凋亡对肿瘤细胞表面抗原活性的影响
作者：张 谨 王德昌^5.*]c:, 百拇医药
单位：中国医学科学院肿瘤研究所 北京 100021^5.*]c:, 百拇医药
关键词：κB细胞 细胞凋亡 相关抗原 削减免疫法^5.*]c:, 百拇医药
免 疫 学 杂 志990312 摘 要 通过以常规免疫法和削减免疫法分别制备抗κB凋亡细胞相关抗原的抗体Ab1和Ab1a，以ELISA法检测抗原抗体反应，观察肿瘤细胞在凋亡过程中表面相关抗原活性的变化及新抗原的表达。结果显示Ab1与κB凋亡及非凋亡细胞的表面相关抗原均有较强反应，而Ab1a只与凋亡细胞表面抗原反应较强。由此可证明肿瘤细胞在凋亡过程中表面相关抗原活性并未明显降低，同时有新的抗原分子表达。^5.*]c:, 百拇医药
中图号 R730.3^5.*]c:, 百拇医药
INFLUENCED IMMUNOCOMPETENCE OF TUMOR CELL-ASSOCIATED SURFACE ANTIGENS BY INDUCING APOPTOSIS^5.*]c:, 百拇医药
Zhang Jin，Wang Dechang^5.*]c:, 百拇医药
(Institute of Cancer，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100021)^5.*]c:, 百拇医药
Abstract To determine immunocopmetence of apoptotic κB cell-associated surface antigens (Ag1) and find new antigens expressed during cell apoptosis，the routine immunization and subractive immunization techqnique were individually used to prepare polyclonal antibodies(Ab1 and Ab1a)against Ag1，and the antibodies response to antigens was determinded by ELISA.Ab1 reacted strongly both with Ag1 and non-apoptotic κB cell-associated surface antigens(Ag2)，but Ab1a only reacted strongly with Ag1.The immunocopmetence of tumor cell-associated surface antigens did not evidently fall during apoptotic response and new antigens expressed were found.
Key words κB cell，Apoptosis，Associated antigens，Subtractive immunization;iw, 百拇医药
从细胞凋亡的角度探讨肿瘤治疗途径已成为近年来的热点。研究表明：诸多哺乳类基因参与了细胞凋亡的调控，它们通过自身所编码的蛋白而发挥诱导或抑制凋亡的作用，每一过程都会产生特定的分子表达[1]。通过研究其分子调控机制，将对有计划地诱导肿瘤细胞凋亡产生重要的指导作用。肿瘤细胞表面抗原是肿瘤免疫的前提和基础之一，宿主的免疫系统通过识别这类抗原产生免疫应答，攻击并排除肿瘤细胞。观察肿瘤细胞凋亡过程中表面相关抗原活性的变化及是否有新的抗原表达，对细胞凋亡分子调控机理及肿瘤免疫的研究具有一定的意义。本实验通过制备κB凋亡细胞相关抗原的多克隆抗体，对其表面抗原的免疫活性进行了初步研究。;iw, 百拇医药
1 材料与方法;iw, 百拇医药
1.1 凋亡细胞的诱导及分离 参照文献[2]方法，κB细胞株(医科院药物所药理室)，以含10%小牛血清的RPMI1640培养液(Gibco公司)，37°C，5%CO2培养细胞生长至对数期，换用含5%乙醇的培养液继续培养8h，诱导细胞凋亡。按文献[3]方法以Percoll(Sigma公司)非连续性密度梯度法离心纯化，于1.075g/ml层收集凋亡细胞。;iw, 百拇医药
1.2 相关抗原的制备 将凋亡细胞匀浆后离心10 000r/min 15min，取上清加入分子量通透上限为10 000的透析袋中，4°C下每隔4h换水1次，3次后过夜，作为κB凋亡细胞相关抗原(Ag1)。以非调亡κB细胞同法制备其相关抗原(Ag2)。;iw, 百拇医药
1.3 常规法制备凋亡细胞抗体(Ab1) 雄性新西兰兔，体重2～3kg。Ag1(0.5mg/kg)加福氏完全佐剂于背部皮下多点注射，后每隔10d加强免疫1次共3次，剂量方法同前并测定抗体效价，第40d杀兔收集血清。另外Ag2同法制备非凋亡细胞抗体(Ab2)。;iw, 百拇医药
1.4 削减免疫法制备凋亡细胞抗体(Ab1a) 参照文献[4]方法用Ag2对动物做基础免疫后，于15min、24h、和48h腹腔注射环磷酰胺100mg/kg(上海华联制药有限公司)。2周后再以Ag1按常规法制备抗体。
1.5 抗原的检测 以细胞为抗原包被，在96孔板中加入0.001%多聚赖氨酸(Sigma公司)，4°C过夜后弃去。将凋亡及非凋亡细胞分别以2×106/ml向每孔加入0.1ml，离心500r/min 5min，弃上清再加入0.1ml预冷至4°C的0.05%戊二醛(北京化工厂)，4°C置5min，PBS洗3次加入封闭液备用。其他按常规ELISA方法进行。v!5;/&, http://www.100md.com
2 结果v!5;/&, http://www.100md.com
将Ab1、Ab1a和Ab23种抗体分别与Ag1和Ag2进行免疫反应，ELISA检测结果见图1。可以看出：常规免疫法制备的抗体Ab1和Ab2与Ag1和Ag2产生较强的交叉免疫反应；而以削减免疫法制备的Ab1a与Ag1的反应明显强于Ag2。
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图 1凋亡与非凋亡κB细胞表面抗原抗体反应v!5;/&, http://www.100md.com
Fig 1Reaction of apoptotic and non-apoptotic κB cell-associated surface antigens with their antibodiesv!5;/&, http://www.100md.com
3 讨论v!5;/&, http://www.100md.com
细胞凋亡与细胞坏死的根本区别在于细胞死亡过程中超显微结构变化不同并伴有新的蛋白质合成[5]。凋亡的过程是程序化的，是多基因调控的，其表面相关抗原的表达也将受到影响。本实验以凋亡与非凋亡κB细胞相关抗原分别制备多克隆抗体，由于细胞匀浆制备的抗原除来源于细胞膜外还可能来自胞浆或细胞其他成分，为显示细胞表面相关抗原的活性并排除干扰，故以凋亡和非凋亡细胞为抗原与制备抗体进行交叉免疫反应。结果表明：κB细胞在凋亡过程中，其表面抗原免疫活性并未明显减弱。但仅据此尚无法确定其分子表达的性质，因为参与凋亡调控的基因表达多为瞬时的且表达强度不大[1]。以常规法制备的抗凋亡细胞相关抗原的抗体与非凋亡细胞抗体有很大共性，使其无法确认凋亡细胞有无新的抗原分子表达。为此，我们采用了削减免疫法(Subtractive Immunization)，即以非凋亡细胞抗原免疫动物，然后用免疫抑制剂环磷酰胺杀伤被非凋亡细胞抗原激活的B细胞使其产生免疫耐受，再以凋亡细胞抗原进行免疫。这样就排除了非凋亡细胞抗原的干扰，使动物只产生凋亡细胞所独有的相关抗原的抗体，而这种抗原应是细胞凋亡过程中新的分子表达所产生的。结果以该法制备的抗体与凋亡细胞表面抗原反应强烈；而与非凋亡细胞表面抗原反应微弱。由此可以证实：肿瘤细胞在凋亡过程中表面相关抗原有新的分子表达，而使其免疫活性得以保持。这对于肿瘤免疫及凋亡细胞相关基因的研究均有一定意义。然而，就其细节及影响因素而言，如：表达开始的时相、凋亡的不同阶段对表达的影响、新分子表达的种类与数量等还有待于进一步探讨。v!5;/&, http://www.100md.com
第一作者：男，40岁，大学，副研究员v!5;/&, http://www.100md.com
参考文献v!5;/&, http://www.100md.com
1 何凤田，朱锡华.程序性细胞死亡的哺乳类基因调控.免疫学杂志，1996，12：71v!5;/&, http://www.100md.com
2 Lennon SV，Martin SJ，Cotter TG.Dods-dependent induction of apoptosis in human trumor cell lines by widely diverging stimuli.Cell Prolif，1991，24：203v!5;/&, http://www.100md.com
3 Martin SJ，Lennon SV，Bonham AB，et al.Induction of apoptosis (programmed cell death)in human leukacmic HL-60 cells by inhibition of RNA or protein synthesis.J Immunol，1990，145：1859v!5;/&, http://www.100md.com
4 Williams CV，Stechmann CH，Mellon SC.Subtractive immunization techniques for the production of monoclonal antibodies to rare antigens.Bio Techniques，1992，12：842v!5;/&, http://www.100md.com
5 张友端.细胞凋射与程序化细胞死亡.生命的化学，1993，13：(4)5v!5;/&, http://www.100md.com
(1998-10-19收稿；1999-01-27)(张 谨 王德昌)
单位：中国医学科学院肿瘤研究所 北京 100021^5.*]c:, 百拇医药
关键词：κB细胞 细胞凋亡 相关抗原 削减免疫法^5.*]c:, 百拇医药
免 疫 学 杂 志990312 摘 要 通过以常规免疫法和削减免疫法分别制备抗κB凋亡细胞相关抗原的抗体Ab1和Ab1a，以ELISA法检测抗原抗体反应，观察肿瘤细胞在凋亡过程中表面相关抗原活性的变化及新抗原的表达。结果显示Ab1与κB凋亡及非凋亡细胞的表面相关抗原均有较强反应，而Ab1a只与凋亡细胞表面抗原反应较强。由此可证明肿瘤细胞在凋亡过程中表面相关抗原活性并未明显降低，同时有新的抗原分子表达。^5.*]c:, 百拇医药
中图号 R730.3^5.*]c:, 百拇医药
INFLUENCED IMMUNOCOMPETENCE OF TUMOR CELL-ASSOCIATED SURFACE ANTIGENS BY INDUCING APOPTOSIS^5.*]c:, 百拇医药
Zhang Jin，Wang Dechang^5.*]c:, 百拇医药
(Institute of Cancer，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100021)^5.*]c:, 百拇医药
Abstract To determine immunocopmetence of apoptotic κB cell-associated surface antigens (Ag1) and find new antigens expressed during cell apoptosis，the routine immunization and subractive immunization techqnique were individually used to prepare polyclonal antibodies(Ab1 and Ab1a)against Ag1，and the antibodies response to antigens was determinded by ELISA.Ab1 reacted strongly both with Ag1 and non-apoptotic κB cell-associated surface antigens(Ag2)，but Ab1a only reacted strongly with Ag1.The immunocopmetence of tumor cell-associated surface antigens did not evidently fall during apoptotic response and new antigens expressed were found.
Key words κB cell，Apoptosis，Associated antigens，Subtractive immunization;iw, 百拇医药
从细胞凋亡的角度探讨肿瘤治疗途径已成为近年来的热点。研究表明：诸多哺乳类基因参与了细胞凋亡的调控，它们通过自身所编码的蛋白而发挥诱导或抑制凋亡的作用，每一过程都会产生特定的分子表达[1]。通过研究其分子调控机制，将对有计划地诱导肿瘤细胞凋亡产生重要的指导作用。肿瘤细胞表面抗原是肿瘤免疫的前提和基础之一，宿主的免疫系统通过识别这类抗原产生免疫应答，攻击并排除肿瘤细胞。观察肿瘤细胞凋亡过程中表面相关抗原活性的变化及是否有新的抗原表达，对细胞凋亡分子调控机理及肿瘤免疫的研究具有一定的意义。本实验通过制备κB凋亡细胞相关抗原的多克隆抗体，对其表面抗原的免疫活性进行了初步研究。;iw, 百拇医药
1 材料与方法;iw, 百拇医药
1.1 凋亡细胞的诱导及分离 参照文献[2]方法，κB细胞株(医科院药物所药理室)，以含10%小牛血清的RPMI1640培养液(Gibco公司)，37°C，5%CO2培养细胞生长至对数期，换用含5%乙醇的培养液继续培养8h，诱导细胞凋亡。按文献[3]方法以Percoll(Sigma公司)非连续性密度梯度法离心纯化，于1.075g/ml层收集凋亡细胞。;iw, 百拇医药
1.2 相关抗原的制备 将凋亡细胞匀浆后离心10 000r/min 15min，取上清加入分子量通透上限为10 000的透析袋中，4°C下每隔4h换水1次，3次后过夜，作为κB凋亡细胞相关抗原(Ag1)。以非调亡κB细胞同法制备其相关抗原(Ag2)。;iw, 百拇医药
1.3 常规法制备凋亡细胞抗体(Ab1) 雄性新西兰兔，体重2～3kg。Ag1(0.5mg/kg)加福氏完全佐剂于背部皮下多点注射，后每隔10d加强免疫1次共3次，剂量方法同前并测定抗体效价，第40d杀兔收集血清。另外Ag2同法制备非凋亡细胞抗体(Ab2)。;iw, 百拇医药
1.4 削减免疫法制备凋亡细胞抗体(Ab1a) 参照文献[4]方法用Ag2对动物做基础免疫后，于15min、24h、和48h腹腔注射环磷酰胺100mg/kg(上海华联制药有限公司)。2周后再以Ag1按常规法制备抗体。
1.5 抗原的检测 以细胞为抗原包被，在96孔板中加入0.001%多聚赖氨酸(Sigma公司)，4°C过夜后弃去。将凋亡及非凋亡细胞分别以2×106/ml向每孔加入0.1ml，离心500r/min 5min，弃上清再加入0.1ml预冷至4°C的0.05%戊二醛(北京化工厂)，4°C置5min，PBS洗3次加入封闭液备用。其他按常规ELISA方法进行。v!5;/&, http://www.100md.com
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将Ab1、Ab1a和Ab23种抗体分别与Ag1和Ag2进行免疫反应，ELISA检测结果见图1。可以看出：常规免疫法制备的抗体Ab1和Ab2与Ag1和Ag2产生较强的交叉免疫反应；而以削减免疫法制备的Ab1a与Ag1的反应明显强于Ag2。
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3 讨论v!5;/&, http://www.100md.com
细胞凋亡与细胞坏死的根本区别在于细胞死亡过程中超显微结构变化不同并伴有新的蛋白质合成[5]。凋亡的过程是程序化的，是多基因调控的，其表面相关抗原的表达也将受到影响。本实验以凋亡与非凋亡κB细胞相关抗原分别制备多克隆抗体，由于细胞匀浆制备的抗原除来源于细胞膜外还可能来自胞浆或细胞其他成分，为显示细胞表面相关抗原的活性并排除干扰，故以凋亡和非凋亡细胞为抗原与制备抗体进行交叉免疫反应。结果表明：κB细胞在凋亡过程中，其表面抗原免疫活性并未明显减弱。但仅据此尚无法确定其分子表达的性质，因为参与凋亡调控的基因表达多为瞬时的且表达强度不大[1]。以常规法制备的抗凋亡细胞相关抗原的抗体与非凋亡细胞抗体有很大共性，使其无法确认凋亡细胞有无新的抗原分子表达。为此，我们采用了削减免疫法(Subtractive Immunization)，即以非凋亡细胞抗原免疫动物，然后用免疫抑制剂环磷酰胺杀伤被非凋亡细胞抗原激活的B细胞使其产生免疫耐受，再以凋亡细胞抗原进行免疫。这样就排除了非凋亡细胞抗原的干扰，使动物只产生凋亡细胞所独有的相关抗原的抗体，而这种抗原应是细胞凋亡过程中新的分子表达所产生的。结果以该法制备的抗体与凋亡细胞表面抗原反应强烈；而与非凋亡细胞表面抗原反应微弱。由此可以证实：肿瘤细胞在凋亡过程中表面相关抗原有新的分子表达，而使其免疫活性得以保持。这对于肿瘤免疫及凋亡细胞相关基因的研究均有一定意义。然而，就其细节及影响因素而言，如：表达开始的时相、凋亡的不同阶段对表达的影响、新分子表达的种类与数量等还有待于进一步探讨。v!5;/&, http://www.100md.com
第一作者：男，40岁，大学，副研究员v!5;/&, http://www.100md.com
参考文献v!5;/&, http://www.100md.com
1 何凤田，朱锡华.程序性细胞死亡的哺乳类基因调控.免疫学杂志，1996，12：71v!5;/&, http://www.100md.com
2 Lennon SV，Martin SJ，Cotter TG.Dods-dependent induction of apoptosis in human trumor cell lines by widely diverging stimuli.Cell Prolif，1991，24：203v!5;/&, http://www.100md.com
3 Martin SJ，Lennon SV，Bonham AB，et al.Induction of apoptosis (programmed cell death)in human leukacmic HL-60 cells by inhibition of RNA or protein synthesis.J Immunol，1990，145：1859v!5;/&, http://www.100md.com
4 Williams CV，Stechmann CH，Mellon SC.Subtractive immunization techniques for the production of monoclonal antibodies to rare antigens.Bio Techniques，1992，12：842v!5;/&, http://www.100md.com
5 张友端.细胞凋射与程序化细胞死亡.生命的化学，1993，13：(4)5v!5;/&, http://www.100md.com
(1998-10-19收稿；1999-01-27)(张 谨 王德昌)