一种提高单克隆抗体产量的简易方法
作者：郑 萍 邹 强%3;&}9\, 百拇医药
单位：第三军医大学免疫学教研室 重庆 400038%3;&}9\, 百拇医药
关键词：单克隆抗体 杂交瘤细胞 制备%3;&}9\, 百拇医药
免 疫 学 杂 志990321 摘 要 采用一种较常规培养法更简便且能提高产量的制备单克隆抗体的方法，即当杂交瘤细胞生长达90%～95%单层密度时加培养液至瓶颈，加塞置37°C孵箱直立式孵育8～10d后收集上清，用ELISA法测定单抗效价，结果较常规法产量提高8～14倍。%3;&}9\, 百拇医药
中图号 R392%3;&}9\, 百拇医药
A SIMPLE METHOD FOR HIGHER YIELDS OF MONOCLONAL ANTIBODY%3;&}9\, 百拇医药
Zheng Ping，Zou Qiang%3;&}9\, 百拇医药
(Department of Immunology，The Third Military Medical University，Chongqing 400038)%3;&}9\, 百拇医药
Abstract A simple approach was established for higher production of monoclonal antibody than routine culture method.When the hybridoma cells reach 90%～95% monolayer，the flasks are simply filled up to the neck with medium and left standing in the 37°C incubator with cap loosened until supernatant is harvested after 8～10 days.The titers of specific antibody in culture supernatants were tested by indirect ELISA，and the results indicate that the yields of antibody are 8-to 14-fold higher than routine horizontal culture method.%3;&}9\, 百拇医药
Key words Monoclonal antibody，Hybridoma，Produce\gv, 百拇医药
近年来单克隆抗体已广泛应用于基础理论与临床应用研究[1]。如何制备质量好产量高的单克隆抗体是当前各有关实验室研究的重要问题，通常用于生产单克隆抗体的方法有两种：①利用纯系小鼠生产免疫腹水，该法的优点是产量和效价高，但纯化困难，价格昂贵，生产周期长；②杂交瘤细胞常规体外培养法，此法虽然产量不高效价低，但不含正常小鼠免疫球蛋白，较易纯化且成本低，但此法若需大量生产则需特殊设备[2]。最近有人报道用杂交瘤细胞培养也可提高单克隆抗体的产量且方法简便[3]。经我们对3株抗人衰变加速因子(Decay-Accelerating Factor，DAF，CD55)单克隆抗体的制备和产量测定，获得较为满意的结果，现报道如下。\gv, 百拇医药
1 材料与方法\gv, 百拇医药
1.1 纯化抗原及抗体 纯化的可溶性重组DAF由英国Reading大学Goodfellow博士惠赠。抗人DAF单克隆抗体IC6培养上清(1μg/ml)由日本Fukushima医学院Fujita博士惠赠。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(工作浓度1∶1000)，购自中山生物制品有限公司。\gv, 百拇医药
1.2 培养基 RPMI 1640(Gibco产品)，含2mmol L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素和10%FCS。\gv, 百拇医药
1.3 杂交瘤细胞系 DA11、DG3、DG9杂交瘤细胞均由本实验室建立，经SP2/0与免疫小鼠脾细胞融合筛选而成，抗体亚类均为IgG1，能稳定分泌抗人DAF单克隆抗体[4]。\gv, 百拇医药
1.4 平卧式常规法培养 将DA11、DG3、DG9杂交瘤细胞用常规细胞培养法培养在25ml的方瓶中加培养液5ml，置37°C孵箱3～4d后，当瓶中只剩下少于5%有活力的细胞时离心收集上清，-20°C保存备用。\gv, 百拇医药
1.5 直立式培养 将DA11、DG3、DG9杂交瘤细胞常规培养在平卧式细胞培养瓶中直到细胞密度达90%～95%时，补充培养液至瓶颈(总量为30ml)，加橡皮塞直立式放置在37°C孵箱中，每天观察细胞并晃动1次，可见死细胞不断脱落至瓶底，活细胞继续增殖，直到培养液变酸后离心收集上清，-20°C保存备用。
1.6 标准曲线的制作 以不同浓度的IC6上清进行间接ELISA(具体步骤见1.7)，每一浓度重复3孔，测得OD值，进行回归分析，绘制标准曲线。uy4\+%, http://www.100md.com
1.7 单克隆抗体含量测定 采用间接ELISA法，具体步骤如下：(1)包被纯化人DAF于96孔ELISA板，50μl/孔，4°C，18～24h。(2)用0.02M PBS+0.05%Tween20(PBS-T)将板孔洗3次，3min/次，空干，加入不同浓度的鼠抗人DAF单克隆抗体上清，50μl/孔，37°C孵育50min。(3)同上洗涤，加入1∶1000羊抗鼠IgG酶标抗体，50μl/孔，37°C，50min。(4)同上洗涤，加入邻苯二胺-H2O2溶液37°C显色20min后，在BIO-RAD Model 3550自动酶联检测仪上选择490nm测OD值。平卧式与直立式培养收获的上清及IC6上清同时进行试验，以SP2/0骨髓瘤细胞上清作为阴性对照。根据标准曲线计算每种样品中的单抗含量。uy4\+%, http://www.100md.com
2 结果与讨论uy4\+%, http://www.100md.com
经统计学处理抗人DAF单克隆抗体IC6上清浓度在0.001～0.1μg/ml之间时，其含量与OD值呈线性关系(见图1)。分别将平卧式和直立式收获的
uy4\+%, http://www.100md.com
图 1 IC6上清标准曲线uy4\+%, http://www.100md.com
Fig 1Standard curves of supernatant of IC6uy4\+%, http://www.100md.com
细胞培养上清用间接ELISA法测定其效价及含量，结果3株杂交瘤细胞产生的抗人DAF单克隆抗体，其直立式培养上清的OD值均略高于平卧式培养的上清，将3株单克隆抗体的OD值从标准曲线上查得其含量，结果见表1。直立式比平卧式产量提高8～14倍，与Susan等的结果相符。直立式的特点是培养液用量多，且在生长过程中死亡细胞不断脱落至瓶底，表1 平卧式与直立式培养单抗产量比较uy4\+%, http://www.100md.com
Tab 1 Production of mAbs in horizontal and standing flask methods Cell lineuy4\+%, http://www.100md.com
Horizontal culture
Standing culture/ip, http://www.100md.com
Ig concentration/ip, http://www.100md.com
(μg/ml)/ip, http://www.100md.com
Total yiele/ip, http://www.100md.com
(μg/falsk)/ip, http://www.100md.com
Ig concentration/ip, http://www.100md.com
(μg/ml)/ip, http://www.100md.com
Total yiele/ip, http://www.100md.com
(μg/falsk)/ip, http://www.100md.com
DG3/ip, http://www.100md.com
22.97/ip, http://www.100md.com
114.85/ip, http://www.100md.com
35.89/ip, http://www.100md.com
1076.7/ip, http://www.100md.com
DG9/ip, http://www.100md.com
26.31/ip, http://www.100md.com
131.55/ip, http://www.100md.com
37.14/ip, http://www.100md.com
1114.2/ip, http://www.100md.com
DA11/ip, http://www.100md.com
26.91/ip, http://www.100md.com
134.55/ip, http://www.100md.com
65.45/ip, http://www.100md.com
1963.5/ip, http://www.100md.com
使培养瓶留出更多的空间供活细胞生长而继续分泌抗体；平卧式培养，则死亡细胞占据空间影响活细胞的分裂增殖，需传代后方能继续增殖，增加污染机会及工作量。/ip, http://www.100md.com
由于本法无需特殊设备、简便易行、节省人力物力，减少污染机会，一般实验室可推广应用。/ip, http://www.100md.com
第一作者：女，37岁，本科，实验师/ip, http://www.100md.com
参考文献/ip, http://www.100md.com
1 陆德源.现代免疫学.上海：上海科技出版社，1995.35/ip, http://www.100md.com
2 Jaspert R，Geske T，Teichmann A，et al.Laboratory scale production of monoclonal antibodies in a tumbling chamber.J Immunol Methods，1995，178：77/ip, http://www.100md.com
3 Susan Ker hwe Ou，Paul HP，Terson T.A more efficient and economical approach for monclonal antibody production.J Immunol Methods，1997，209：105/ip, http://www.100md.com
4 邹 强，谢佩蓉，郑 萍.抗人DAF单克隆抗体的制备及鉴定.免疫学杂志，1999，15(2)：122/ip, http://www.100md.com
(1999-03-02收稿；1999-04-20修回)(郑 萍 邹 强)
单位：第三军医大学免疫学教研室 重庆 400038%3;&}9\, 百拇医药
关键词：单克隆抗体 杂交瘤细胞 制备%3;&}9\, 百拇医药
免 疫 学 杂 志990321 摘 要 采用一种较常规培养法更简便且能提高产量的制备单克隆抗体的方法，即当杂交瘤细胞生长达90%～95%单层密度时加培养液至瓶颈，加塞置37°C孵箱直立式孵育8～10d后收集上清，用ELISA法测定单抗效价，结果较常规法产量提高8～14倍。%3;&}9\, 百拇医药
中图号 R392%3;&}9\, 百拇医药
A SIMPLE METHOD FOR HIGHER YIELDS OF MONOCLONAL ANTIBODY%3;&}9\, 百拇医药
Zheng Ping，Zou Qiang%3;&}9\, 百拇医药
(Department of Immunology，The Third Military Medical University，Chongqing 400038)%3;&}9\, 百拇医药
Abstract A simple approach was established for higher production of monoclonal antibody than routine culture method.When the hybridoma cells reach 90%～95% monolayer，the flasks are simply filled up to the neck with medium and left standing in the 37°C incubator with cap loosened until supernatant is harvested after 8～10 days.The titers of specific antibody in culture supernatants were tested by indirect ELISA，and the results indicate that the yields of antibody are 8-to 14-fold higher than routine horizontal culture method.%3;&}9\, 百拇医药
Key words Monoclonal antibody，Hybridoma，Produce\gv, 百拇医药
近年来单克隆抗体已广泛应用于基础理论与临床应用研究[1]。如何制备质量好产量高的单克隆抗体是当前各有关实验室研究的重要问题，通常用于生产单克隆抗体的方法有两种：①利用纯系小鼠生产免疫腹水，该法的优点是产量和效价高，但纯化困难，价格昂贵，生产周期长；②杂交瘤细胞常规体外培养法，此法虽然产量不高效价低，但不含正常小鼠免疫球蛋白，较易纯化且成本低，但此法若需大量生产则需特殊设备[2]。最近有人报道用杂交瘤细胞培养也可提高单克隆抗体的产量且方法简便[3]。经我们对3株抗人衰变加速因子(Decay-Accelerating Factor，DAF，CD55)单克隆抗体的制备和产量测定，获得较为满意的结果，现报道如下。\gv, 百拇医药
1 材料与方法\gv, 百拇医药
1.1 纯化抗原及抗体 纯化的可溶性重组DAF由英国Reading大学Goodfellow博士惠赠。抗人DAF单克隆抗体IC6培养上清(1μg/ml)由日本Fukushima医学院Fujita博士惠赠。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(工作浓度1∶1000)，购自中山生物制品有限公司。\gv, 百拇医药
1.2 培养基 RPMI 1640(Gibco产品)，含2mmol L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素和10%FCS。\gv, 百拇医药
1.3 杂交瘤细胞系 DA11、DG3、DG9杂交瘤细胞均由本实验室建立，经SP2/0与免疫小鼠脾细胞融合筛选而成，抗体亚类均为IgG1，能稳定分泌抗人DAF单克隆抗体[4]。\gv, 百拇医药
1.4 平卧式常规法培养 将DA11、DG3、DG9杂交瘤细胞用常规细胞培养法培养在25ml的方瓶中加培养液5ml，置37°C孵箱3～4d后，当瓶中只剩下少于5%有活力的细胞时离心收集上清，-20°C保存备用。\gv, 百拇医药
1.5 直立式培养 将DA11、DG3、DG9杂交瘤细胞常规培养在平卧式细胞培养瓶中直到细胞密度达90%～95%时，补充培养液至瓶颈(总量为30ml)，加橡皮塞直立式放置在37°C孵箱中，每天观察细胞并晃动1次，可见死细胞不断脱落至瓶底，活细胞继续增殖，直到培养液变酸后离心收集上清，-20°C保存备用。
1.6 标准曲线的制作 以不同浓度的IC6上清进行间接ELISA(具体步骤见1.7)，每一浓度重复3孔，测得OD值，进行回归分析，绘制标准曲线。uy4\+%, http://www.100md.com
1.7 单克隆抗体含量测定 采用间接ELISA法，具体步骤如下：(1)包被纯化人DAF于96孔ELISA板，50μl/孔，4°C，18～24h。(2)用0.02M PBS+0.05%Tween20(PBS-T)将板孔洗3次，3min/次，空干，加入不同浓度的鼠抗人DAF单克隆抗体上清，50μl/孔，37°C孵育50min。(3)同上洗涤，加入1∶1000羊抗鼠IgG酶标抗体，50μl/孔，37°C，50min。(4)同上洗涤，加入邻苯二胺-H2O2溶液37°C显色20min后，在BIO-RAD Model 3550自动酶联检测仪上选择490nm测OD值。平卧式与直立式培养收获的上清及IC6上清同时进行试验，以SP2/0骨髓瘤细胞上清作为阴性对照。根据标准曲线计算每种样品中的单抗含量。uy4\+%, http://www.100md.com
2 结果与讨论uy4\+%, http://www.100md.com
经统计学处理抗人DAF单克隆抗体IC6上清浓度在0.001～0.1μg/ml之间时，其含量与OD值呈线性关系(见图1)。分别将平卧式和直立式收获的
uy4\+%, http://www.100md.com图 1 IC6上清标准曲线uy4\+%, http://www.100md.com
Fig 1Standard curves of supernatant of IC6uy4\+%, http://www.100md.com
细胞培养上清用间接ELISA法测定其效价及含量，结果3株杂交瘤细胞产生的抗人DAF单克隆抗体，其直立式培养上清的OD值均略高于平卧式培养的上清，将3株单克隆抗体的OD值从标准曲线上查得其含量，结果见表1。直立式比平卧式产量提高8～14倍，与Susan等的结果相符。直立式的特点是培养液用量多，且在生长过程中死亡细胞不断脱落至瓶底，表1 平卧式与直立式培养单抗产量比较uy4\+%, http://www.100md.com
Tab 1 Production of mAbs in horizontal and standing flask methods Cell lineuy4\+%, http://www.100md.com
Horizontal culture
Standing culture/ip, http://www.100md.com
Ig concentration/ip, http://www.100md.com
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Total yiele/ip, http://www.100md.com
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Ig concentration/ip, http://www.100md.com
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Total yiele/ip, http://www.100md.com
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DG3/ip, http://www.100md.com
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DA11/ip, http://www.100md.com
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134.55/ip, http://www.100md.com
65.45/ip, http://www.100md.com
1963.5/ip, http://www.100md.com
使培养瓶留出更多的空间供活细胞生长而继续分泌抗体；平卧式培养，则死亡细胞占据空间影响活细胞的分裂增殖，需传代后方能继续增殖，增加污染机会及工作量。/ip, http://www.100md.com
由于本法无需特殊设备、简便易行、节省人力物力，减少污染机会，一般实验室可推广应用。/ip, http://www.100md.com
第一作者：女，37岁，本科，实验师/ip, http://www.100md.com
参考文献/ip, http://www.100md.com
1 陆德源.现代免疫学.上海：上海科技出版社，1995.35/ip, http://www.100md.com
2 Jaspert R，Geske T，Teichmann A，et al.Laboratory scale production of monoclonal antibodies in a tumbling chamber.J Immunol Methods，1995，178：77/ip, http://www.100md.com
3 Susan Ker hwe Ou，Paul HP，Terson T.A more efficient and economical approach for monclonal antibody production.J Immunol Methods，1997，209：105/ip, http://www.100md.com
4 邹 强，谢佩蓉，郑 萍.抗人DAF单克隆抗体的制备及鉴定.免疫学杂志，1999，15(2)：122/ip, http://www.100md.com
(1999-03-02收稿；1999-04-20修回)(郑 萍 邹 强)