应用Protein G纯化细胞培养上清中的大鼠单抗
作者：白 丽 Lindsay Dentz[+@?4, 百拇医药
单位：：白 丽 大理医学院微生物学及免疫学教研室 大理 671000；Lindsay Dent 澳大利亚阿得雷德大学微生物学及免疫学系，Adelaide 5005z[+@?4, 百拇医药
关键词：杂交瘤细胞株培养上清 大鼠单克隆抗体IgG 纯化 链球菌G蛋白 亲和层析z[+@?4, 百拇医药
免 疫 学 杂 志980320 摘 要 用miniPerm系统旋转连续培养大鼠杂交瘤细胞株，获得大量含抗鼠IL-4(IgG1)和IL-5(IgG1和IgG2a)抗体的培养上清；经PM10膜超滤、50%饱和硫酸铵沉淀及链球菌G蛋白-琼脂糖亲和层析纯化IgG单抗。结果每升杂交瘤细胞培养上清得到大鼠IgG22～36mg；1次可纯化抗体达20mg；经SDS-PAGE及ELISA鉴定，所得到的抗体纯度高、活性保持良好。z[+@?4, 百拇医药
中图号 R392-33z[+@?4, 百拇医药
PURIFICATION OF RAT MCABS FROM CULTURE SUPERNATANTS BY PROTEIN Gz[+@?4, 百拇医药
Bai Li，Lindsay Dentz[+@?4, 百拇医药
(Department of Microbiology ＆ Immunology，Dali Medical College，Dali 671000)z[+@?4, 百拇医药
Abstract A simple，three-step procedure to purify the rat IgG monoclonal antibodies from the hybridoma cell culture supernatants is described.We got a lot of the cell culture supernatants that contain rat anti-mouse IL-4(IgG1) and IL-5(IgG1 and IgG2a)monoclonal antibodies by using miniPerm System to culture rat hybridoma cells.In the first step，the supernatants are ultrafiltered with PM10 membrane.In the second，IgG fractions are precipitated with 50% of saturated ammonium sulfate.In the final，the monoclonal antibodies are purified by the high performance Protein G-Sepharose affinity column.The results show that we get IgG 22～36mg from 1 liter of the cell culture supernatants.The antibodies show a high purity and good activities monitored by SDS-PAGE and ELISA，respectively.About 20mg of antibody is obtained by only one purifying procedure.
Key words Hybridoma cell culture supernatant，Rat IgG monoclonal antibody，Purification，Streptococcus Protien G，Affinity chromatographye)cq, 百拇医药
小鼠是当代医学研究中十分重要的实验动物，而单克隆抗体(McAbs)的应用则是目前所有研究中十分活跃和引人注目的领域。无论是单抗在标本检测研究中的应用，还是在预防或治疗研究中的应用，高纯度单抗的获得均是将单抗应用于各种研究的关键，因此，单抗的纯化研究目前仍在不断的改进中。在各种动物来源的单克隆抗体中，大鼠单克隆抗体的纯化尤为困难，但其在小鼠动物模型中的应用却十分广泛。本文采用超滤、硫酸铵沉淀及链球菌G蛋白(Protein G)亲和层析等系列步骤，成功地从多株大鼠抗小鼠杂交瘤细胞培养上清中纯化大鼠IgG类单克隆抗体，取得了良好的效果。e)cq, 百拇医药
1 材料和方法e)cq, 百拇医药
1.1 含单克隆抗体上清的制备 所用杂交瘤细胞系大鼠11B11和BVD6(产生抗小鼠IL-4抗体)、TRFK4 和TRFK5(产生抗小鼠IL-5抗体)系实验室(Department of Immunology ＆ Microbiology，University of Adelaide，Australia)保存细胞株，其单抗属IgG1或IgG2a亚类。杂交瘤细胞株经复苏后用含10%FCS(Cytosystem，Australia)的RPMI-1640(GIBCO，USA)培养液(含15mmol Hepes，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素，2mmol/L谷氨酰胺)，在miniPerm(Heraeus，Gemeny)系统中旋转连续培养，至培养液变黄色后，收获培养液。e)cq, 百拇医药
1.2 单克隆抗体的初步纯化 使用PM10膜(Amicon，Danvers，USA)超滤浓缩含McAb培养上清10～20倍。浓缩上清经50%饱和硫酸胺(SAS)沉淀，4°C条件下经15 000r/min离心，用PBS溶解沉淀物，溶解液置PBS透析24h，其间换液6次。e)cq, 百拇医药
1.3 Protein G亲和层析纯化 按参考文献[1]进行，并作了部分改良，具体方法如下：e)cq, 百拇医药
1.3.1 配制缓冲液：起始缓冲液为pH7.0 20mmol/L磷酸缓冲液；洗脱缓冲液为pH2.7 0.1mmol/L甘氨酸盐酸。
1.3.2 准备收集管：取1.5ml离心管，每支离心管加70μl pH9.0 1mol/L Tris-HCl。pu]-*, 百拇医药
1.3.3 样品准备：经50% SAS沉淀得到的样品，置起始缓冲液进行透析过夜，并经0.22m微孔滤膜滤过。pu]-*, 百拇医药
1.3.4 纯化过程：用足够的起始缓冲液(8～10ml)平衡Protein G-琼脂糖亲和层析柱(HiTrap Protein G 1ml，Pharmacia Biotech)。取待纯化的样品(每毫升样品含蛋白10.2～21.1mg)15～25ml上柱，流速为0.5ml/min，然后以同样的流速依次用起始缓冲液7～8ml、洗脱缓冲液6～7ml、起始缓冲液5ml洗涤，每管1ml收集洗脱液，测每管OD280吸收值。收集第2洗脱峰(见图1)，BCA法(Sigma，USA)测蛋白含量，4°C保存备用。pu]-*, 百拇医药
1.4 纯度及活性鉴定 纯化的McAb用SDS-PAGE[2]鉴定其纯度。用10%分离胶、5%浓缩胶，设标准分子量(94KD，67KD，43KD，20.1KD及14.4KD)(Pharmacia)，恒流下电泳2h，考马斯亮蓝R250(Pharmacia)染色。纯化的McAb用双抗体夹心生物素-链霉亲和素ELISA法鉴定[3，4]。pu]-*, 百拇医药
2 结果pu]-*, 百拇医药
2.1 抗体纯化 含大鼠抗小鼠IL-5和IL-4的杂交瘤细胞培养上清经超滤法去除绝大部分液体及分子量<10KD的蛋白得到10～20倍浓缩的培养上清，后者经50%SAS沉淀后得到初提的大鼠IgG。最后用Protein G纯化，得到两个不同洗脱峰的曲线(见图1)，第1峰为非结合峰(杂蛋白)，第2峰即为所需的单克隆抗体峰，两峰间分离度良好。TRFK5细胞、11B11细胞和BVD6细胞产生的IgG1与TRFK4细胞产生的IgG2a纯化时得到的洗脱曲线类似。
pu]-*, 百拇医药
图 1用Protein G纯化大鼠单克隆抗体IgGpu]-*, 百拇医药
Fig 1Purification of monoclonal rat IgG using HiTrap Protein G
2.2 抗体纯度 还原性SDS-PAGE结果显示，经上述纯化过程纯化后的大鼠IgG1或IgG2a纯度好(见图2)，只出现清晰的免疫球蛋白重链和轻链两条带。
k)ekgtx, 百拇医药
图 2纯化的大鼠单克隆IgG抗体的SDS-PAGEk)ekgtx, 百拇医药
Fig 2SDS-PAGE electrophoresis of purified monoclonal rat IgGk)ekgtx, 百拇医药
Line A：Rat hybridoma cell culture supernatant，reduced，diluted 1∶10k)ekgtx, 百拇医药
Line B：Purified monoclonal rat IgG，reducedk)ekgtx, 百拇医药
Line C：Molecular markerk)ekgtx, 百拇医药
2.3 抗体活性 经双抗体夹心ELISA法证明TRFK4、TRFK5、11B11和BVD6抗体均有良好活性，测定样品的敏感性分别为IL-4 1.25U/ml及IL-5 30pg/ml。k)ekgtx, 百拇医药
2.4 Protein G柱交联量和重复性 我们用同一类型Protein G柱纯化大鼠抗小鼠细胞因子抗体约20次，发现当样品上样量足够时，1ml Protein G柱可交联抗体超过20mg，故1次纯化即可得到高质量大量抗体。该方法的重复性极佳(P<0.01)。k)ekgtx, 百拇医药
2.5 收获抗体量 TRFK4、TRFK5、11B11和BVD6杂交瘤细胞培养上清经上述系列方法纯化后，每升培养液可得到IgG分别为24～28mg、22～25mg、32～34mg和33.5～36mg。k)ekgtx, 百拇医药
3 讨论k)ekgtx, 百拇医药
大量的研究事实已经证明：亲和层析法纯化单抗是一种简单而有效的方法。过去常采用的是SPA亲和层析，但SPA对大鼠的各类Ig亲和力极低。本研究采用链球菌Protein G亲和层析纯化大鼠IgG1和IgG2a抗体，取得了良好的效果。Protein G为G组链球菌表面所具有的1种蛋白，它具有两个IgG结合位点，作为IgGFc受体能与IgGFc段结合，与SPA相比，能与更多种属的IgG结合，并对各种属IgG有更高的亲和性和更强的结合能力。除对大鼠IgG有高度亲和力外，对人各亚类IgG、兔、牛、马、山羊、绵羊、豚鼠、狗、猪、小鼠IgG均有很强的亲和力，故已被用于纯化多种McAb和各种多克隆IgG[5，6]。应用基因工程制备的Protein G，去除了天然Protein G与白蛋白结合的部位，故具有更高的特异性[1，7]。Protein G对pH的适应范围很广，可在pH2～10环境中保持良好活性。当pH7.0时，Protein G与IgG的结合最强，当pH为2.5～3.0时，IgG可被洗脱[1]。Protein G与Ig的结合能力主要取决于Ig的来源，也受流速、样品中Ig浓度影响。本研究结果表明，每毫升Protein G-琼脂糖可结合超过20mg的大鼠IgG，上样量可达25ml，因此，采用本方法1次可纯化大量IgG。在纯化过程中应注意的是，经冷藏或冷冻后含单抗的样品，在上柱前须经0.22u滤膜过滤以去除不溶性聚合物，否则会影响纯度，还有可能损坏层析柱。为了延长Protein G柱的使用寿命，每次使用层析柱后，均应用足量的起始缓冲液充分洗涤，然后加入20%乙醇置4°C保存。综上所述，本文报道的纯化单克隆抗体的方法简单、稳定，重复性好，所需时间短；操作方便，不需特殊仪器；1次可处理大量样品，成本相对较低，抗体活性保存好，可作为大量制备大鼠IgG方法采用。
第一作者：女，40岁，医学硕士，副教授r#, 百拇医药
参考文献r#, 百拇医药
1 Pharmacia LKB Biotechnology.Affinity Chromatography：Principles and Methods.Sweden ：Pharmacia，1995：53～56r#, 百拇医药
2 Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T.Molecular Cloning：a Laboratory Manual.2nd ed.USA：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989：880～887r#, 百拇医药
3 Schumacher JH，OGarra A，Shrader B，et al.The cha-racterization of four monoclonal antibodies specific for mouse IL-5 and development of mouse and human IL-5 enzyme-linked immunosorbent.J Immunol，1988，141：1576r#, 百拇医药
4 Frendscho MH，Brown JF，Iizawa Y，et al.Administration of anti-IL-4 monoclonal antibody 11B11 increases the resistance of mice to listeria monocytogenes infection.J Immunol，1992，148：3978r#, 百拇医药
5 Guss B，Eliasson M，Olsson A，et al.Structure of the IgG-binding regions of streptococcal protein G.EMBO J，1986，5：1567r#, 百拇医药
6 Akerstrom B，Brodin T，Reis K，et al.Protein G：a powerful tool for binding and detection of monoclonal and polyclonal antibodies.J Immunol，1985，135：2589r#, 百拇医药
7 Nygrem PA，Eliasson M，Palmcrantz E，et al.Analysis and use of serum albuming binding domains of streptococcal protein G.J Mol Recog，1988，69r#, 百拇医药
(1998-10-26收稿)(白 丽 Lindsay Dent)
单位：：白 丽 大理医学院微生物学及免疫学教研室 大理 671000；Lindsay Dent 澳大利亚阿得雷德大学微生物学及免疫学系，Adelaide 5005z[+@?4, 百拇医药
关键词：杂交瘤细胞株培养上清 大鼠单克隆抗体IgG 纯化 链球菌G蛋白 亲和层析z[+@?4, 百拇医药
免 疫 学 杂 志980320 摘 要 用miniPerm系统旋转连续培养大鼠杂交瘤细胞株，获得大量含抗鼠IL-4(IgG1)和IL-5(IgG1和IgG2a)抗体的培养上清；经PM10膜超滤、50%饱和硫酸铵沉淀及链球菌G蛋白-琼脂糖亲和层析纯化IgG单抗。结果每升杂交瘤细胞培养上清得到大鼠IgG22～36mg；1次可纯化抗体达20mg；经SDS-PAGE及ELISA鉴定，所得到的抗体纯度高、活性保持良好。z[+@?4, 百拇医药
中图号 R392-33z[+@?4, 百拇医药
PURIFICATION OF RAT MCABS FROM CULTURE SUPERNATANTS BY PROTEIN Gz[+@?4, 百拇医药
Bai Li，Lindsay Dentz[+@?4, 百拇医药
(Department of Microbiology ＆ Immunology，Dali Medical College，Dali 671000)z[+@?4, 百拇医药
Abstract A simple，three-step procedure to purify the rat IgG monoclonal antibodies from the hybridoma cell culture supernatants is described.We got a lot of the cell culture supernatants that contain rat anti-mouse IL-4(IgG1) and IL-5(IgG1 and IgG2a)monoclonal antibodies by using miniPerm System to culture rat hybridoma cells.In the first step，the supernatants are ultrafiltered with PM10 membrane.In the second，IgG fractions are precipitated with 50% of saturated ammonium sulfate.In the final，the monoclonal antibodies are purified by the high performance Protein G-Sepharose affinity column.The results show that we get IgG 22～36mg from 1 liter of the cell culture supernatants.The antibodies show a high purity and good activities monitored by SDS-PAGE and ELISA，respectively.About 20mg of antibody is obtained by only one purifying procedure.
Key words Hybridoma cell culture supernatant，Rat IgG monoclonal antibody，Purification，Streptococcus Protien G，Affinity chromatographye)cq, 百拇医药
小鼠是当代医学研究中十分重要的实验动物，而单克隆抗体(McAbs)的应用则是目前所有研究中十分活跃和引人注目的领域。无论是单抗在标本检测研究中的应用，还是在预防或治疗研究中的应用，高纯度单抗的获得均是将单抗应用于各种研究的关键，因此，单抗的纯化研究目前仍在不断的改进中。在各种动物来源的单克隆抗体中，大鼠单克隆抗体的纯化尤为困难，但其在小鼠动物模型中的应用却十分广泛。本文采用超滤、硫酸铵沉淀及链球菌G蛋白(Protein G)亲和层析等系列步骤，成功地从多株大鼠抗小鼠杂交瘤细胞培养上清中纯化大鼠IgG类单克隆抗体，取得了良好的效果。e)cq, 百拇医药
1 材料和方法e)cq, 百拇医药
1.1 含单克隆抗体上清的制备 所用杂交瘤细胞系大鼠11B11和BVD6(产生抗小鼠IL-4抗体)、TRFK4 和TRFK5(产生抗小鼠IL-5抗体)系实验室(Department of Immunology ＆ Microbiology，University of Adelaide，Australia)保存细胞株，其单抗属IgG1或IgG2a亚类。杂交瘤细胞株经复苏后用含10%FCS(Cytosystem，Australia)的RPMI-1640(GIBCO，USA)培养液(含15mmol Hepes，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素，2mmol/L谷氨酰胺)，在miniPerm(Heraeus，Gemeny)系统中旋转连续培养，至培养液变黄色后，收获培养液。e)cq, 百拇医药
1.2 单克隆抗体的初步纯化 使用PM10膜(Amicon，Danvers，USA)超滤浓缩含McAb培养上清10～20倍。浓缩上清经50%饱和硫酸胺(SAS)沉淀，4°C条件下经15 000r/min离心，用PBS溶解沉淀物，溶解液置PBS透析24h，其间换液6次。e)cq, 百拇医药
1.3 Protein G亲和层析纯化 按参考文献[1]进行，并作了部分改良，具体方法如下：e)cq, 百拇医药
1.3.1 配制缓冲液：起始缓冲液为pH7.0 20mmol/L磷酸缓冲液；洗脱缓冲液为pH2.7 0.1mmol/L甘氨酸盐酸。
1.3.2 准备收集管：取1.5ml离心管，每支离心管加70μl pH9.0 1mol/L Tris-HCl。pu]-*, 百拇医药
1.3.3 样品准备：经50% SAS沉淀得到的样品，置起始缓冲液进行透析过夜，并经0.22m微孔滤膜滤过。pu]-*, 百拇医药
1.3.4 纯化过程：用足够的起始缓冲液(8～10ml)平衡Protein G-琼脂糖亲和层析柱(HiTrap Protein G 1ml，Pharmacia Biotech)。取待纯化的样品(每毫升样品含蛋白10.2～21.1mg)15～25ml上柱，流速为0.5ml/min，然后以同样的流速依次用起始缓冲液7～8ml、洗脱缓冲液6～7ml、起始缓冲液5ml洗涤，每管1ml收集洗脱液，测每管OD280吸收值。收集第2洗脱峰(见图1)，BCA法(Sigma，USA)测蛋白含量，4°C保存备用。pu]-*, 百拇医药
1.4 纯度及活性鉴定 纯化的McAb用SDS-PAGE[2]鉴定其纯度。用10%分离胶、5%浓缩胶，设标准分子量(94KD，67KD，43KD，20.1KD及14.4KD)(Pharmacia)，恒流下电泳2h，考马斯亮蓝R250(Pharmacia)染色。纯化的McAb用双抗体夹心生物素-链霉亲和素ELISA法鉴定[3，4]。pu]-*, 百拇医药
2 结果pu]-*, 百拇医药
2.1 抗体纯化 含大鼠抗小鼠IL-5和IL-4的杂交瘤细胞培养上清经超滤法去除绝大部分液体及分子量<10KD的蛋白得到10～20倍浓缩的培养上清，后者经50%SAS沉淀后得到初提的大鼠IgG。最后用Protein G纯化，得到两个不同洗脱峰的曲线(见图1)，第1峰为非结合峰(杂蛋白)，第2峰即为所需的单克隆抗体峰，两峰间分离度良好。TRFK5细胞、11B11细胞和BVD6细胞产生的IgG1与TRFK4细胞产生的IgG2a纯化时得到的洗脱曲线类似。
pu]-*, 百拇医药图 1用Protein G纯化大鼠单克隆抗体IgGpu]-*, 百拇医药
Fig 1Purification of monoclonal rat IgG using HiTrap Protein G
2.2 抗体纯度 还原性SDS-PAGE结果显示，经上述纯化过程纯化后的大鼠IgG1或IgG2a纯度好(见图2)，只出现清晰的免疫球蛋白重链和轻链两条带。
k)ekgtx, 百拇医药图 2纯化的大鼠单克隆IgG抗体的SDS-PAGEk)ekgtx, 百拇医药
Fig 2SDS-PAGE electrophoresis of purified monoclonal rat IgGk)ekgtx, 百拇医药
Line A：Rat hybridoma cell culture supernatant，reduced，diluted 1∶10k)ekgtx, 百拇医药
Line B：Purified monoclonal rat IgG，reducedk)ekgtx, 百拇医药
Line C：Molecular markerk)ekgtx, 百拇医药
2.3 抗体活性 经双抗体夹心ELISA法证明TRFK4、TRFK5、11B11和BVD6抗体均有良好活性，测定样品的敏感性分别为IL-4 1.25U/ml及IL-5 30pg/ml。k)ekgtx, 百拇医药
2.4 Protein G柱交联量和重复性 我们用同一类型Protein G柱纯化大鼠抗小鼠细胞因子抗体约20次，发现当样品上样量足够时，1ml Protein G柱可交联抗体超过20mg，故1次纯化即可得到高质量大量抗体。该方法的重复性极佳(P<0.01)。k)ekgtx, 百拇医药
2.5 收获抗体量 TRFK4、TRFK5、11B11和BVD6杂交瘤细胞培养上清经上述系列方法纯化后，每升培养液可得到IgG分别为24～28mg、22～25mg、32～34mg和33.5～36mg。k)ekgtx, 百拇医药
3 讨论k)ekgtx, 百拇医药
大量的研究事实已经证明：亲和层析法纯化单抗是一种简单而有效的方法。过去常采用的是SPA亲和层析，但SPA对大鼠的各类Ig亲和力极低。本研究采用链球菌Protein G亲和层析纯化大鼠IgG1和IgG2a抗体，取得了良好的效果。Protein G为G组链球菌表面所具有的1种蛋白，它具有两个IgG结合位点，作为IgGFc受体能与IgGFc段结合，与SPA相比，能与更多种属的IgG结合，并对各种属IgG有更高的亲和性和更强的结合能力。除对大鼠IgG有高度亲和力外，对人各亚类IgG、兔、牛、马、山羊、绵羊、豚鼠、狗、猪、小鼠IgG均有很强的亲和力，故已被用于纯化多种McAb和各种多克隆IgG[5，6]。应用基因工程制备的Protein G，去除了天然Protein G与白蛋白结合的部位，故具有更高的特异性[1，7]。Protein G对pH的适应范围很广，可在pH2～10环境中保持良好活性。当pH7.0时，Protein G与IgG的结合最强，当pH为2.5～3.0时，IgG可被洗脱[1]。Protein G与Ig的结合能力主要取决于Ig的来源，也受流速、样品中Ig浓度影响。本研究结果表明，每毫升Protein G-琼脂糖可结合超过20mg的大鼠IgG，上样量可达25ml，因此，采用本方法1次可纯化大量IgG。在纯化过程中应注意的是，经冷藏或冷冻后含单抗的样品，在上柱前须经0.22u滤膜过滤以去除不溶性聚合物，否则会影响纯度，还有可能损坏层析柱。为了延长Protein G柱的使用寿命，每次使用层析柱后，均应用足量的起始缓冲液充分洗涤，然后加入20%乙醇置4°C保存。综上所述，本文报道的纯化单克隆抗体的方法简单、稳定，重复性好，所需时间短；操作方便，不需特殊仪器；1次可处理大量样品，成本相对较低，抗体活性保存好，可作为大量制备大鼠IgG方法采用。
第一作者：女，40岁，医学硕士，副教授r#, 百拇医药
参考文献r#, 百拇医药
1 Pharmacia LKB Biotechnology.Affinity Chromatography：Principles and Methods.Sweden ：Pharmacia，1995：53～56r#, 百拇医药
2 Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T.Molecular Cloning：a Laboratory Manual.2nd ed.USA：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989：880～887r#, 百拇医药
3 Schumacher JH，OGarra A，Shrader B，et al.The cha-racterization of four monoclonal antibodies specific for mouse IL-5 and development of mouse and human IL-5 enzyme-linked immunosorbent.J Immunol，1988，141：1576r#, 百拇医药
4 Frendscho MH，Brown JF，Iizawa Y，et al.Administration of anti-IL-4 monoclonal antibody 11B11 increases the resistance of mice to listeria monocytogenes infection.J Immunol，1992，148：3978r#, 百拇医药
5 Guss B，Eliasson M，Olsson A，et al.Structure of the IgG-binding regions of streptococcal protein G.EMBO J，1986，5：1567r#, 百拇医药
6 Akerstrom B，Brodin T，Reis K，et al.Protein G：a powerful tool for binding and detection of monoclonal and polyclonal antibodies.J Immunol，1985，135：2589r#, 百拇医药
7 Nygrem PA，Eliasson M，Palmcrantz E，et al.Analysis and use of serum albuming binding domains of streptococcal protein G.J Mol Recog，1988，69r#, 百拇医药
(1998-10-26收稿)(白 丽 Lindsay Dent)