一种新型IgM高效膜亲和色谱柱的制备*1
作者：葛常辉 周冬梅 邹汉法 朱正美^4?*]a:, 百拇医药
单位：葛常辉 朱正美(大连医科大学生物化学教研室 大连116027)；周冬梅 邹汉法(中科院大连化学物理研究所国家色谱中心)^4?*]a:, 百拇医药
关键词：亲和色谱 IgM IgG^4?*]a:, 百拇医药
免疫学杂志990418摘 要 采用活化的高效液相膜亲和介质为固相化载体，与纯化的人IgM抗体进行交联，制备了IgM高效膜亲和色谱柱，与IgG膜亲和柱比较了交联效率，并用相应的抗抗体通过HPLC测定了两者的亲和能力。在相同条件下，IgM的交联效率为IgG的一半，但最大亲和容量却与之相近，并且在一定范围内可以完全分离血清中抗IgM抗体。结果表明：IgM高效膜色谱柱可以高效快速亲和分离相应抗体。^4?*]a:, 百拇医药
中图号 R371.33^4?*]a:, 百拇医药
PREPARATION OF A NOVEL HIGH PERFORMANCE MEMBRANE CHROMATOGRAPHIC IgM COLUMN^4?*]a:, 百拇医药
Ge Changhui， Zhou Dongmei， Zou Hanfa， Zhu Zhengmei^4?*]a:, 百拇医药
(Department of Biochemistry， Dalian Medical University， Dalian116027)^4?*]a:, 百拇医药
Abstract IgM is often of low affinity and usually neglected as a tool of affinity chromatography. In this study， we have demonstrated that IgM can be useful by immoblized onto the high performance chromatographic cellulose membrane matrix. Comparison with IgG， the amount of immoblized IgM is lower (about 50% of IgG)， but it showed similar specific binding ability as IgG， 3.83mg anti-IgM/g matrix and 4.35mg anti-IgG/g matrix respectively. The specific elution was demonstrated mainly one protein band on SDS-PAGE. This result suggests an approach in immunoadsorbent technology where biomolecules can be analyzed and separated with affinity chromatography using IgM as a affinity material.
Key words Affinity chromatography， IgM， IgG:iw, 百拇医药
免疫球蛋白是一类生物活性大分子，和抗原具有特异的亲和能力，因此常被用于亲和色谱中以分离、纯化和分析各种抗原物质[1～3]。许多抗原如寡糖蛋白的抗体多为IgM，但在实际中应用IgM抗体作亲和配基较少[4]，这主要由于IgM分子比较大，产生空间位阻效应，使得IgM作为配基的交联效率和亲和效率较低。本文应用以甲基丙烯酸缩水甘油醚复合纤维膜为基质的膜色谱介质与纯化的人IgM和人IgG抗体交联，分别制备了IgM和IgG亲和色谱柱[5]，与高效液相色谱仪配套使用，快速纯化了抗人IgM和抗人IgG抗体；同时对两种抗体的交联效率及亲和效率做了比较，得到了满意的效果。:iw, 百拇医药
1 材料和方法:iw, 百拇医药
1.1 材料 正常人血清取自大连医科大学附属二院检验科；羊抗人IgM血清及羊抗人IgG血清购自北京北方同正生物试剂有限公司；蛋白A-Sepharose 4B和Sephadex G-200均为Pharamacia产品。高效液相膜色谱介质由中国科学院大连化学物理研究所色谱中心合成[5]。:iw, 百拇医药
1.2 方法:iw, 百拇医药
1.2.1 人血清IgG的纯化：取正常人血清5 ml，3 000 r/min离心去除杂质，上清加pH7.2的饱和硫酸铵至半饱和，4°C过夜，沉淀溶于PBS溶液中，加饱和硫酸铵至半饱和，4°C 4h，重复此操作1次；3 000 r/min离心，沉淀溶于0.1mol (pH8.0) Tris-HCl溶液，4 °C透析过夜，终体积约4ml通过蛋白A-Sepharose 4B亲和柱3次，收集流出液约5 ml待分离IgM。交联的IgG经0.01mol Tris-HCl冲洗后，用0.01mol (pH3.0)甘氨酸将IgG洗脱下来，接收管预加100 μl 1mol pH8.0的Tris-HCl中和，搜集洗脱液，经聚乙二醇20 000浓缩后待交联用。:iw, 百拇医药
1.2.2 人血清IgM的纯化：上述通过蛋白A-Sepharose 4B亲和柱的流出液和洗脱液经浓缩达约2ml，上样到Sephardex G-200柱，以0.01mol(pH8.0) PBS洗脱，流速1.8ml/5min，紫外A280监测，搜集合并含蛋白组分峰，聚乙二醇浓缩。经免疫双扩散及SDS-PAGE电泳[6]检测其纯度。
1.2.3 IgM和IgG与膜亲和色谱柱的制备：高效液相膜色谱介质由中科院大连化物所合成，分别取上述纯化的人IgM和IgG溶于pH8.0 Tris-HCl缓冲液中与0.15g高效液相膜色谱介质于室温(22°C)下循环过夜(约20 h)交联。检测交联前后的蛋白含量计算蛋白质交联量及交联效率。vz5:|&, http://www.100md.com
1.2.4 抗IgM和抗IgG的亲和纯化：交联后的IgM和IgG色谱柱经0.01mol(pH7.2) PBS平衡后分别以羊抗人IgM和羊抗人IgG血清(冻干品)为样品，以高效液相柱色谱系统(Waters产品)为分离检测系统，进行分离纯化。洗脱条件：流动相为0.05mol(pH7.2)PBS-0.02mol(pH2.3)甘氨酸，流速1ml/s，检测波长280 nm，灵敏度0.5 Aufs。以相同条件下蛋白A柱结合的IgG峰面积做参比计算蛋白含量[7]。vz5:|&, http://www.100md.com
2 结果vz5:|&, http://www.100md.com
2.1 人血清IgM和IgG的纯化比较 人血清IgM和IgG的纯化结果如表1所示。IgM纯化后免疫双扩散效价为1∶128，IgG效价为1∶512，还原性SDS-PAGE电泳结果显示为55KD和25KD两条带(图略)。vz5:|&, http://www.100md.com
表1 人血清IgM和IgG的纯化vz5:|&, http://www.100md.com
Tab 1 Purification of human IgM and IgG from serumvz5:|&, http://www.100md.com
Samplevz5:|&, http://www.100md.com
Volume(ml)vz5:|&, http://www.100md.com
Conc(mg/ml)vz5:|&, http://www.100md.com
Content(mg)vz5:|&, http://www.100md.com
Recoveryvz5:|&, http://www.100md.com
Serumvz5:|&, http://www.100md.com
5vz5:|&, http://www.100md.com
77.6vz5:|&, http://www.100md.com
388vz5:|&, http://www.100md.com
Precipitate of salting out
4:jq, 百拇医药
17.6:jq, 百拇医药
70.4:jq, 百拇医药
18.2%:jq, 百拇医药
Unpurified IgM:jq, 百拇医药
9:jq, 百拇医药
3.6:jq, 百拇医药
32.4:jq, 百拇医药
8.4%:jq, 百拇医药
Purified IgM:jq, 百拇医药
1.2:jq, 百拇医药
6.1:jq, 百拇医药
7.32:jq, 百拇医药
1.88%:jq, 百拇医药
IgG(protein-A elution):jq, 百拇医药
8:jq, 百拇医药
2.76:jq, 百拇医药
22.0:jq, 百拇医药
5.7%:jq, 百拇医药
2.2 人血清IgM和IgG的交联效率的比较 结果见表2。 表2 纯化人血清IgM和IgG与高效液相膜色谱介质的交联比较:jq, 百拇医药
Tab 2 Comparation of immobility of purified IgM and IgG to affinity matrix:jq, 百拇医药
IgM:jq, 百拇医药
IgG:jq, 百拇医药
Affinity matrix:jq, 百拇医药
0.15g:jq, 百拇医药
0.15g:jq, 百拇医药
Total protein'lmx(, 百拇医药
7.79mg'lmx(, 百拇医药
7.26mg'lmx(, 百拇医药
Elution protein'lmx(, 百拇医药
5.44mg'lmx(, 百拇医药
2.90mg'lmx(, 百拇医药
Linked protein'lmx(, 百拇医药
2.45mg/0.15g'lmx(, 百拇医药
4.36mg/0.15g'lmx(, 百拇医药
Efficiency'lmx(, 百拇医药
31%'lmx(, 百拇医药
60%'lmx(, 百拇医药
2.3 膜交联IgM和IgG的亲和效率的比较 以羊抗人IgM和羊抗人IgG血清为待分离物质，分别通过上述IgM和IgG柱，结果见图1和图2，检测分离前后的抗IgM和抗IgG的抗体含量比较IgM和IgG的亲和效率(见表3)。亲和纯化后的抗IgG抗体经SDS-PAGE电泳鉴定为55KD一条带，抗IgM抗体则主要为分子量56KD一条带(见图3)。
'lmx(, 百拇医药
图 1羊抗人IgG血清上样谱图'lmx(, 百拇医药
Fig 1Chromatogram of goat anti human IgG serum'lmx(, 百拇医药
1： Peak of non-affinity compenent'lmx(, 百拇医药
2： Peak of goat anti human IgG
'lmx(, 百拇医药
图 2羊抗人IgM血清上样谱图
Fig 2Chromatogram of goat anti hman IgM serum;g#v, http://www.100md.com
1：Peak of non-affinity compenent;g#v, http://www.100md.com
2：Peak of goat anti human IgM;g#v, http://www.100md.com
表3 IgM和IgG亲和柱亲和能力的比较;g#v, http://www.100md.com
Tab 3 Comparation of affinity of IgM column and IgG co-lumn to anti-antibody;g#v, http://www.100md.com
IgM Column;g#v, http://www.100md.com
IgG Column;g#v, http://www.100md.com
Affinity matrix;g#v, http://www.100md.com
0.15g;g#v, http://www.100md.com
0.15g;g#v, http://www.100md.com
Max.affinity;g#v, http://www.100md.com
capacity;g#v, http://www.100md.com
574μg/0.15g;g#v, http://www.100md.com
(3.83mg/g);g#v, http://www.100md.com
653μg/0.15g;g#v, http://www.100md.com
(4.35mg/g);g#v, http://www.100md.com
Loading protein;g#v, http://www.100md.com
207.6μg;g#v, http://www.100md.com
110μg;g#v, http://www.100md.com
Binding protein;g#v, http://www.100md.com
13.9μg;g#v, http://www.100md.com
16.8μg;g#v, http://www.100md.com
Binding/loading
6.7%6, http://www.100md.com
15.3%6, http://www.100md.com
Note：Max.Affinity capacity is the maximum loading protein with its elution having no specific binding.6, http://www.100md.com
Loading protein is less than maximum affinity protein.
6, http://www.100md.com
图 3亲和纯化后的抗人IgG抗体和抗人IgM抗体的电泳图谱6, http://www.100md.com
Fig 3SDS-PAGE of anti-human IgG and anti-human IgM6, http://www.100md.com
a：anti-serum；b：anti-human IgG；c：anti-human IgM6, http://www.100md.com
3 讨论6, http://www.100md.com
IgM和IgG等抗体分子由于具有特异结合能力，在生物检测分析和分离中的用处很多，尤其在亲和分离纯化中更是应用广泛[2]。6, http://www.100md.com
IgM分子为五聚体，分子大(达900KD)，相当于5个IgG分子，在单位空间内与亲和载体交联的抗体数量比IgG少；IgM分子与抗原结合位点虽然多(10个结合位点)，但其单个决定簇结合能力较弱(解离常数Kd>10-5M)，在亲和分离过程中因空间位阻等原因无法使全部结合位点充分发挥作用，使得结合特异底物的能力降低，因此利用IgM为工具纯化相应配体的方法远比IgM少得多。随着研究手段的不断发展，人们对以IgM为配基的亲和分离与分析方法开始重视起来。高效液相膜亲和介质是近年来出现的一种新型亲和载体，具有特异性高、非特异吸附低、分离速度快等优点；我们利用高效液相膜亲和介质与纯化的人IgM和人IgG抗体进行交联，结果显示IgM高效液相膜亲和色谱柱的IgM交联蛋白量为2.45mg，交联率为31%，比相同条件下IgG亲和色谱柱的交联蛋白量4.36mg(交联率60%)低一倍左右，但两者的最大(饱和)亲和量接近，分别相当于3.83mg蛋白/g膜介质和4.35 mg蛋白/g膜介质。表明IgM虽然因空间效应等因素降低了交联量，但交联后的IgM仍具有较高的亲和能力，并且在一定范围内两者均可以高效率特异亲和纯化分离相应抗抗体。本实验检测了非亲和洗脱峰回收液，其中没有特异性亲和物质，表明血清中抗IgM抗体和抗IgG抗体已分离完全，回收率达100%。交联制备的亲和柱可以反复使用，和高效液相色谱仪配套使用时可以大大缩短分离时间，一次分离过程仅需不到10min。
以上结果表明高效液相膜亲和法可以有效地固相化IgM抗体，利用HPLC可以达到高效快速分离相应抗IgM抗体的目的，分离效果与相同条件下的IgG亲和性相近。本实验为利用IgM快速分析或亲和纯化抗原/抗体提供了一种新的方法。)?s*&05, http://www.100md.com
* 国家自然科学基金资助项目(29635010，39770179))?s*&05, http://www.100md.com
第一作者：男，29岁，博士研究生)?s*&05, http://www.100md.com
参考文献)?s*&05, http://www.100md.com
1 黄嘉陵.用于纯化抗原性物质的单克隆抗体亲和层析术(一).细胞生物学杂志，1985，7(1)：37)?s*&05, http://www.100md.com
2 Jack GW. Immunoaffinity chromatography. Mol Biotechnol， 1994，1(1)：59)?s*&05, http://www.100md.com
3 Cuatrecasas P. Affinity chromatography. Annu Rev Biochem， 1971，40：259)?s*&05, http://www.100md.com
4 Strandh M， Ohlin M， Borrebaeck CA， et al. New approach to steroid separation based on a low affinity IgM Antibody. J Immunol Methods， 1998，214(1-2)：73)?s*&05, http://www.100md.com
5 邹汉法，周冬梅，杨 利，等.高效亲和膜色谱分析用介质极其合成方法.中国专利，97111908.2.1997-6-25)?s*&05, http://www.100md.com
6 Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteruophage T4. Nature， 1970；227：680)?s*&05, http://www.100md.com
7 周冬梅，邹汉法，杨 利，等.蛋白A高效亲和膜色谱法测定人血浆中免疫球蛋白G的含量.色谱，1998，16(3)：195)?s*&05, http://www.100md.com
(1999-06-21收稿)(葛常辉 周冬梅 邹汉法 朱正美)
单位：葛常辉 朱正美(大连医科大学生物化学教研室 大连116027)；周冬梅 邹汉法(中科院大连化学物理研究所国家色谱中心)^4?*]a:, 百拇医药
关键词：亲和色谱 IgM IgG^4?*]a:, 百拇医药
免疫学杂志990418摘 要 采用活化的高效液相膜亲和介质为固相化载体，与纯化的人IgM抗体进行交联，制备了IgM高效膜亲和色谱柱，与IgG膜亲和柱比较了交联效率，并用相应的抗抗体通过HPLC测定了两者的亲和能力。在相同条件下，IgM的交联效率为IgG的一半，但最大亲和容量却与之相近，并且在一定范围内可以完全分离血清中抗IgM抗体。结果表明：IgM高效膜色谱柱可以高效快速亲和分离相应抗体。^4?*]a:, 百拇医药
中图号 R371.33^4?*]a:, 百拇医药
PREPARATION OF A NOVEL HIGH PERFORMANCE MEMBRANE CHROMATOGRAPHIC IgM COLUMN^4?*]a:, 百拇医药
Ge Changhui， Zhou Dongmei， Zou Hanfa， Zhu Zhengmei^4?*]a:, 百拇医药
(Department of Biochemistry， Dalian Medical University， Dalian116027)^4?*]a:, 百拇医药
Abstract IgM is often of low affinity and usually neglected as a tool of affinity chromatography. In this study， we have demonstrated that IgM can be useful by immoblized onto the high performance chromatographic cellulose membrane matrix. Comparison with IgG， the amount of immoblized IgM is lower (about 50% of IgG)， but it showed similar specific binding ability as IgG， 3.83mg anti-IgM/g matrix and 4.35mg anti-IgG/g matrix respectively. The specific elution was demonstrated mainly one protein band on SDS-PAGE. This result suggests an approach in immunoadsorbent technology where biomolecules can be analyzed and separated with affinity chromatography using IgM as a affinity material.
Key words Affinity chromatography， IgM， IgG:iw, 百拇医药
免疫球蛋白是一类生物活性大分子，和抗原具有特异的亲和能力，因此常被用于亲和色谱中以分离、纯化和分析各种抗原物质[1～3]。许多抗原如寡糖蛋白的抗体多为IgM，但在实际中应用IgM抗体作亲和配基较少[4]，这主要由于IgM分子比较大，产生空间位阻效应，使得IgM作为配基的交联效率和亲和效率较低。本文应用以甲基丙烯酸缩水甘油醚复合纤维膜为基质的膜色谱介质与纯化的人IgM和人IgG抗体交联，分别制备了IgM和IgG亲和色谱柱[5]，与高效液相色谱仪配套使用，快速纯化了抗人IgM和抗人IgG抗体；同时对两种抗体的交联效率及亲和效率做了比较，得到了满意的效果。:iw, 百拇医药
1 材料和方法:iw, 百拇医药
1.1 材料 正常人血清取自大连医科大学附属二院检验科；羊抗人IgM血清及羊抗人IgG血清购自北京北方同正生物试剂有限公司；蛋白A-Sepharose 4B和Sephadex G-200均为Pharamacia产品。高效液相膜色谱介质由中国科学院大连化学物理研究所色谱中心合成[5]。:iw, 百拇医药
1.2 方法:iw, 百拇医药
1.2.1 人血清IgG的纯化：取正常人血清5 ml，3 000 r/min离心去除杂质，上清加pH7.2的饱和硫酸铵至半饱和，4°C过夜，沉淀溶于PBS溶液中，加饱和硫酸铵至半饱和，4°C 4h，重复此操作1次；3 000 r/min离心，沉淀溶于0.1mol (pH8.0) Tris-HCl溶液，4 °C透析过夜，终体积约4ml通过蛋白A-Sepharose 4B亲和柱3次，收集流出液约5 ml待分离IgM。交联的IgG经0.01mol Tris-HCl冲洗后，用0.01mol (pH3.0)甘氨酸将IgG洗脱下来，接收管预加100 μl 1mol pH8.0的Tris-HCl中和，搜集洗脱液，经聚乙二醇20 000浓缩后待交联用。:iw, 百拇医药
1.2.2 人血清IgM的纯化：上述通过蛋白A-Sepharose 4B亲和柱的流出液和洗脱液经浓缩达约2ml，上样到Sephardex G-200柱，以0.01mol(pH8.0) PBS洗脱，流速1.8ml/5min，紫外A280监测，搜集合并含蛋白组分峰，聚乙二醇浓缩。经免疫双扩散及SDS-PAGE电泳[6]检测其纯度。
1.2.3 IgM和IgG与膜亲和色谱柱的制备：高效液相膜色谱介质由中科院大连化物所合成，分别取上述纯化的人IgM和IgG溶于pH8.0 Tris-HCl缓冲液中与0.15g高效液相膜色谱介质于室温(22°C)下循环过夜(约20 h)交联。检测交联前后的蛋白含量计算蛋白质交联量及交联效率。vz5:|&, http://www.100md.com
1.2.4 抗IgM和抗IgG的亲和纯化：交联后的IgM和IgG色谱柱经0.01mol(pH7.2) PBS平衡后分别以羊抗人IgM和羊抗人IgG血清(冻干品)为样品，以高效液相柱色谱系统(Waters产品)为分离检测系统，进行分离纯化。洗脱条件：流动相为0.05mol(pH7.2)PBS-0.02mol(pH2.3)甘氨酸，流速1ml/s，检测波长280 nm，灵敏度0.5 Aufs。以相同条件下蛋白A柱结合的IgG峰面积做参比计算蛋白含量[7]。vz5:|&, http://www.100md.com
2 结果vz5:|&, http://www.100md.com
2.1 人血清IgM和IgG的纯化比较 人血清IgM和IgG的纯化结果如表1所示。IgM纯化后免疫双扩散效价为1∶128，IgG效价为1∶512，还原性SDS-PAGE电泳结果显示为55KD和25KD两条带(图略)。vz5:|&, http://www.100md.com
表1 人血清IgM和IgG的纯化vz5:|&, http://www.100md.com
Tab 1 Purification of human IgM and IgG from serumvz5:|&, http://www.100md.com
Samplevz5:|&, http://www.100md.com
Volume(ml)vz5:|&, http://www.100md.com
Conc(mg/ml)vz5:|&, http://www.100md.com
Content(mg)vz5:|&, http://www.100md.com
Recoveryvz5:|&, http://www.100md.com
Serumvz5:|&, http://www.100md.com
5vz5:|&, http://www.100md.com
77.6vz5:|&, http://www.100md.com
388vz5:|&, http://www.100md.com
Precipitate of salting out
4:jq, 百拇医药
17.6:jq, 百拇医药
70.4:jq, 百拇医药
18.2%:jq, 百拇医药
Unpurified IgM:jq, 百拇医药
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3.6:jq, 百拇医药
32.4:jq, 百拇医药
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Purified IgM:jq, 百拇医药
1.2:jq, 百拇医药
6.1:jq, 百拇医药
7.32:jq, 百拇医药
1.88%:jq, 百拇医药
IgG(protein-A elution):jq, 百拇医药
8:jq, 百拇医药
2.76:jq, 百拇医药
22.0:jq, 百拇医药
5.7%:jq, 百拇医药
2.2 人血清IgM和IgG的交联效率的比较 结果见表2。 表2 纯化人血清IgM和IgG与高效液相膜色谱介质的交联比较:jq, 百拇医药
Tab 2 Comparation of immobility of purified IgM and IgG to affinity matrix:jq, 百拇医药
IgM:jq, 百拇医药
IgG:jq, 百拇医药
Affinity matrix:jq, 百拇医药
0.15g:jq, 百拇医药
0.15g:jq, 百拇医药
Total protein'lmx(, 百拇医药
7.79mg'lmx(, 百拇医药
7.26mg'lmx(, 百拇医药
Elution protein'lmx(, 百拇医药
5.44mg'lmx(, 百拇医药
2.90mg'lmx(, 百拇医药
Linked protein'lmx(, 百拇医药
2.45mg/0.15g'lmx(, 百拇医药
4.36mg/0.15g'lmx(, 百拇医药
Efficiency'lmx(, 百拇医药
31%'lmx(, 百拇医药
60%'lmx(, 百拇医药
2.3 膜交联IgM和IgG的亲和效率的比较 以羊抗人IgM和羊抗人IgG血清为待分离物质，分别通过上述IgM和IgG柱，结果见图1和图2，检测分离前后的抗IgM和抗IgG的抗体含量比较IgM和IgG的亲和效率(见表3)。亲和纯化后的抗IgG抗体经SDS-PAGE电泳鉴定为55KD一条带，抗IgM抗体则主要为分子量56KD一条带(见图3)。
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Fig 1Chromatogram of goat anti human IgG serum'lmx(, 百拇医药
1： Peak of non-affinity compenent'lmx(, 百拇医药
2： Peak of goat anti human IgG
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Fig 2Chromatogram of goat anti hman IgM serum;g#v, http://www.100md.com
1：Peak of non-affinity compenent;g#v, http://www.100md.com
2：Peak of goat anti human IgM;g#v, http://www.100md.com
表3 IgM和IgG亲和柱亲和能力的比较;g#v, http://www.100md.com
Tab 3 Comparation of affinity of IgM column and IgG co-lumn to anti-antibody;g#v, http://www.100md.com
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6.7%6, http://www.100md.com
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Note：Max.Affinity capacity is the maximum loading protein with its elution having no specific binding.6, http://www.100md.com
Loading protein is less than maximum affinity protein.
6, http://www.100md.com图 3亲和纯化后的抗人IgG抗体和抗人IgM抗体的电泳图谱6, http://www.100md.com
Fig 3SDS-PAGE of anti-human IgG and anti-human IgM6, http://www.100md.com
a：anti-serum；b：anti-human IgG；c：anti-human IgM6, http://www.100md.com
3 讨论6, http://www.100md.com
IgM和IgG等抗体分子由于具有特异结合能力，在生物检测分析和分离中的用处很多，尤其在亲和分离纯化中更是应用广泛[2]。6, http://www.100md.com
IgM分子为五聚体，分子大(达900KD)，相当于5个IgG分子，在单位空间内与亲和载体交联的抗体数量比IgG少；IgM分子与抗原结合位点虽然多(10个结合位点)，但其单个决定簇结合能力较弱(解离常数Kd>10-5M)，在亲和分离过程中因空间位阻等原因无法使全部结合位点充分发挥作用，使得结合特异底物的能力降低，因此利用IgM为工具纯化相应配体的方法远比IgM少得多。随着研究手段的不断发展，人们对以IgM为配基的亲和分离与分析方法开始重视起来。高效液相膜亲和介质是近年来出现的一种新型亲和载体，具有特异性高、非特异吸附低、分离速度快等优点；我们利用高效液相膜亲和介质与纯化的人IgM和人IgG抗体进行交联，结果显示IgM高效液相膜亲和色谱柱的IgM交联蛋白量为2.45mg，交联率为31%，比相同条件下IgG亲和色谱柱的交联蛋白量4.36mg(交联率60%)低一倍左右，但两者的最大(饱和)亲和量接近，分别相当于3.83mg蛋白/g膜介质和4.35 mg蛋白/g膜介质。表明IgM虽然因空间效应等因素降低了交联量，但交联后的IgM仍具有较高的亲和能力，并且在一定范围内两者均可以高效率特异亲和纯化分离相应抗抗体。本实验检测了非亲和洗脱峰回收液，其中没有特异性亲和物质，表明血清中抗IgM抗体和抗IgG抗体已分离完全，回收率达100%。交联制备的亲和柱可以反复使用，和高效液相色谱仪配套使用时可以大大缩短分离时间，一次分离过程仅需不到10min。
以上结果表明高效液相膜亲和法可以有效地固相化IgM抗体，利用HPLC可以达到高效快速分离相应抗IgM抗体的目的，分离效果与相同条件下的IgG亲和性相近。本实验为利用IgM快速分析或亲和纯化抗原/抗体提供了一种新的方法。)?s*&05, http://www.100md.com
* 国家自然科学基金资助项目(29635010，39770179))?s*&05, http://www.100md.com
第一作者：男，29岁，博士研究生)?s*&05, http://www.100md.com
参考文献)?s*&05, http://www.100md.com
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(1999-06-21收稿)(葛常辉 周冬梅 邹汉法 朱正美)