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编号:10258329
应用Protein G纯化细胞培养上清中的大鼠单抗
http://www.100md.com 《免疫学杂志》1999年第3期
     作者:白 丽 Lindsay Dentz[+@?4, 百拇医药

    单位::白 丽 大理医学院微生物学及免疫学教研室 大理 671000;Lindsay Dent 澳大利亚阿得雷德大学微生物学及免疫学系,Adelaide 5005z[+@?4, 百拇医药

    关键词:杂交瘤细胞株培养上清 大鼠单克隆抗体IgG 纯化 链球菌G蛋白 亲和层析z[+@?4, 百拇医药

    免 疫 学 杂 志980320 摘 要 用miniPerm系统旋转连续培养大鼠杂交瘤细胞株,获得大量含抗鼠IL-4(IgG1)和IL-5(IgG1和IgG2a)抗体的培养上清;经PM10膜超滤、50%饱和硫酸铵沉淀及链球菌G蛋白-琼脂糖亲和层析纯化IgG单抗。结果每升杂交瘤细胞培养上清得到大鼠IgG22~36mg;1次可纯化抗体达20mg;经SDS-PAGE及ELISA鉴定,所得到的抗体纯度高、活性保持良好。z[+@?4, 百拇医药

    中图号 R392-33z[+@?4, 百拇医药

    PURIFICATION OF RAT MCABS FROM CULTURE SUPERNATANTS BY PROTEIN Gz[+@?4, 百拇医药

    Bai Li,Lindsay Dentz[+@?4, 百拇医药

    (Department of Microbiology & Immunology,Dali Medical College,Dali 671000)z[+@?4, 百拇医药

    Abstract A simple,three-step procedure to purify the rat IgG monoclonal antibodies from the hybridoma cell culture supernatants is described.We got a lot of the cell culture supernatants that contain rat anti-mouse IL-4(IgG1) and IL-5(IgG1 and IgG2a)monoclonal antibodies by using miniPerm System to culture rat hybridoma cells.In the first step,the supernatants are ultrafiltered with PM10 membrane.In the second,IgG fractions are precipitated with 50% of saturated ammonium sulfate.In the final,the monoclonal antibodies are purified by the high performance Protein G-Sepharose affinity column.The results show that we get IgG 22~36mg from 1 liter of the cell culture supernatants.The antibodies show a high purity and good activities monitored by SDS-PAGE and ELISA,respectively.About 20mg of antibody is obtained by only one purifying procedure.

    Key words Hybridoma cell culture supernatant,Rat IgG monoclonal antibody,Purification,Streptococcus Protien G,Affinity chromatographye)cq, 百拇医药

    小鼠是当代医学研究中十分重要的实验动物,而单克隆抗体(McAbs)的应用则是目前所有研究中十分活跃和引人注目的领域。无论是单抗在标本检测研究中的应用,还是在预防或治疗研究中的应用,高纯度单抗的获得均是将单抗应用于各种研究的关键,因此,单抗的纯化研究目前仍在不断的改进中。在各种动物来源的单克隆抗体中,大鼠单克隆抗体的纯化尤为困难,但其在小鼠动物模型中的应用却十分广泛。本文采用超滤、硫酸铵沉淀及链球菌G蛋白(Protein G)亲和层析等系列步骤,成功地从多株大鼠抗小鼠杂交瘤细胞培养上清中纯化大鼠IgG类单克隆抗体,取得了良好的效果。e)cq, 百拇医药

    1 材料和方法e)cq, 百拇医药

    1.1 含单克隆抗体上清的制备 所用杂交瘤细胞系大鼠11B11和BVD6(产生抗小鼠IL-4抗体)、TRFK4 和TRFK5(产生抗小鼠IL-5抗体)系实验室(Department of Immunology & Microbiology,University of Adelaide,Australia)保存细胞株,其单抗属IgG1或IgG2a亚类。杂交瘤细胞株经复苏后用含10%FCS(Cytosystem,Australia)的RPMI-1640(GIBCO,USA)培养液(含15mmol Hepes,100U/ml青霉素,100ug/ml链霉素,2mmol/L谷氨酰胺),在miniPerm(Heraeus,Gemeny)系统中旋转连续培养,至培养液变黄色后,收获培养液。e)cq, 百拇医药

    1.2 单克隆抗体的初步纯化 使用PM10膜(Amicon,Danvers,USA)超滤浓缩含McAb培养上清10~20倍。浓缩上清经50%饱和硫酸胺(SAS)沉淀,4°C条件下经15 000r/min离心,用PBS溶解沉淀物,溶解液置PBS透析24h,其间换液6次。e)cq, 百拇医药

    1.3 Protein G亲和层析纯化 按参考文献[1]进行,并作了部分改良,具体方法如下:e)cq, 百拇医药

    1.3.1 配制缓冲液:起始缓冲液为pH7.0 20mmol/L磷酸缓冲液;洗脱缓冲液为pH2.7 0.1mmol/L甘氨酸盐酸。

    1.3.2 准备收集管:取1.5ml离心管,每支离心管加70μl pH9.0 1mol/L Tris-HCl。pu]-*, 百拇医药

    1.3.3 样品准备:经50% SAS沉淀得到的样品,置起始缓冲液进行透析过夜,并经0.22m微孔滤膜滤过。pu]-*, 百拇医药

    1.3.4 纯化过程:用足够的起始缓冲液(8~10ml)平衡Protein G-琼脂糖亲和层析柱(HiTrap Protein G 1ml,Pharmacia Biotech)。取待纯化的样品(每毫升样品含蛋白10.2~21.1mg)15~25ml上柱,流速为0.5ml/min,然后以同样的流速依次用起始缓冲液7~8ml、洗脱缓冲液6~7ml、起始缓冲液5ml洗涤,每管1ml收集洗脱液,测每管OD280吸收值。收集第2洗脱峰(见图1),BCA法(Sigma,USA)测蛋白含量,4°C保存备用。pu]-*, 百拇医药

    1.4 纯度及活性鉴定 纯化的McAb用SDS-PAGE[2]鉴定其纯度。用10%分离胶、5%浓缩胶,设标准分子量(94KD,67KD,43KD,20.1KD及14.4KD)(Pharmacia),恒流下电泳2h,考马斯亮蓝R250(Pharmacia)染色。纯化的McAb用双抗体夹心生物素-链霉亲和素ELISA法鉴定[3,4]pu]-*, 百拇医药

    2 结果pu]-*, 百拇医药

    2.1 抗体纯化 含大鼠抗小鼠IL-5和IL-4的杂交瘤细胞培养上清经超滤法去除绝大部分液体及分子量<10KD的蛋白得到10~20倍浓缩的培养上清,后者经50%SAS沉淀后得到初提的大鼠IgG。最后用Protein G纯化,得到两个不同洗脱峰的曲线(见图1),第1峰为非结合峰(杂蛋白),第2峰即为所需的单克隆抗体峰,两峰间分离度良好。TRFK5细胞、11B11细胞和BVD6细胞产生的IgG1与TRFK4细胞产生的IgG2a纯化时得到的洗脱曲线类似。208t1.gif (3236 bytes)pu]-*, 百拇医药

    图 1用Protein G纯化大鼠单克隆抗体IgGpu]-*, 百拇医药

    Fig 1Purification of monoclonal rat IgG using HiTrap Protein G

    2.2 抗体纯度 还原性SDS-PAGE结果显示,经上述纯化过程纯化后的大鼠IgG1或IgG2a纯度好(见图2),只出现清晰的免疫球蛋白重链和轻链两条带。208t1.gif (3236 bytes)k)ekgtx, 百拇医药

    图 2纯化的大鼠单克隆IgG抗体的SDS-PAGEk)ekgtx, 百拇医药

    Fig 2SDS-PAGE electrophoresis of purified monoclonal rat IgGk)ekgtx, 百拇医药

    Line A:Rat hybridoma cell culture supernatant,reduced,diluted 1∶10k)ekgtx, 百拇医药

    Line B:Purified monoclonal rat IgG,reducedk)ekgtx, 百拇医药

    Line C:Molecular markerk)ekgtx, 百拇医药

    2.3 抗体活性 经双抗体夹心ELISA法证明TRFK4、TRFK5、11B11和BVD6抗体均有良好活性,测定样品的敏感性分别为IL-4 1.25U/ml及IL-5 30pg/ml。k)ekgtx, 百拇医药

    2.4 Protein G柱交联量和重复性 我们用同一类型Protein G柱纯化大鼠抗小鼠细胞因子抗体约20次,发现当样品上样量足够时,1ml Protein G柱可交联抗体超过20mg,故1次纯化即可得到高质量大量抗体。该方法的重复性极佳(P<0.01)。k)ekgtx, 百拇医药

    2.5 收获抗体量 TRFK4、TRFK5、11B11和BVD6杂交瘤细胞培养上清经上述系列方法纯化后,每升培养液可得到IgG分别为24~28mg、22~25mg、32~34mg和33.5~36mg。k)ekgtx, 百拇医药

    3 讨论k)ekgtx, 百拇医药

    大量的研究事实已经证明:亲和层析法纯化单抗是一种简单而有效的方法。过去常采用的是SPA亲和层析,但SPA对大鼠的各类Ig亲和力极低。本研究采用链球菌Protein G亲和层析纯化大鼠IgG1和IgG2a抗体,取得了良好的效果。Protein G为G组链球菌表面所具有的1种蛋白,它具有两个IgG结合位点,作为IgGFc受体能与IgGFc段结合,与SPA相比,能与更多种属的IgG结合,并对各种属IgG有更高的亲和性和更强的结合能力。除对大鼠IgG有高度亲和力外,对人各亚类IgG、兔、牛、马、山羊、绵羊、豚鼠、狗、猪、小鼠IgG均有很强的亲和力,故已被用于纯化多种McAb和各种多克隆IgG[5,6]。应用基因工程制备的Protein G,去除了天然Protein G与白蛋白结合的部位,故具有更高的特异性[1,7]。Protein G对pH的适应范围很广,可在pH2~10环境中保持良好活性。当pH7.0时,Protein G与IgG的结合最强,当pH为2.5~3.0时,IgG可被洗脱[1]。Protein G与Ig的结合能力主要取决于Ig的来源,也受流速、样品中Ig浓度影响。本研究结果表明,每毫升Protein G-琼脂糖可结合超过20mg的大鼠IgG,上样量可达25ml,因此,采用本方法1次可纯化大量IgG。在纯化过程中应注意的是,经冷藏或冷冻后含单抗的样品,在上柱前须经0.22u滤膜过滤以去除不溶性聚合物,否则会影响纯度,还有可能损坏层析柱。为了延长Protein G柱的使用寿命,每次使用层析柱后,均应用足量的起始缓冲液充分洗涤,然后加入20%乙醇置4°C保存。综上所述,本文报道的纯化单克隆抗体的方法简单、稳定,重复性好,所需时间短;操作方便,不需特殊仪器;1次可处理大量样品,成本相对较低,抗体活性保存好,可作为大量制备大鼠IgG方法采用。

    第一作者:女,40岁,医学硕士,副教授r#, 百拇医药

    参考文献r#, 百拇医药

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    (1998-10-26收稿)(白 丽 Lindsay Dent)