脂质体介导IFNγ基因治疗小鼠肝癌的研究
作者：张景迎 陈诗书p|@r*, 百拇医药
单位：上海第二医科大学人类基因治疗研究中心 上海 200025p|@r*, 百拇医药
关键词：阳离子脂质体；腺相关病毒；干扰素-γ；基因转移p|@r*, 百拇医药
免 疫 学 杂 志990306摘 要 以大肠杆菌β-gal基因为报告基因，优化了3种阳离子脂质体的转染条件，评估了其转染效率。用构建的含腺相关病毒反向末端重复序列(AAV-ITRs)的质粒表达载体，经Dosper介导将小鼠IFNγ基因导入MM45T.Li细胞，体外有效地表达IFNγ。瘤体内注射Dosper-pAI-mIFNγ复合物可明显抑制肿瘤生长，荷瘤小鼠生存期延长。此简便、有效的非病毒转基因方法有望用于肿瘤基因治疗。p|@r*, 百拇医药
中图号 R730.59p|@r*, 百拇医药
GENE THERAPY OF HEPATOCHELLULAR CANCER WITH MOUSE IFN-γ GENE COMPLEXED TO CATIONIC LIPOSOMESp|@r*, 百拇医药
Zhang Jingying， Chen Shishup|@r*, 百拇医药
(Human Gene Therapy Center， Shanghai Second Medical University， Shanghai 200025)p|@r*, 百拇医药
Abstract In this study， we investigated the efficiency rates of liposome-mediated gene transfection. Escherichia coli β-galactosidase gene used as a reporter gene， three different cationic liposomes were compared for their transfection efficiency， and the transfection conditions were optimized. MM45T. Li transfected with Dosper-plasmid complexes containing AAV-ITRs and IFN-γ cDNA in vitro， the efficient expression of INF-γ gene was achieved. In BALB/c mice， the growth of tumors was significantly delayed and the survival time of the treated mice was markedly prolonged following intratumor injection of Dosper-pAI-mIFNγ complexes. This simplified and efficient nonviral gene transfer method might be used in cancer gene therapy.
Key words Cationic liposomes， Adeno-associated virus， IFN-γ， Gene transferk4z1g, 百拇医药
肝癌是我国常见恶性肿瘤之一。尽管多种治疗方案已被采用，但肝癌仍是最难治愈的恶性肿瘤之一，尤其伴有多发病灶或远处转移时[1]。因此，探索新型疗法势在必行。肿瘤基因治疗虽已取得较大进展，但其效率仍待提高，关键在于有效目的基因的选择和高效、安全的转导体系的应用。已有文献表明转IFN-γ基因瘤苗较明显地抗肿瘤生长[2]。本研究采用一种新的基因转导体系，即阳离子脂质体-腺相关病毒增强型质粒复合物，将IFNγ基因导入小鼠肝癌细胞，以观察其表达情况及其体内抗肿瘤作用。k4z1g, 百拇医药
1 材料与方法k4z1g, 百拇医药
1.1 主要试剂 Lipofectin和LipofectAMINE购自GIBCO公司。Dosper、anti-β-gal和IFNγ标准品购自Boehringer公司。质粒pAAV-LacZ由Johns Hopkins医学院储时健博士惠赠。pAI-mIFNγ由作者构建，内含强启动子CMVp、intronA、AAV-ITRs和mIFNγ cDNA(待发表)。小鼠肝癌细胞系MM45 T.Li由第二军医大学曹广文副教授惠赠。L929为本室传代保存。BALB/c小鼠，雄性，20～22g，购自上海西普尔-必凯公司。k4z1g, 百拇医药
1.2 质粒提取纯化 按试剂盒(QIAGEN公司)方法进行。k4z1g, 百拇医药
1.3 体外转染方法 于24孔板中，每孔种3×104个细胞，培养24h后转染。转染复合物制备：适量脂质体与质粒DNA分别加到50μl无血清基中，轻混后合并两液，室温置15min，加入培养板孔中，确保充分散开。培养6h后弃转染液，换正常培养基，培养48h后检测表达情况。k4z1g, 百拇医药
1.4 荷瘤小鼠模型及治疗方案 每只小鼠左腋皮下注射5×105个细胞，约12d时肿瘤长至直径6.4mm时开始治疗。荷瘤鼠随机分3组，每组6只。Dosper-pAI-mIFNγ组：每只小鼠瘤内注射复合物100μl，内含40μl Dosper和10μg DNA；Dosper-pAAV-LacZ组：注射复合物100μl，内含40μl Dosper和10μg DNA； Dosper组：只含40μl Dosper。各组每只小鼠均连续注射2次，隔2d注射一次，随后观察肿瘤生长情况及荷瘤鼠生存情况。每组另有2只鼠于最后一次注射治疗后2d取瘤组织抽RNA。
1.5 RT-PCR分析IFN-γ表达 用TRIzol抽提总RNA，逆转录后行PCR。取15μl产物电泳，扩增片段为465bp。fk/!, 百拇医药
1.6 免疫组化检测β-gal表达 按常规法进行。Anti-β-gal稀释度为1∶50。fk/!, 百拇医药
1.7 IFNγ活性检测 用L929的细胞毒性试验，结果用小鼠IFNγ标准品(Boehringer公司，5 000U/μg)标化。fk/!, 百拇医药
1.8 抑瘤效应及荷瘤鼠生存情况 自治疗开始起，每隔5d测量肿瘤大小1次，结果用二垂直方向直径平均值表示，同时观察生存情况。结果经统计学方法处理。fk/!, 百拇医药
2 结果fk/!, 百拇医药
2.1 脂质体介导质粒DNA转染的优化 为了提高阳离子脂质体介导基因转染MM45T. Li的效率，选用3种阳离子脂质体，优化其转染条件。如图1所示，3种的最佳脂质体：DNA不同，Lipofectin和Dosper为4∶1，而LipofectAMINE为6∶1。转染效率最高的是Dosper。fk/!, 百拇医药
2.2 Dosper介导IFNγ基因的体外表达 经效率最好的Dosper介导IFNγ基因转导MMS45T.Li显示：随pAI-mIFNγ量的增加，IFNγ活性增高，可达1 600U/(48h.ml)，但超过0.9μg后，活性反而降低(见图2)。fk/!, 百拇医药
2.3 瘤体内注射复合物后IFNγ表达 抽提瘤组
fk/!, 百拇医药
图 1不同脂质体转染效果fk/!, 百拇医药
Fig 1Transfection efficiency rates of different liposomes
fk/!, 百拇医药
图 2IFNγ体外表达情况fk/!, 百拇医药
Fig 2In vitro expression of IFNγ gene in MM45 T.Li
织总RNA作RT-PCR分析。如图3，Dosper-pAI-mIFNγ组可见465bp带，另两组未见此带，表明瘤组织内有IFNγ mRNA，外源IFNγ基因获得表达。*9z395, http://www.100md.com
2.4 抗肿瘤作用 皮下荷瘤模型上直接瘤内注射复合物后，Dosper-pAI-mIFNγ组肿瘤生长明显受抑(P<0.01)。治疗组小鼠平均生存时间为38±6.8d，明显高于LacZ组(28±4.5d)及Dosper组(29±6.2d)(P<0.01)。
*9z395, http://www.100md.com
图 3瘤体组织RT-PCR产物电泳图*9z395, http://www.100md.com
Fig 3RT-PCR analysis of INFγ from transfected tumor tissues*9z395, http://www.100md.com
1：λ-DNA/Hind Ⅲ marker； 2：Dosper-pAI-mINFγ group；*9z395, http://www.100md.com
3：Dosper-pAAV-LacZ group； 4：Dosper group
*9z395, http://www.100md.com
图 4治疗后各组肿瘤生长情况*9z395, http://www.100md.com
Fig 4Growth of tumors after treatment*9z395, http://www.100md.com
3 讨论*9z395, http://www.100md.com
阳离子脂质体介导基因转移技术是目前应用较多、很有发展前途的非病毒转移方法。新的阳离子脂质体不断研制成功，将大大提高其转导效率[3]。此外，所用真核质粒表达载体的优化改造将有助于进一步提高表达能力[4，5]。Philip等研究表明，含AAV-ITRs质粒载体可明显提高阳离子脂质体介导的基因表达效率，且可在分裂及非分裂细胞中较长时间表达[6]。利用此类载体已成功地将IL-2基因导入前列腺瘤、乳腺癌、卵巢癌及胰腺癌细胞，并获得较高水平、较长时间表达，照射后的瘤苗可诱导机体产生明显的抗肿瘤免疫[7]。此类ex vivo方法较繁琐。我们在构建的AAV增强型质粒基础上，先用报告基因观察了3种脂质体转染效率，显示Dosper最好。最佳条件下，体外将IFNγ基因导入MM45T.Li，表达活性达1 600U/(48h.ml)。在荷瘤模型上，IFNγ可明显抑制肿瘤生长，荷瘤鼠寿命延长，其机理可能是上调抗原加工和递呈因子(如MHC I等)，调节细胞毒T细胞的诱导，Mφ、NK和LAK的激活及其它免疫调节因子的诱导[8]。至于AAV质粒载体提高基因表达水平及延长表达时间，可能与AAV-ITRs促进质粒在核内聚集有关，但详细机理有待进一步研究。
第一作者：男，34岁，博士46hsn, 百拇医药
参考文献46hsn, 百拇医药
1 张景迎，陈诗书.肝细胞癌基因治疗的实验性研究进展.医学综述，1998，4：146hsn, 百拇医药
2 雷 虹，曹雪涛，于益芝，等.腺病毒介导IFN-γ基因转染的瘤苗体内抗肿瘤转移作用.免疫学杂志，1996，13：2946hsn, 百拇医药
3 Felgner PL. Improvements in cationic liposomes for in vivo gene transfer. Hum Gene Ther， 1996， 7：179146hsn, 百拇医药
4 Yew NS， Wysokenski DM， Wang KX， et al. Optimization of plasmid vectors for high-level expression in lung epithelial cells. Hum Gene Ther， 1997， 8：57546hsn, 百拇医药
5 Vieweg J， Boczkowski D， Roberson KM， et al. Efficient gene transfer with adeno-associated virus based plasmids complexed to cationic liposomes for gene therapy of human prostate cancer. Cancer Res， 1995， 55：236646hsn, 百拇医药
6 Philip R， Brunette E， Kilinski L， et al. Efficient and sustained gene expression in primary T lymphocytes and primary and cultured turnor cells mediated by adeno-associated virus plasmid DNA complexed to cationic liposomes. Mol Cell Biol， 1994， 14：241146hsn, 百拇医药
7 Clary BM， Covency EC， Philip R， et al. Inhibition of established pancreatic cancers following specific active immunotherapy with interleukin-2 gene-transduced tumor cells. Cancer Gene Therapy， 1997， 4：9746hsn, 百拇医药
8 Rosenthal FM， Cronin K， Bannerji R， et al. Augmentation of antitumor immunity by tumor cells transduced with a retroviral vector carrying the interleukin-2 and interferin-γ cDNAs. Blood， 1994， 83：128946hsn, 百拇医药
(1998-07-06收稿；1999-02-25修回)(张景迎 陈诗书)
单位：上海第二医科大学人类基因治疗研究中心 上海 200025p|@r*, 百拇医药
关键词：阳离子脂质体；腺相关病毒；干扰素-γ；基因转移p|@r*, 百拇医药
免 疫 学 杂 志990306摘 要 以大肠杆菌β-gal基因为报告基因，优化了3种阳离子脂质体的转染条件，评估了其转染效率。用构建的含腺相关病毒反向末端重复序列(AAV-ITRs)的质粒表达载体，经Dosper介导将小鼠IFNγ基因导入MM45T.Li细胞，体外有效地表达IFNγ。瘤体内注射Dosper-pAI-mIFNγ复合物可明显抑制肿瘤生长，荷瘤小鼠生存期延长。此简便、有效的非病毒转基因方法有望用于肿瘤基因治疗。p|@r*, 百拇医药
中图号 R730.59p|@r*, 百拇医药
GENE THERAPY OF HEPATOCHELLULAR CANCER WITH MOUSE IFN-γ GENE COMPLEXED TO CATIONIC LIPOSOMESp|@r*, 百拇医药
Zhang Jingying， Chen Shishup|@r*, 百拇医药
(Human Gene Therapy Center， Shanghai Second Medical University， Shanghai 200025)p|@r*, 百拇医药
Abstract In this study， we investigated the efficiency rates of liposome-mediated gene transfection. Escherichia coli β-galactosidase gene used as a reporter gene， three different cationic liposomes were compared for their transfection efficiency， and the transfection conditions were optimized. MM45T. Li transfected with Dosper-plasmid complexes containing AAV-ITRs and IFN-γ cDNA in vitro， the efficient expression of INF-γ gene was achieved. In BALB/c mice， the growth of tumors was significantly delayed and the survival time of the treated mice was markedly prolonged following intratumor injection of Dosper-pAI-mIFNγ complexes. This simplified and efficient nonviral gene transfer method might be used in cancer gene therapy.
Key words Cationic liposomes， Adeno-associated virus， IFN-γ， Gene transferk4z1g, 百拇医药
肝癌是我国常见恶性肿瘤之一。尽管多种治疗方案已被采用，但肝癌仍是最难治愈的恶性肿瘤之一，尤其伴有多发病灶或远处转移时[1]。因此，探索新型疗法势在必行。肿瘤基因治疗虽已取得较大进展，但其效率仍待提高，关键在于有效目的基因的选择和高效、安全的转导体系的应用。已有文献表明转IFN-γ基因瘤苗较明显地抗肿瘤生长[2]。本研究采用一种新的基因转导体系，即阳离子脂质体-腺相关病毒增强型质粒复合物，将IFNγ基因导入小鼠肝癌细胞，以观察其表达情况及其体内抗肿瘤作用。k4z1g, 百拇医药
1 材料与方法k4z1g, 百拇医药
1.1 主要试剂 Lipofectin和LipofectAMINE购自GIBCO公司。Dosper、anti-β-gal和IFNγ标准品购自Boehringer公司。质粒pAAV-LacZ由Johns Hopkins医学院储时健博士惠赠。pAI-mIFNγ由作者构建，内含强启动子CMVp、intronA、AAV-ITRs和mIFNγ cDNA(待发表)。小鼠肝癌细胞系MM45 T.Li由第二军医大学曹广文副教授惠赠。L929为本室传代保存。BALB/c小鼠，雄性，20～22g，购自上海西普尔-必凯公司。k4z1g, 百拇医药
1.2 质粒提取纯化 按试剂盒(QIAGEN公司)方法进行。k4z1g, 百拇医药
1.3 体外转染方法 于24孔板中，每孔种3×104个细胞，培养24h后转染。转染复合物制备：适量脂质体与质粒DNA分别加到50μl无血清基中，轻混后合并两液，室温置15min，加入培养板孔中，确保充分散开。培养6h后弃转染液，换正常培养基，培养48h后检测表达情况。k4z1g, 百拇医药
1.4 荷瘤小鼠模型及治疗方案 每只小鼠左腋皮下注射5×105个细胞，约12d时肿瘤长至直径6.4mm时开始治疗。荷瘤鼠随机分3组，每组6只。Dosper-pAI-mIFNγ组：每只小鼠瘤内注射复合物100μl，内含40μl Dosper和10μg DNA；Dosper-pAAV-LacZ组：注射复合物100μl，内含40μl Dosper和10μg DNA； Dosper组：只含40μl Dosper。各组每只小鼠均连续注射2次，隔2d注射一次，随后观察肿瘤生长情况及荷瘤鼠生存情况。每组另有2只鼠于最后一次注射治疗后2d取瘤组织抽RNA。
1.5 RT-PCR分析IFN-γ表达 用TRIzol抽提总RNA，逆转录后行PCR。取15μl产物电泳，扩增片段为465bp。fk/!, 百拇医药
1.6 免疫组化检测β-gal表达 按常规法进行。Anti-β-gal稀释度为1∶50。fk/!, 百拇医药
1.7 IFNγ活性检测 用L929的细胞毒性试验，结果用小鼠IFNγ标准品(Boehringer公司，5 000U/μg)标化。fk/!, 百拇医药
1.8 抑瘤效应及荷瘤鼠生存情况 自治疗开始起，每隔5d测量肿瘤大小1次，结果用二垂直方向直径平均值表示，同时观察生存情况。结果经统计学方法处理。fk/!, 百拇医药
2 结果fk/!, 百拇医药
2.1 脂质体介导质粒DNA转染的优化 为了提高阳离子脂质体介导基因转染MM45T. Li的效率，选用3种阳离子脂质体，优化其转染条件。如图1所示，3种的最佳脂质体：DNA不同，Lipofectin和Dosper为4∶1，而LipofectAMINE为6∶1。转染效率最高的是Dosper。fk/!, 百拇医药
2.2 Dosper介导IFNγ基因的体外表达 经效率最好的Dosper介导IFNγ基因转导MMS45T.Li显示：随pAI-mIFNγ量的增加，IFNγ活性增高，可达1 600U/(48h.ml)，但超过0.9μg后，活性反而降低(见图2)。fk/!, 百拇医药
2.3 瘤体内注射复合物后IFNγ表达 抽提瘤组
fk/!, 百拇医药图 1不同脂质体转染效果fk/!, 百拇医药
Fig 1Transfection efficiency rates of different liposomes
fk/!, 百拇医药图 2IFNγ体外表达情况fk/!, 百拇医药
Fig 2In vitro expression of IFNγ gene in MM45 T.Li
织总RNA作RT-PCR分析。如图3，Dosper-pAI-mIFNγ组可见465bp带，另两组未见此带，表明瘤组织内有IFNγ mRNA，外源IFNγ基因获得表达。*9z395, http://www.100md.com
2.4 抗肿瘤作用 皮下荷瘤模型上直接瘤内注射复合物后，Dosper-pAI-mIFNγ组肿瘤生长明显受抑(P<0.01)。治疗组小鼠平均生存时间为38±6.8d，明显高于LacZ组(28±4.5d)及Dosper组(29±6.2d)(P<0.01)。
*9z395, http://www.100md.com图 3瘤体组织RT-PCR产物电泳图*9z395, http://www.100md.com
Fig 3RT-PCR analysis of INFγ from transfected tumor tissues*9z395, http://www.100md.com
1：λ-DNA/Hind Ⅲ marker； 2：Dosper-pAI-mINFγ group；*9z395, http://www.100md.com
3：Dosper-pAAV-LacZ group； 4：Dosper group
*9z395, http://www.100md.com图 4治疗后各组肿瘤生长情况*9z395, http://www.100md.com
Fig 4Growth of tumors after treatment*9z395, http://www.100md.com
3 讨论*9z395, http://www.100md.com
阳离子脂质体介导基因转移技术是目前应用较多、很有发展前途的非病毒转移方法。新的阳离子脂质体不断研制成功，将大大提高其转导效率[3]。此外，所用真核质粒表达载体的优化改造将有助于进一步提高表达能力[4，5]。Philip等研究表明，含AAV-ITRs质粒载体可明显提高阳离子脂质体介导的基因表达效率，且可在分裂及非分裂细胞中较长时间表达[6]。利用此类载体已成功地将IL-2基因导入前列腺瘤、乳腺癌、卵巢癌及胰腺癌细胞，并获得较高水平、较长时间表达，照射后的瘤苗可诱导机体产生明显的抗肿瘤免疫[7]。此类ex vivo方法较繁琐。我们在构建的AAV增强型质粒基础上，先用报告基因观察了3种脂质体转染效率，显示Dosper最好。最佳条件下，体外将IFNγ基因导入MM45T.Li，表达活性达1 600U/(48h.ml)。在荷瘤模型上，IFNγ可明显抑制肿瘤生长，荷瘤鼠寿命延长，其机理可能是上调抗原加工和递呈因子(如MHC I等)，调节细胞毒T细胞的诱导，Mφ、NK和LAK的激活及其它免疫调节因子的诱导[8]。至于AAV质粒载体提高基因表达水平及延长表达时间，可能与AAV-ITRs促进质粒在核内聚集有关，但详细机理有待进一步研究。
第一作者：男，34岁，博士46hsn, 百拇医药
参考文献46hsn, 百拇医药
1 张景迎，陈诗书.肝细胞癌基因治疗的实验性研究进展.医学综述，1998，4：146hsn, 百拇医药
2 雷 虹，曹雪涛，于益芝，等.腺病毒介导IFN-γ基因转染的瘤苗体内抗肿瘤转移作用.免疫学杂志，1996，13：2946hsn, 百拇医药
3 Felgner PL. Improvements in cationic liposomes for in vivo gene transfer. Hum Gene Ther， 1996， 7：179146hsn, 百拇医药
4 Yew NS， Wysokenski DM， Wang KX， et al. Optimization of plasmid vectors for high-level expression in lung epithelial cells. Hum Gene Ther， 1997， 8：57546hsn, 百拇医药
5 Vieweg J， Boczkowski D， Roberson KM， et al. Efficient gene transfer with adeno-associated virus based plasmids complexed to cationic liposomes for gene therapy of human prostate cancer. Cancer Res， 1995， 55：236646hsn, 百拇医药
6 Philip R， Brunette E， Kilinski L， et al. Efficient and sustained gene expression in primary T lymphocytes and primary and cultured turnor cells mediated by adeno-associated virus plasmid DNA complexed to cationic liposomes. Mol Cell Biol， 1994， 14：241146hsn, 百拇医药
7 Clary BM， Covency EC， Philip R， et al. Inhibition of established pancreatic cancers following specific active immunotherapy with interleukin-2 gene-transduced tumor cells. Cancer Gene Therapy， 1997， 4：9746hsn, 百拇医药
8 Rosenthal FM， Cronin K， Bannerji R， et al. Augmentation of antitumor immunity by tumor cells transduced with a retroviral vector carrying the interleukin-2 and interferin-γ cDNAs. Blood， 1994， 83：128946hsn, 百拇医药
(1998-07-06收稿；1999-02-25修回)(张景迎 陈诗书)