdq, 百拇医药
2±0.4h&ahdq, 百拇医药
9.8±0.9h&ahdq, 百拇医药
22.4±2.0h&ahdq, 百拇医药
3.5±0.6h&ahdq, 百拇医药
6.5±1.0h&ahdq, 百拇医药
9.4±1.2h&ahdq, 百拇医药
3 讨论h&ahdq, 百拇医药
IL-2在细胞免疫中起着重要的作用，它在体内外均能促进CTL细胞、NK细胞和LAK细胞的杀伤活性，临床上已经广泛地应用于肿瘤及某些微生物感染的治疗。本文应用体内外实验，对IL-2抗弓形虫机制进行了探讨。首先，观察体外IL-2单独或与IFN-γ联合应用对MPM内弓形虫增殖的影响，发现IL-2对弓形虫在MPM内的增殖及对IFN-γ诱导的MPM的抗弓形虫效应均无明显影响。提示：IL-2对MPM没有直接作用；另外IL-2具有促进Pre-NK细胞的成熟、调整CD3-.CD56+/CD3+.CD56-细胞比例、诱导LAK细胞产生的功能。因此，增强NK、LAK细胞对弓形虫的杀伤能力，也是目前为人们所瞩目的[4～6]。为此，我们进行了体内实验，在弓形虫急性感染小鼠前后，共注射700U IL-2，结果表明，IL-2能够明显增强小鼠抗急性弓形虫感染的能力，延长小鼠生存时间(P<0.05)；并且，IL-2治疗组小鼠脾细胞杀伤肿瘤细胞以及弓形虫感染自身细胞的能力，均明显高于对照组(P<0.001)；同时，对照组小鼠脾细胞几乎不能杀伤弓形虫感染的自身靶细胞。提示IL-2体内应用的抗弓形虫机制,可能与提高机体免疫细胞杀伤弓形虫感染细胞的能力有关。
第一作者：女，29岁，博士，助理研究员do, 百拇医药
参考文献do, 百拇医药
[1] 王江滨，谭 岩，宋国培.老年肿瘤患者外周血淋巴细胞的白细胞介素Ⅱ活性及其与自然杀伤细胞活性的关系.中国老年医学杂志，1992，11(4)：222do, 百拇医药
[2] 谭 岩，杨贵贞.人扁桃体白细胞介素-2的产生.中国免疫学杂志，1985，1(4)：6do, 百拇医药
[3] 谭 岩，王江滨.胃癌患者外周血淋巴因子活化性杀伤细胞活性测定及影响因素.中华内科杂志，1990，29(9)：550do, 百拇医药
[4] Hauser WE，Tsai V.Acute toxoplasma infection of mice induces spleen NK cells that are cytotoxic for T.gondii in vitro.J Immunol，1986，136∶313do, 百拇医药
[5] Goyal M，Ganguly NK，Mahajan RC.Natural killer cell cyto toxicity against toxoplasma gondii in acute and chronicmurine to xoplasmosis.Med Sci Res，1988，16：375do, 百拇医药
[6] Dannemann BR，Morris VA，Araujo FG，et al.Assessment of human natural killer and lymphokine activated killer cells cytotoxicity against toxoplasma gondii trphozoites and brain cysts.J Immunol，1989，143：2684do, 百拇医药
(1997-12-29收稿；1998-09-03修回)(方艳秋1 谭 岩1 杨贵贞1)
单位：白求恩医科大学免疫学教研室，第一临床学院中心实验室 长春 130021w'(y\1, 百拇医药
关键词：弓形虫 NK细胞 LAK细胞 IL-2w'(y\1, 百拇医药
免疫学杂志990110 摘 要 为观察IL-2在小鼠体内抗弓形虫中的作用，应用3H-尿嘧啶(3H-U)特异性标记的弓形虫在小鼠腹腔巨噬细胞(Mouse peritoneal macrophage，MPM)内的增殖实验及125I-尿嘧啶核苷(125I-UdR)标记的细胞毒实验，观察IL-2的抗弓形虫作用。结果：IL-2对MPM的抗弓形虫作用及对IFN-γ诱导的MPM抗弓形虫作用无明显影响；IL-2体内应用可明显增强小鼠抗急性弓形虫感染的能力，延长小鼠生存时间；IL-2治疗组小鼠脾细胞杀伤肿瘤细胞及杀伤弓形虫自身感染靶细胞的能力，均明显高于对照组；同时也发现，对照组小鼠脾细胞几乎不能杀伤弓形虫感染的自体靶细胞。提示IL-2体内应用的抗弓形虫w'(y\1, 百拇医药
机制在于提高机体免疫细胞杀伤弓形虫感染细胞的能力。w'(y\1, 百拇医药
中图号 R531.8w'(y\1, 百拇医药
THE EFFECTS OF IL-2 AGAINST TOXOPLASMA GONDIIw'(y\1, 百拇医药
INFECTION IN VIVOw'(y\1, 百拇医药
Fang Yanqiu，Tan Yan，Yang Guizhenw'(y\1, 百拇医药
(Central Lab，First Hospital，Bethune University of Medical Sciences， Changchun 130021)w'(y\1, 百拇医药
Abstract In vitro，IL-2 did not induce the toxoplasmastatic activity of mouse peritoneal macrophage(MPM)combining with various concentrations of IFN-γ，IL-2 did not enhance these effector functions more than IFN-γ alone.However in vivo 700U IL-2 could made mice prolonge survival time compared with control mice after infection with 100 tachyzoites of RH strain(P<0.05).Studies on the protective mechanism demonstrated that IL-2 could significantly enhance the NK and LAK activity to kill tumor target cells and LAK activity to kill autologous spleen cells infected with Toxoplasma gondii but not NK activity.
Key words Toxoplasma gondii，NK cell，LAK cell，IL-2a&8n, 百拇医药
弓形虫是分布广泛的专性细胞内寄生原虫，其速殖子主要存在于急性感染的宿主细胞内，可以迅速增殖引起弓形虫病，如果妊娠期间母亲感染弓形虫，则常导致胎儿的流产、早产、甚至胎儿死亡；有弓形虫感染的胎儿出生后，常伴有先天性心脏病、眼病及智力发育不全等多种病症。弓形虫病的治疗，当前主要以乙胺嘧啶和磺胺类药物的联合应用为主，但副作用很大。因此，寻找新的替代疗法，已经成为临床急需解决的问题。1985年，Sharma等人首次报道了体内应用IL-2可以延长弓形虫感染小鼠生存时间，但至今其机制尚不清楚。本文通过体内外实验，探讨其作用机制。a&8n, 百拇医药
1 材料和方法a&8n, 百拇医药
1.1 实验动物、虫株及细胞 C57BL/6纯系雌性小鼠6～8周龄，购自白求恩医科大学实验动物部，经PCR检测试剂盒检测为弓形虫阴性；弓形虫RH株，为常用标准强毒株，小鼠腹腔传代；Yac-1细胞，白求恩医科大学基础医学院免疫教研室提供，10%小牛血清的IMDM培养液中，37°C，5%CO2传代培养。a&8n, 百拇医药
1.2 试剂 人重组IL-2(1×107U/ml)、小鼠重组IFN-γ(1×107U/ml)，均由德国MPG免疫研究所赠送，以无血清IMDM培养液稀释到所需浓度，经检测LPS含量低于可检测水平；125Ⅰ-UdR购于北京中国原子能研究所。a&8n, 百拇医药
1.3 弓形虫速殖子制备 速殖子1000个/ml，经腹腔接种到C57BL/6小鼠，2～3d后，收集腹腔液，离心、洗涤，过滤，纯化，以含10%小牛血清IMDM培养液配制成1×106个/ml浓度。a&8n, 百拇医药
1.4 MPM的制备 断颈处死小鼠，无菌剖腹，吸取腹腔液，离心，洗涤，去除非粘附细胞，收集MPM，调细胞浓度至1×105个/ml。a&8n, 百拇医药
1.5 弓形虫增殖实验 在96孔无菌细胞培养板中加入MPM(设3个复孔，每孔1×104/100μl)，再加入不同浓度细胞因子，5% CO2 37°C 24h，洗涤2次，加入弓形虫速殖子1×105/100μl，再培养2h后加入2.5μCi/50μl 3 H-U，继续培养16h，去除未摄入的3H-U及没有感染MPM的弓形虫速殖子(此时，被感染的MPM尚未开始溶解)，加0.1% SDS 100μl/孔，室温0.5h，加3mol的三氯乙酸50μl/孔。收集细胞，液闪测定，结果由cpm值表示，每次实验均设弓形虫阴性对照孔。
1.6 NK细胞杀伤活性测定[1] 弓形虫感染的小鼠淋巴母细胞制备：无菌制备小鼠脾细胞，细胞数为5×106/ml，加入ConA 5μg/ml，培养72h，去除休止期小淋巴细胞[2]，感染2h后分层离心去除未感染的弓形虫速殖子，光镜下观察感染率大于70%，可用作标记。标记方法同上。mr{&%, 百拇医药
1.7 LAK细胞活性测定 见文献[3]。mr{&%, 百拇医药
2 结果mr{&%, 百拇医药
2.1 IL-2对MPM及对IFN-γ诱导的MPM抗弓形虫作用的影响 用不同浓度的IL-2单独或与IFN-γ共同在弓形虫感染前24h处理MPM，观察弓形虫在MPM内的增殖情况(见图1)。结果表明，IL-2对弓形虫在MPM内增殖及对IFN-γ诱导的MPM抗弓形虫效应均无影响。
mr{&%, 百拇医药图1 IL-2对MPM及IL-2对IFN-γ诱导的MPM抗弓形虫效应mr{&%, 百拇医药
Fig 1Effect of IL-2 and IL-2 on IFN-γ induced inhibition of T.gondii growth on MPMmr{&%, 百拇医药
2.2 IL-2对弓形虫感染小鼠存活时间的影响 将20只 C57BL/6小鼠随机分成2组，实验组自1×102个弓形虫感染前2d至感染后第4d，每天腹腔注射100U IL-2(0.1ml)，共700U，对照组注射等量的PBS，结果如图2。
mr{&%, 百拇医药图2 IL-2对急性弓形虫感染小鼠生存时间的影响mr{&%, 百拇医药
Fig 2Effect of IL-2 on the survival time of T.gondii infected micemr{&%, 百拇医药
2.3 IL-2对急性弓形虫感染小鼠脾细胞杀伤活性的影响 在1×102个弓形虫感染小鼠前后-2d，-1d，0d，+1d，+2d，实验组小鼠每只每次注射100U IL-2(0.1ml)，对照组注射等量的PBS，感染后3d测小鼠脾细胞杀伤肿瘤细胞及受弓形虫感染的自身脾脏淋巴母细胞的能力，结果如表1。
表1 IL-2对急性弓形虫感染小鼠脾细胞杀伤活性的影响h&ahdq, 百拇医药
Tab 1 Effect of IL-2 on cytotoxic activity of murine spleen cells from acute T.gondii growth infected mice Yac-1h&ahdq, 百拇医药
T.gondii infected cellsh&ahdq, 百拇医药
E∶Th&ahdq, 百拇医药
0∶1h&ahdq, 百拇医药
50∶1h&ahdq, 百拇医药
100∶1h&ahdq, 百拇医药
0∶1h&ahdq, 百拇医药
50∶1h&ahdq, 百拇医药
100∶1h&ahdq, 百拇医药
Experimenth&ahdq, 百拇医药
2±0.4h&ahdq, 百拇医药
24±2.3h&ahdq, 百拇医药
50±3.7h&ahdq, 百拇医药
3.5±0.6h&ahdq, 百拇医药
18±2.1h&ahdq, 百拇医药
40±2.7h&ahdq, 百拇医药
Controlh&ahdq, 百拇医药
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9.8±0.9h&ahdq, 百拇医药
22.4±2.0h&ahdq, 百拇医药
3.5±0.6h&ahdq, 百拇医药
6.5±1.0h&ahdq, 百拇医药
9.4±1.2h&ahdq, 百拇医药
3 讨论h&ahdq, 百拇医药
IL-2在细胞免疫中起着重要的作用，它在体内外均能促进CTL细胞、NK细胞和LAK细胞的杀伤活性，临床上已经广泛地应用于肿瘤及某些微生物感染的治疗。本文应用体内外实验，对IL-2抗弓形虫机制进行了探讨。首先，观察体外IL-2单独或与IFN-γ联合应用对MPM内弓形虫增殖的影响，发现IL-2对弓形虫在MPM内的增殖及对IFN-γ诱导的MPM的抗弓形虫效应均无明显影响。提示：IL-2对MPM没有直接作用；另外IL-2具有促进Pre-NK细胞的成熟、调整CD3-.CD56+/CD3+.CD56-细胞比例、诱导LAK细胞产生的功能。因此，增强NK、LAK细胞对弓形虫的杀伤能力，也是目前为人们所瞩目的[4～6]。为此，我们进行了体内实验，在弓形虫急性感染小鼠前后，共注射700U IL-2，结果表明，IL-2能够明显增强小鼠抗急性弓形虫感染的能力，延长小鼠生存时间(P<0.05)；并且，IL-2治疗组小鼠脾细胞杀伤肿瘤细胞以及弓形虫感染自身细胞的能力，均明显高于对照组(P<0.001)；同时，对照组小鼠脾细胞几乎不能杀伤弓形虫感染的自身靶细胞。提示IL-2体内应用的抗弓形虫机制,可能与提高机体免疫细胞杀伤弓形虫感染细胞的能力有关。
第一作者：女，29岁，博士，助理研究员do, 百拇医药
参考文献do, 百拇医药
[1] 王江滨，谭 岩，宋国培.老年肿瘤患者外周血淋巴细胞的白细胞介素Ⅱ活性及其与自然杀伤细胞活性的关系.中国老年医学杂志，1992，11(4)：222do, 百拇医药
[2] 谭 岩，杨贵贞.人扁桃体白细胞介素-2的产生.中国免疫学杂志，1985，1(4)：6do, 百拇医药
[3] 谭 岩，王江滨.胃癌患者外周血淋巴因子活化性杀伤细胞活性测定及影响因素.中华内科杂志，1990，29(9)：550do, 百拇医药
[4] Hauser WE，Tsai V.Acute toxoplasma infection of mice induces spleen NK cells that are cytotoxic for T.gondii in vitro.J Immunol，1986，136∶313do, 百拇医药
[5] Goyal M，Ganguly NK，Mahajan RC.Natural killer cell cyto toxicity against toxoplasma gondii in acute and chronicmurine to xoplasmosis.Med Sci Res，1988，16：375do, 百拇医药
[6] Dannemann BR，Morris VA，Araujo FG，et al.Assessment of human natural killer and lymphokine activated killer cells cytotoxicity against toxoplasma gondii trphozoites and brain cysts.J Immunol，1989，143：2684do, 百拇医药
(1997-12-29收稿；1998-09-03修回)(方艳秋1 谭 岩1 杨贵贞1)