LPS、rh-TNFα刺激PBL诱导TRAIL表达的初步研究
作者：王梁华 朱玉平 潘 卫 娄永华 陈建鹤 冯 煜 焦炳华%3;&[9\, 百拇医药
单位：王梁华 朱玉平 娄永华 陈建鹤 冯 煜 焦炳华 第二军医大学基础部分子毒理学教研室 上海 200433；潘 卫 第二军医大学基础部微生物学教研室 上海 200433%3;&[9\, 百拇医药
关键词：肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 LPS rh-TNFα 诱导表达%3;&[9\, 百拇医药
免 疫 学 杂 志990307摘 要 选择人PBL作为人TRAIL基因的来源，抽提细胞在LPS 和rh-TNF α刺激2、10、18h的总RNA，通过RT-PCR观察TRAIL基因转录mRNA的水平，然后用PCR扩增TRAIL基因，并用免疫印迹法分析TRAIL mRNA翻译蛋白的水平。结果发现：在LPS和rh-TNFα刺激细胞并进一步诱导细胞凋亡可能与诱导表达TRAIL有关。本实验得到了TRAIL基因，为重组表达TRAIL打下了基础。%3;&[9\, 百拇医药
中图号 RA3.11%3;&[9\, 百拇医药
INDUCTION OF HUMAN TRAIL EXPRESSION ON STIMULA-%3;&[9\, 百拇医药
TED PBL BY LPS AND rh-TNFα%3;&[9\, 百拇医药
Wang Lianghua，Zhu Yuping，Pan Wei，Lou Yonghua，Chen Jianhe，Feng Yu，Jiao Binghua%3;&[9\, 百拇医药
(Department of Molecular Toxicology and Microbiology，The Second Military Medical University，Shanghai 200433)%3;&[9\, 百拇医药
Abstract Recent experiments showed that the apoptosis of tumor cells was highly related to the expression of TRAIL from EST in vitro.Human peripheral lymphocytes(PBL) stimulated by LPS and rh-TNF α was observed for the gene expression of TRAIL at 2，10 and 18 hours，respectively，through RT-PCR with isolated total RNA as the template，and the expressed product(TRAIL)was also detected by the method of immunoblotting.The results indicated that LPS(10μg/ml)，rh-TNF α(100U/ml)significantly induced the expression of TRAIL in PBL(106～107/ml)by PCR.It is confirmed that the cell apoptosis was related to the expression of TRAIL under the simulation of LPS and TNF α.The gene encoded for TRAIL was obtained which favors the further studies on its recombinant product.
Key words Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，LPS，rh-TNF α，Expression-inducing\hv, 百拇医药
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)是新近发现的肿瘤坏死因子家族成员，亦称凋亡素-2配体[1，2]。研究表明，TRAIL与TNF和Fas/Apo-1配体类似，为典型的Ⅱ型跨膜蛋白，C-末端细胞外区域形成同源三聚体的亚结构，而N-末端15～40位氨基酸形成跨膜结构，整个分子由281个氨基酸组成。目前发现人TRAIL的膜受体有五种：死亡受体4(DR4)和5(DR5)，及诱骗受体1(DcR1)或称无胞内区域受体(TRID)。正常细胞表达上述3种受体，而肿瘤及转化细胞仅能表达DR4和DR5。另两种受体为诱骗受体2(DcR2)和OPG——与骨密度调节有关的受体[3，4]。\hv, 百拇医药
本文报道了LPS和TNF α刺激人外周血淋巴细胞(PBL)诱导TRAIL表达的初步结果，首次从健康人PBL中扩增出了TRAIL基因，从而为TRAIL基因工程表达和细胞因子相互调控研究打下了基础。\hv, 百拇医药
1 材料和方法\hv, 百拇医药
1.1 PBL分离、培养和刺激 新鲜分离的健康志愿者抗凝外周全血，在试管(经过250°C干烤4h以上处理)中经淋巴细胞分离液梯度离心(4°C，400×g，30min)，取界面细胞；用无钙镁PBS(pH7.2)悬浮细胞，离心(650×g，10min)；洗细胞3次，用1640培养基悬浮细胞；加入16孔板，每孔3×106细胞，37°C，5%CO2孵箱培养2h后，吸弃培养上清；用预热的培养基轻轻洗细胞以去除非贴壁细胞，同时分别加入马流产杆菌LPS(本室制备，蛋白含量<1%)，10μg/ml，rh-TNF α(本室制备，纯度为>98%)100U/ml。\hv, 百拇医药
1.2 PBL总RNA的分离 分别收集刺激后培养2、10、18h的细胞，以RNA抽提试剂盒(Qigen Rneasy Total RNA Kit)抽提PBL总RNA，操作按说明书进行。\hv, 百拇医药
1.3 反转录PCR(RT-PCR)扩增TRAIL基因 以RT-PCR一步法试剂盒(Promega Access RT-PCR System)反转录扩增TRAIL基因，引物根据GenBank库的TRAIL cDNA序列设计(上海生工生物工程公司合成)。5’引物序列为：①5’-AGG ATC ATG GCT ATG ATG G-3；②5-GA ACC TCT GAG GAA AC-3。3引物序列为：①5-GG CTG CTC TAC TCA GAT TG-3；②5-A GGT CAG TTA GCC AAC-3。分别以3’①引物同时加入5’①引物做RT-PCR，再加上阳性和阴性对照，在PCR仪(PE 2400)上进行扩增。RT-PCR以25μl为反应体积，1μl抽提的总RNA为模板，42°C反转录45min，92°C变性2min；然后以94°C 30s，62°C 1min，68°C 2min的程序循环50次；68°C延伸10min。
1.4 PCR扩增可溶性TRAIL基因 以RT-PCR产物稀释后作为模板，以5’②引物和3’②引物在PE 2400上扩增。扩增条件：94°C 30s、60°C 45s、72°C 1min的程序循环35次，72°C延伸10min。uz4\|^, http://www.100md.com
1.5 免疫印迹法(Western Blotting)分析TRAIL的表达 以TRAIL鼠单抗(PharMingen，66251A)为一抗，HRP标记的羊抗鼠抗体为二抗，DAB(Ameresco，华舜分装)为显色底物，按《分子克隆实验指南》操作。uz4\|^, http://www.100md.com
2 结果与讨论uz4\|^, http://www.100md.com
2.1 人PBL刺激后TRAIL转录的RT-PCR与PCR分析 人PBL在LPS和TNF α刺激不同时间后，抽提总RNA，得到28S和18S之比为2∶1。LPS刺激PBL在2h后，RT-PCR就能扩增出TRAIL基因；在10、18h时TNF α实验组也能扩增出TRAIL基因；未刺激的PBL不能扩增出TRAIL基因。PCR得到的结果见图1。对此产物进行Taq Ⅰ限制性酶切，得到与理论一致的结果，初步证实得到了TRAIL基因(TRAIL基因中有Taq Ⅰ内切酶的单一酶切位点)。
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图 1PCR扩增TRAIL(95～281位氨基酸)基因uz4\|^, http://www.100md.com
Fig 1Amplification for TRAIL (95～281 amino acids)gene by PCRuz4\|^, http://www.100md.com
A：pGEM-7Zf(+)/Hae Ⅲ Markers；B～C：PBL-induced by LPS at 10h and 18h，respectively；D：Comp-lete digestion of PCR product with Taq Ⅰ restriction enzyme；E：PBL-induced by LPS at 2h；F～H：PBL-induced by TNF α at 2，10，18h，respectivelyuz4\|^, http://www.100md.com
2.2 Western Blotting确证TRAIL的表达 刺激18h后的PBL，进行Western Blotting分析，得到了分子量在32kD左右的显色条带。在刺激的情况下表达量有所升高，提示诱导细胞凋亡可能与TRAIL的转录与表达密切相关。
2.3 其他细胞因子诱导TRAIL转录的分析 根据细胞因子网络学说和我室研究细胞因子的结果，用不同浓度的细胞因子刺激不同的细胞株，以提高TRAIL mRNA的丰度和表达量。用rh-TNF α刺激，高浓度(1 000U/ml)刺激PBL，在8h内观察到细胞凋亡；低浓度(1U/ml)时没有扩增出TRAIL基因。用1 000U/ml的rh-IL2刺激PBL也能扩增出TRAIL基因(见图2)。用1 000U/ml的rh-IFN γ刺激PBL不能扩增出TRAIL基因，但出现细胞凋亡。LPS刺激U937细胞时，100、10、1μg/ml 3种剂量18h后都能扩增出TRAIL基因。各种细胞因子和LPS对HL60细胞的作用我们也进行了观察，尽管细胞在高剂量时不同程度地出现凋亡，但RT-PCR结果皆为阴性。
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图 2PCR扩增TRAIL(95～281位氨基酸)基因(PBL、937)\jp, http://www.100md.com
Fig 2Amplification for TRAIL gene(95～281 amino acids)from PBL induced by IL-2 and U937-induced by LPS with PCR\jp, http://www.100md.com
A：λDNA/EcoR Ⅰ+HindⅢ Markers；B：PCR control；C～E：PBL induced by IL-2 at 18h with 1000，100，10U/ml，respectively；F～H：U937-induced by LPS at 18h with 100，10，1μg/ml，repectively；I：Control PBL；J：pGEM-7Zf(+)/HaeⅢ Markers\jp, http://www.100md.com
根据国外对TRAIL在2h内就能诱导细胞凋亡和TNF α诱导肿瘤细胞凋亡10h就能明显观察到两个时间点的研究结果，我们分析了TRAIL转录与表达情况。细胞因子之间确实存在着相互的调控，但并不是所有的都能相互诱导，而是某些因子处于关键的位置起着决定性的作用。在先前的实验中，LPS的作用似乎能非特异的诱导几乎所有的细胞因子，尤其是一些相关细胞死亡的因子[5]，如TNF α、TNF β、CD40L、FasL等；本实验证实了死亡因子之间可相互诱导。\jp, http://www.100md.com
随着TRAIL几个受体的不断发现，它的作用机理正逐步被阐明；TRAIL在机体的免疫功能，造血功能中的重要作用也正逐步被阐明[6]。它在抗肿瘤治疗中的潜在应用价值已经引起了国外几家大公司如Immunex、Genetech等的注意。因此在国内，尽快获取TRAIL基因和构建TRAIL重组表达载体以获得大量TRAIL就成为对其作用机理，以及临床前研究的先决条件。目前，对TNF家族诱导细胞凋亡和杀伤肿瘤细胞的信号途径正在逐步阐明，TRAIL是否也通过它们的共用途径发挥作用的还不清楚。根据我们对TRAIL表达和诱导的观察，推测TRAIL诱导细胞死亡可能与TNF α和Fas 的信号途径不同。
通过这些研究，我们在国内外首次从正常人细胞中扩增出了TRAIL基因，这一结果为获得TRAIL的编码序列和进一步重组表达TRAIL奠定了基础。目前我们已经测定了扩增出的TRAIL基因序列，并克隆入了表达载体，进行重组表达、活性分析和理化性质的鉴定(结果将另文报道)。.klw*, 百拇医药
第一作者：男，27岁，硕士.klw*, 百拇医药
参考文献.klw*, 百拇医药
1 Wiley SR，Schooley K，Smolal PJ，et al.Identification and characterization of a new member of the TNF family that induces apoptosis.Immunity，1995，3(4)：673.klw*, 百拇医药
2 Pitti RM，Marsters SA，Ruppert S，et al.Induction of apoptosis by Apo-2 ligand，a new member of the tumor necrosis factor cytokine family.J Biol Chem，1996，271(22)：12687.klw*, 百拇医药
3 王梁华，焦炳华.肿瘤坏死因子家族新成员——TRAIL.生物化学与生物物理进展，1998，25(5)：392.klw*, 百拇医药
4 王梁华，焦炳华.TRAIL诱导突变细胞凋亡的分子机理——免疫监督机制的新模型.中国肿瘤生物治疗杂志，1998，6(3)：231.klw*, 百拇医药
5 焦炳华.分子内毒素学.上海：上海科学技术文献出版社，1995.klw*, 百拇医药
6 Jeremias I，Herr I，Boehler T，et al.TRAIL/Apo-2 li-gand-induced apoptosis in human T cells.Eur J Immunol，1998，28(1)：143.klw*, 百拇医药
(1998-06-24收稿；1998-11-24修回)(王梁华 朱玉平 潘 卫 娄永华 陈建鹤 冯 煜 焦炳华)
单位：王梁华 朱玉平 娄永华 陈建鹤 冯 煜 焦炳华 第二军医大学基础部分子毒理学教研室 上海 200433；潘 卫 第二军医大学基础部微生物学教研室 上海 200433%3;&[9\, 百拇医药
关键词：肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 LPS rh-TNFα 诱导表达%3;&[9\, 百拇医药
免 疫 学 杂 志990307摘 要 选择人PBL作为人TRAIL基因的来源，抽提细胞在LPS 和rh-TNF α刺激2、10、18h的总RNA，通过RT-PCR观察TRAIL基因转录mRNA的水平，然后用PCR扩增TRAIL基因，并用免疫印迹法分析TRAIL mRNA翻译蛋白的水平。结果发现：在LPS和rh-TNFα刺激细胞并进一步诱导细胞凋亡可能与诱导表达TRAIL有关。本实验得到了TRAIL基因，为重组表达TRAIL打下了基础。%3;&[9\, 百拇医药
中图号 RA3.11%3;&[9\, 百拇医药
INDUCTION OF HUMAN TRAIL EXPRESSION ON STIMULA-%3;&[9\, 百拇医药
TED PBL BY LPS AND rh-TNFα%3;&[9\, 百拇医药
Wang Lianghua，Zhu Yuping，Pan Wei，Lou Yonghua，Chen Jianhe，Feng Yu，Jiao Binghua%3;&[9\, 百拇医药
(Department of Molecular Toxicology and Microbiology，The Second Military Medical University，Shanghai 200433)%3;&[9\, 百拇医药
Abstract Recent experiments showed that the apoptosis of tumor cells was highly related to the expression of TRAIL from EST in vitro.Human peripheral lymphocytes(PBL) stimulated by LPS and rh-TNF α was observed for the gene expression of TRAIL at 2，10 and 18 hours，respectively，through RT-PCR with isolated total RNA as the template，and the expressed product(TRAIL)was also detected by the method of immunoblotting.The results indicated that LPS(10μg/ml)，rh-TNF α(100U/ml)significantly induced the expression of TRAIL in PBL(106～107/ml)by PCR.It is confirmed that the cell apoptosis was related to the expression of TRAIL under the simulation of LPS and TNF α.The gene encoded for TRAIL was obtained which favors the further studies on its recombinant product.
Key words Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，LPS，rh-TNF α，Expression-inducing\hv, 百拇医药
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)是新近发现的肿瘤坏死因子家族成员，亦称凋亡素-2配体[1，2]。研究表明，TRAIL与TNF和Fas/Apo-1配体类似，为典型的Ⅱ型跨膜蛋白，C-末端细胞外区域形成同源三聚体的亚结构，而N-末端15～40位氨基酸形成跨膜结构，整个分子由281个氨基酸组成。目前发现人TRAIL的膜受体有五种：死亡受体4(DR4)和5(DR5)，及诱骗受体1(DcR1)或称无胞内区域受体(TRID)。正常细胞表达上述3种受体，而肿瘤及转化细胞仅能表达DR4和DR5。另两种受体为诱骗受体2(DcR2)和OPG——与骨密度调节有关的受体[3，4]。\hv, 百拇医药
本文报道了LPS和TNF α刺激人外周血淋巴细胞(PBL)诱导TRAIL表达的初步结果，首次从健康人PBL中扩增出了TRAIL基因，从而为TRAIL基因工程表达和细胞因子相互调控研究打下了基础。\hv, 百拇医药
1 材料和方法\hv, 百拇医药
1.1 PBL分离、培养和刺激 新鲜分离的健康志愿者抗凝外周全血，在试管(经过250°C干烤4h以上处理)中经淋巴细胞分离液梯度离心(4°C，400×g，30min)，取界面细胞；用无钙镁PBS(pH7.2)悬浮细胞，离心(650×g，10min)；洗细胞3次，用1640培养基悬浮细胞；加入16孔板，每孔3×106细胞，37°C，5%CO2孵箱培养2h后，吸弃培养上清；用预热的培养基轻轻洗细胞以去除非贴壁细胞，同时分别加入马流产杆菌LPS(本室制备，蛋白含量<1%)，10μg/ml，rh-TNF α(本室制备，纯度为>98%)100U/ml。\hv, 百拇医药
1.2 PBL总RNA的分离 分别收集刺激后培养2、10、18h的细胞，以RNA抽提试剂盒(Qigen Rneasy Total RNA Kit)抽提PBL总RNA，操作按说明书进行。\hv, 百拇医药
1.3 反转录PCR(RT-PCR)扩增TRAIL基因 以RT-PCR一步法试剂盒(Promega Access RT-PCR System)反转录扩增TRAIL基因，引物根据GenBank库的TRAIL cDNA序列设计(上海生工生物工程公司合成)。5’引物序列为：①5’-AGG ATC ATG GCT ATG ATG G-3；②5-GA ACC TCT GAG GAA AC-3。3引物序列为：①5-GG CTG CTC TAC TCA GAT TG-3；②5-A GGT CAG TTA GCC AAC-3。分别以3’①引物同时加入5’①引物做RT-PCR，再加上阳性和阴性对照，在PCR仪(PE 2400)上进行扩增。RT-PCR以25μl为反应体积，1μl抽提的总RNA为模板，42°C反转录45min，92°C变性2min；然后以94°C 30s，62°C 1min，68°C 2min的程序循环50次；68°C延伸10min。
1.4 PCR扩增可溶性TRAIL基因 以RT-PCR产物稀释后作为模板，以5’②引物和3’②引物在PE 2400上扩增。扩增条件：94°C 30s、60°C 45s、72°C 1min的程序循环35次，72°C延伸10min。uz4\|^, http://www.100md.com
1.5 免疫印迹法(Western Blotting)分析TRAIL的表达 以TRAIL鼠单抗(PharMingen，66251A)为一抗，HRP标记的羊抗鼠抗体为二抗，DAB(Ameresco，华舜分装)为显色底物，按《分子克隆实验指南》操作。uz4\|^, http://www.100md.com
2 结果与讨论uz4\|^, http://www.100md.com
2.1 人PBL刺激后TRAIL转录的RT-PCR与PCR分析 人PBL在LPS和TNF α刺激不同时间后，抽提总RNA，得到28S和18S之比为2∶1。LPS刺激PBL在2h后，RT-PCR就能扩增出TRAIL基因；在10、18h时TNF α实验组也能扩增出TRAIL基因；未刺激的PBL不能扩增出TRAIL基因。PCR得到的结果见图1。对此产物进行Taq Ⅰ限制性酶切，得到与理论一致的结果，初步证实得到了TRAIL基因(TRAIL基因中有Taq Ⅰ内切酶的单一酶切位点)。
uz4\|^, http://www.100md.com图 1PCR扩增TRAIL(95～281位氨基酸)基因uz4\|^, http://www.100md.com
Fig 1Amplification for TRAIL (95～281 amino acids)gene by PCRuz4\|^, http://www.100md.com
A：pGEM-7Zf(+)/Hae Ⅲ Markers；B～C：PBL-induced by LPS at 10h and 18h，respectively；D：Comp-lete digestion of PCR product with Taq Ⅰ restriction enzyme；E：PBL-induced by LPS at 2h；F～H：PBL-induced by TNF α at 2，10，18h，respectivelyuz4\|^, http://www.100md.com
2.2 Western Blotting确证TRAIL的表达 刺激18h后的PBL，进行Western Blotting分析，得到了分子量在32kD左右的显色条带。在刺激的情况下表达量有所升高，提示诱导细胞凋亡可能与TRAIL的转录与表达密切相关。
2.3 其他细胞因子诱导TRAIL转录的分析 根据细胞因子网络学说和我室研究细胞因子的结果，用不同浓度的细胞因子刺激不同的细胞株，以提高TRAIL mRNA的丰度和表达量。用rh-TNF α刺激，高浓度(1 000U/ml)刺激PBL，在8h内观察到细胞凋亡；低浓度(1U/ml)时没有扩增出TRAIL基因。用1 000U/ml的rh-IL2刺激PBL也能扩增出TRAIL基因(见图2)。用1 000U/ml的rh-IFN γ刺激PBL不能扩增出TRAIL基因，但出现细胞凋亡。LPS刺激U937细胞时，100、10、1μg/ml 3种剂量18h后都能扩增出TRAIL基因。各种细胞因子和LPS对HL60细胞的作用我们也进行了观察，尽管细胞在高剂量时不同程度地出现凋亡，但RT-PCR结果皆为阴性。
\jp, http://www.100md.com图 2PCR扩增TRAIL(95～281位氨基酸)基因(PBL、937)\jp, http://www.100md.com
Fig 2Amplification for TRAIL gene(95～281 amino acids)from PBL induced by IL-2 and U937-induced by LPS with PCR\jp, http://www.100md.com
A：λDNA/EcoR Ⅰ+HindⅢ Markers；B：PCR control；C～E：PBL induced by IL-2 at 18h with 1000，100，10U/ml，respectively；F～H：U937-induced by LPS at 18h with 100，10，1μg/ml，repectively；I：Control PBL；J：pGEM-7Zf(+)/HaeⅢ Markers\jp, http://www.100md.com
根据国外对TRAIL在2h内就能诱导细胞凋亡和TNF α诱导肿瘤细胞凋亡10h就能明显观察到两个时间点的研究结果，我们分析了TRAIL转录与表达情况。细胞因子之间确实存在着相互的调控，但并不是所有的都能相互诱导，而是某些因子处于关键的位置起着决定性的作用。在先前的实验中，LPS的作用似乎能非特异的诱导几乎所有的细胞因子，尤其是一些相关细胞死亡的因子[5]，如TNF α、TNF β、CD40L、FasL等；本实验证实了死亡因子之间可相互诱导。\jp, http://www.100md.com
随着TRAIL几个受体的不断发现，它的作用机理正逐步被阐明；TRAIL在机体的免疫功能，造血功能中的重要作用也正逐步被阐明[6]。它在抗肿瘤治疗中的潜在应用价值已经引起了国外几家大公司如Immunex、Genetech等的注意。因此在国内，尽快获取TRAIL基因和构建TRAIL重组表达载体以获得大量TRAIL就成为对其作用机理，以及临床前研究的先决条件。目前，对TNF家族诱导细胞凋亡和杀伤肿瘤细胞的信号途径正在逐步阐明，TRAIL是否也通过它们的共用途径发挥作用的还不清楚。根据我们对TRAIL表达和诱导的观察，推测TRAIL诱导细胞死亡可能与TNF α和Fas 的信号途径不同。
通过这些研究，我们在国内外首次从正常人细胞中扩增出了TRAIL基因，这一结果为获得TRAIL的编码序列和进一步重组表达TRAIL奠定了基础。目前我们已经测定了扩增出的TRAIL基因序列，并克隆入了表达载体，进行重组表达、活性分析和理化性质的鉴定(结果将另文报道)。.klw*, 百拇医药
第一作者：男，27岁，硕士.klw*, 百拇医药
参考文献.klw*, 百拇医药
1 Wiley SR，Schooley K，Smolal PJ，et al.Identification and characterization of a new member of the TNF family that induces apoptosis.Immunity，1995，3(4)：673.klw*, 百拇医药
2 Pitti RM，Marsters SA，Ruppert S，et al.Induction of apoptosis by Apo-2 ligand，a new member of the tumor necrosis factor cytokine family.J Biol Chem，1996，271(22)：12687.klw*, 百拇医药
3 王梁华，焦炳华.肿瘤坏死因子家族新成员——TRAIL.生物化学与生物物理进展，1998，25(5)：392.klw*, 百拇医药
4 王梁华，焦炳华.TRAIL诱导突变细胞凋亡的分子机理——免疫监督机制的新模型.中国肿瘤生物治疗杂志，1998，6(3)：231.klw*, 百拇医药
5 焦炳华.分子内毒素学.上海：上海科学技术文献出版社，1995.klw*, 百拇医药
6 Jeremias I，Herr I，Boehler T，et al.TRAIL/Apo-2 li-gand-induced apoptosis in human T cells.Eur J Immunol，1998，28(1)：143.klw*, 百拇医药
(1998-06-24收稿；1998-11-24修回)(王梁华 朱玉平 潘 卫 娄永华 陈建鹤 冯 煜 焦炳华)