地高辛标记的cDNA探针检测GM-CSFmRNA表达*
作者：王亚平 王 勇 郑 敏 姜 蓉 李 静2q, http://www.100md.com
单位：重庆医科大学组织胚胎学教研室 重庆 4000462q, http://www.100md.com
关键词：CM-CSF cDNA探针 基因表达2q, http://www.100md.com
免疫学杂志990417摘 要 采用随机引物法对人GM-CSFcDNA探针进行地高辛标记，核酸分子原位杂交技术对人胸腺细胞、骨髓基质细胞、白血病细胞株(HL-60，K562)、脐血细胞和胎肝组织的GM-CSFmRNA的表达水平进行检测。结果表明：地高辛标记的GM-CSFcDNA探针使用简便、灵敏度高、特异性强、杂交结果直观，探针可较长时间保存和无放射性污染等优点。2q, http://www.100md.com
中图号 R392-332q, http://www.100md.com
DETECTION OF GM-CSFmRNA EXPRESSION WITH2q, http://www.100md.com
DIGOXIGENIN LABELED cDNA PROBE2q, http://www.100md.com
Wang Yaping，Wang Yong，Zheng Min，Jiang Rong，Li Jing2q, http://www.100md.com
(Dept.of Histology and Embryology，Chongqing University of Medical Sciences，Chonqing 400046)2q, http://www.100md.com
Abstract Human GM-CSF cDNA probe was prepared with pUC18-GM plasmid and labeled with digoxigenin-11-dUTP.By using the techniques of cell culture in vitro and in situ hybridization，it has detected to the GM-CSFmRNA expression of human fetal thymocyte，bone marrow stromal cell ，Leukemia cell line(HL-60，K562)，human cord blood mononuclear cells and fetal liver tissue.The results indicated that digoxigenin labeled GM-CSFcDNA probe can provide the sensitivity and simplicity of handling needed to replace radioactive probe in routine laboratory experiment and diagnostic assays.
Key words GM-CSF，cDNA probe，Gene expressionwdc, 百拇医药
粒巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是重要的造血调控因子，它在体内外能维持造血祖细胞的生存并促进其增殖分化[1]。目前，GM-CSF已广泛应用于临床治疗骨髓功能障碍、血液病、感染性疾病和肿瘤等[2]。迄今，GM-CSF的检测多采用以细胞培养为基础的生物活性检测，但GM-CSF可由机体的多种细胞和组织产生，因而该方法不仅难以反应GM-CSF基因转录水平，而且受细胞培养中诸多因素干扰，其特异性亦受一定的影响。本文应用核酸分子原位杂交技术，建立了GM-CSFmRNA表达的检测方法，为研究造血生长因子表达及调控机理提供了一个直观有效的研究手段。wdc, 百拇医药
1 材料与方法wdc, 百拇医药
1.1 主要试剂 pUC18-GM质粒(第三军医大学胡传敏博士提供)，核酸内切酶EcoRI和BamHI(Promega公司提供)，地高辛标记试剂盒(Boehringer Mannheim公司产品)，IMDM培养基(GIBCO公司产品)，rHGM-CSF和马血清(军事医学科学院提供)。wdc, 百拇医药
1.2 人GM-CSFcDNA探针制备及标记wdc, 百拇医药
1.2.1 GM-CSFcDNA探针制备：常规方法扩增和提取pUC18-GM质粒，质粒经EcoRI和BamHI双酶切后，1.5%琼脂糖凝胶电泳(50V，1.5h)，在紫外检测灯下取400bp处的GM-CSF-cDNA片段，经“V”型槽电泳(150V，30min)回收cDNA片段，经酚/氯仿抽提纯化，异丙醇沉淀，乙醇洗涤，-20°C保存备用。wdc, 百拇医药
1.2.2 GM-CSFcDNA探针标记：用Digoxigenin-11-dUTP作为标记物，随机引物法标记GM-CSFcDNA探针。标记程序参照宝灵曼公司DIG-High Prime试剂盒操作手册进行。wdc, 百拇医药
1.3 细胞培养 本室常规方法分离培养胎儿胸腺细胞、脐带血细胞和人骨髓基质细胞[3]，含10%小牛血清的1640培养液，传代培养HL-60和K562细胞。骨髓基质细胞和胸腺细胞培养时设立：IL-1诱导组，在培养体系中加IL-1(100u/ml)；对照组，常规培养，不加任何刺激或诱导剂。
1.4 原位杂交[4]#?, http://www.100md.com
1.4.1 切片制备：培养细胞经Cytospin涂在经多聚赖氨酸包被的载玻片上，4%多聚甲醛固定15min，PBS洗片。取胎肝，恒冷箱切片(5～15μm)，贴片，吹干后经4%多聚甲醛固定30min，放入70%酒精中置-20°C存放备用。#?, http://www.100md.com
1.4.2 杂交前处理：杂交前切片经如下处理：0.1%DEPC水浸泡20min，蛋白酶K(1μg/ml)37°C消化20min，0.2%甘氨酸5min，0.2N HCl20min，0.4%Triton x-100 5min，PBS洗片2次。#?, http://www.100md.com
1.4.3 预杂交与杂交：每张切片加预杂交液20μl，40°C湿盒30min，吸干预杂交液，加杂交液10～20μl，(含变性后的GM-CSFcDAN探针，1μg/ml)，40°C湿盒过夜。#?, http://www.100md.com
1.4.4 杂交后显色；杂交后切片经充分漂洗后，用含0.2%羊血清的封闭液封闭切片30min，加AKP标记的羊抗地高辛(Sheep anti-DIG-AKP)Fab片段，37°C湿盒孵育2h。以NBT/BCIP为显色系统，37°C显色1～10h，核固定衬染2min，脱水、封片、镜下观察。#?, http://www.100md.com
1.4.5 结果判断：光镜下GM-CSFmRNA表达阳性细胞的胞浆中可见紫蓝色颗粒，胞核染成红色。每张切片计数200个细胞，求出表达阳性细胞的百分率。反应程度依据胞浆中紫蓝色颗粒多少及颜色深浅分为强阳性(+++)，阳性(++)，弱阳性(+)和阴性(-)4级，分别计为3、2、1和0分，求积分指数。#?, http://www.100md.com
积分指数＝阳性细胞百分率×强度计分#?, http://www.100md.com
1.4.6 对照实验：实验设立的阴性对照组包括：未加探针而进行杂交；用RNase处理切片后再进行杂交，所有对照实验结果均为阴性。#?, http://www.100md.com
2 结果#?, http://www.100md.com
2.1 GM-CSFcDNA片段鉴定 扩增和提取的pUC18-GM质粒用EcoRI和BamHI双酶切后，经琼脂糖凝胶电泳分离，溴乙淀(EB)染色，在紫外检测灯下可见有约400bp的GM-CSFcDNA片段(见图1)。#?, http://www.100md.com
2.2 骨髓基质细胞(BMSC)GM-CSFmRNA的表达 GM-CSFmRNA表达阳性的BMSC胞浆中有紫蓝色颗粒，核染成红色。静止状态下BMSC的GM-CSFmRNA表达水平较低，经100u/ml IL-1诱导后BMSC的GM-CSFmRNA表达阳性率与表达强度明显提高(见图2，表1)
图 1琼脂糖凝胶电泳，示GM-CSFcDNA片段约为400bp;, 百拇医药
Fig 1Agarcose gel electrophoresis of CM-CSFcDNA fragment
;, 百拇医药
图 2IL-1诱导骨髓基质细胞后，可见GM-CSFmRNA表达增强×400;, 百拇医药
Fig 2Expression of GM-CSFmRNA was markedly promoted after inducing bone marrow stromal cell with IL-1×400;, 百拇医药
表1 IL-1对骨髓基质细胞表达GM-CSFmRNA的影响;, 百拇医药
Tab 1 Effect of IL-1 on GM-CSFmRNA expression of bone marrow stromal cells Groups;, 百拇医药
Positive cell ratio(%);, 百拇医药
Index;, 百拇医药
Control;, 百拇医药
13.0±4.5(n＝18);, 百拇医药
0.18±0.07(n＝18);, 百拇医药
IL-1 group;, 百拇医药
35.7±9.4*(n＝20);, 百拇医药
0.73±0.28(n＝20);, 百拇医药
*P<0.001 compared with control2.3 胸腺细胞GM-CSFmRNA表达 原位杂交结果表明：胸腺细胞GM-CSFmRNA杂交信号为强阳性(+++)，经IL-1(100u/ml)诱导后其表达阳性率和表达强度均明显提高(见图3，表2)。
图 3IL-1诱导人胎胸腺细胞后，GM-CSFmRNA表达增强。×40092, 百拇医药
Fig 3Expression of GM-CSFmRNA was markedly promoted after inducing human fetal thymocyte.×40092, 百拇医药
表2 IL-1对人胎胸腺细胞表达GM-CSFmRNA的影响92, 百拇医药
Tab 2 Effect of IL-1 on GM-CSFmRNA expression of human fetal thymocyte Groups92, 百拇医药
Positive cell ratio(%)92, 百拇医药
Index92, 百拇医药
Control92, 百拇医药
26.4±6.60(n＝18)92, 百拇医药
0.48±0.10(n＝18)92, 百拇医药
IL-1 group92, 百拇医药
39.1±10.2*(n＝20)92, 百拇医药
0.48±0.16(n＝20)92, 百拇医药
*P<0.001 compared with control2.4 肝组织GM-CSFmRNA表达 对肝组织切片进行原位杂交，结果显示：肝小叶下静脉内皮细胞的GM-CSFmRNA表达为阳性，提示肝小叶下静脉内皮细胞具有分泌GM-CSF的能力(见图4)。
92, 百拇医药
图 4胎肝GM-CSFmRNA表达，可见肝小叶下静脉内皮细胞内有阳性颗粒。×40092, 百拇医药
Fig 4GM-CSF expression of human fetal liver，positive granular in the endothial cell of sublobular vein.×400
2.5 脐血细胞、HL-60和K562细胞GM-CSFmRNA表达 用地高辛标记的GM-CSFcDNA探针，对脐血细胞、HL-60和K562细胞进行原位杂交，结果表明：在3种细胞中均未见有紫蓝色颗粒的阳性颗粒。c%+*{], http://www.100md.com
3 讨论c%+*{], http://www.100md.com
造血生长因子及其相应受体的基因表达是研究造血调控分子生物学机理的核心问题。粒巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是十分重要的早期造血调控因子，它不仅能刺激粒巨噬细胞集落的形成，而且对红系、巨核系造血祖细胞和造血干细胞的增殖分化均起着调控作用[1]。机体很多组织和细胞都能产生GM-CSF，尤其是活化的T细胞，TNF或IL-1诱导的巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞均能表达GM-CSF[5]。在实验室也可从胎肌、胎肺和胎盘等组织培养上清液中制备和提取GM-CSF。迄今为止，GM-CSF的检测多采用以细胞培养为基础的生物活性检测，该方法的缺点在于难以直观反应某种具体细胞或组织的GM-CSF基因转录水平，而且易受细胞培养中诸多因素干扰，其准确性亦受一定影响。因而探讨和寻找特异性强、灵敏度高的造血生长因子基因表达的检测方法就显得十分重要。c%+*{], http://www.100md.com
人GM-CSFcDNA基因于1985年克隆成功，并在哺乳动物细胞培养中得到表达[6]。人GM-CSF-cDNA由432bp组成，编码由144个氨基酸组成的糖蛋白，由于糖基化程度不同，GM-CSF的分子量在18～23KD之间。人与鼠的GM-CSFcDNA序列有80%的同源性，而氨基酸序列有60%的同源性，并有较强的交叉反应[7]。我们对pUC18-GM质粒进行扩增和提取，经双酶切后证明GM-CSFcDNA片段约为430bp，这与文献报道结果一致。本文以随机引物法将DIG-dUTP掺入到GM-CSFcDNA，制备出地高辛标记的GM-CSFcDNA探针。通过核酸分子原位杂交试用于多种培养细胞和组织，并严格设立阴性对照，即包括未加探针而进行杂交和用RNase处理切片后再进行杂交。结果表明：胸腺细胞、骨髓基质细胞和胎肝内皮细胞等GM-CSFmRNA阳性表达细胞的胞浆中可见紫蓝色颗粒；以IL-1诱导后骨髓基质细胞和胸腺细胞胞浆中紫蓝色颗粒明显增加，且阳性表达细胞数提高。根据计算表达阳性率和表达强度可检测GM-CSF在这些细胞和组织中的转录水平；脐血细胞、HL-60和K562等阴性表达细胞则未见胞浆中有杂交信号；而阴性对照组中各组细胞、组织均无阳性颗粒出现。结果表明：地高辛标记的GM-CSFcDNA探针具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果直观、又能长期保存和避免放射性污染等优点。
应用原位杂交技术不仅能从载玻片上直接观察细胞与组织GM-CSFmRNA的表达，还可通过与免疫组化法结合同时检测GM-CSF的蛋白表达水平，可见该研究能从基因转录和蛋白表达水平同时探讨GM-CSF的基因表达及调控因素，为进一步探讨GM-CSF在不同细胞和组织的表达与调控奠定了实验技术基础。.5]y:e, 百拇医药
*国家自然科学基金资助课题(39670880).5]y:e, 百拇医药
第一作者：男，42岁，硕士，教授.5]y:e, 百拇医药
参考文献.5]y:e, 百拇医药
1 Metcalf D.The molecular biology and function of the granulocyte-macrophage colony stimulating factors.Blood，1986，67(2)：257.5]y:e, 百拇医药
2 姚善谦,朱 军，刘海川，等.重组人粒/巨噬细胞集落刺激因子临床应用.实验血液学杂志，1994，2(2)：147.5]y:e, 百拇医药
3 王亚平，姜 蓉，王莎莉，等.当归多糖对人红系祖细胞增殖分化的影响及机理研究.重庆医科大学学报，1996，校庆特刊：7.5]y:e, 百拇医药
4 蔡文琴，王泊云.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术.成都：四川科学技术出版社，1994.406.5]y:e, 百拇医药
5 陈文杰.血液分子细胞生物学.北京：中国医药科技出版社，1993.84.5]y:e, 百拇医药
6 Scarffe JH.Emerging clinical use for GM-CSF.Eur J Cancer，1991，27：1493.5]y:e, 百拇医药
7 Wang G，Witek JS，Wilkens KM，et al.Human GM-CSF：Molecular cloning of the complementary DNA and purification of natural and recombinant protein.Science，1985，22：810.5]y:e, 百拇医药
(1998-10-22收稿：1999-01-31修回)(王亚平 王 勇 郑 敏 姜 蓉 李 静)
单位：重庆医科大学组织胚胎学教研室 重庆 4000462q, http://www.100md.com
关键词：CM-CSF cDNA探针 基因表达2q, http://www.100md.com
免疫学杂志990417摘 要 采用随机引物法对人GM-CSFcDNA探针进行地高辛标记，核酸分子原位杂交技术对人胸腺细胞、骨髓基质细胞、白血病细胞株(HL-60，K562)、脐血细胞和胎肝组织的GM-CSFmRNA的表达水平进行检测。结果表明：地高辛标记的GM-CSFcDNA探针使用简便、灵敏度高、特异性强、杂交结果直观，探针可较长时间保存和无放射性污染等优点。2q, http://www.100md.com
中图号 R392-332q, http://www.100md.com
DETECTION OF GM-CSFmRNA EXPRESSION WITH2q, http://www.100md.com
DIGOXIGENIN LABELED cDNA PROBE2q, http://www.100md.com
Wang Yaping，Wang Yong，Zheng Min，Jiang Rong，Li Jing2q, http://www.100md.com
(Dept.of Histology and Embryology，Chongqing University of Medical Sciences，Chonqing 400046)2q, http://www.100md.com
Abstract Human GM-CSF cDNA probe was prepared with pUC18-GM plasmid and labeled with digoxigenin-11-dUTP.By using the techniques of cell culture in vitro and in situ hybridization，it has detected to the GM-CSFmRNA expression of human fetal thymocyte，bone marrow stromal cell ，Leukemia cell line(HL-60，K562)，human cord blood mononuclear cells and fetal liver tissue.The results indicated that digoxigenin labeled GM-CSFcDNA probe can provide the sensitivity and simplicity of handling needed to replace radioactive probe in routine laboratory experiment and diagnostic assays.
Key words GM-CSF，cDNA probe，Gene expressionwdc, 百拇医药
粒巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是重要的造血调控因子，它在体内外能维持造血祖细胞的生存并促进其增殖分化[1]。目前，GM-CSF已广泛应用于临床治疗骨髓功能障碍、血液病、感染性疾病和肿瘤等[2]。迄今，GM-CSF的检测多采用以细胞培养为基础的生物活性检测，但GM-CSF可由机体的多种细胞和组织产生，因而该方法不仅难以反应GM-CSF基因转录水平，而且受细胞培养中诸多因素干扰，其特异性亦受一定的影响。本文应用核酸分子原位杂交技术，建立了GM-CSFmRNA表达的检测方法，为研究造血生长因子表达及调控机理提供了一个直观有效的研究手段。wdc, 百拇医药
1 材料与方法wdc, 百拇医药
1.1 主要试剂 pUC18-GM质粒(第三军医大学胡传敏博士提供)，核酸内切酶EcoRI和BamHI(Promega公司提供)，地高辛标记试剂盒(Boehringer Mannheim公司产品)，IMDM培养基(GIBCO公司产品)，rHGM-CSF和马血清(军事医学科学院提供)。wdc, 百拇医药
1.2 人GM-CSFcDNA探针制备及标记wdc, 百拇医药
1.2.1 GM-CSFcDNA探针制备：常规方法扩增和提取pUC18-GM质粒，质粒经EcoRI和BamHI双酶切后，1.5%琼脂糖凝胶电泳(50V，1.5h)，在紫外检测灯下取400bp处的GM-CSF-cDNA片段，经“V”型槽电泳(150V，30min)回收cDNA片段，经酚/氯仿抽提纯化，异丙醇沉淀，乙醇洗涤，-20°C保存备用。wdc, 百拇医药
1.2.2 GM-CSFcDNA探针标记：用Digoxigenin-11-dUTP作为标记物，随机引物法标记GM-CSFcDNA探针。标记程序参照宝灵曼公司DIG-High Prime试剂盒操作手册进行。wdc, 百拇医药
1.3 细胞培养 本室常规方法分离培养胎儿胸腺细胞、脐带血细胞和人骨髓基质细胞[3]，含10%小牛血清的1640培养液，传代培养HL-60和K562细胞。骨髓基质细胞和胸腺细胞培养时设立：IL-1诱导组，在培养体系中加IL-1(100u/ml)；对照组，常规培养，不加任何刺激或诱导剂。
1.4 原位杂交[4]#?, http://www.100md.com
1.4.1 切片制备：培养细胞经Cytospin涂在经多聚赖氨酸包被的载玻片上，4%多聚甲醛固定15min，PBS洗片。取胎肝，恒冷箱切片(5～15μm)，贴片，吹干后经4%多聚甲醛固定30min，放入70%酒精中置-20°C存放备用。#?, http://www.100md.com
1.4.2 杂交前处理：杂交前切片经如下处理：0.1%DEPC水浸泡20min，蛋白酶K(1μg/ml)37°C消化20min，0.2%甘氨酸5min，0.2N HCl20min，0.4%Triton x-100 5min，PBS洗片2次。#?, http://www.100md.com
1.4.3 预杂交与杂交：每张切片加预杂交液20μl，40°C湿盒30min，吸干预杂交液，加杂交液10～20μl，(含变性后的GM-CSFcDAN探针，1μg/ml)，40°C湿盒过夜。#?, http://www.100md.com
1.4.4 杂交后显色；杂交后切片经充分漂洗后，用含0.2%羊血清的封闭液封闭切片30min，加AKP标记的羊抗地高辛(Sheep anti-DIG-AKP)Fab片段，37°C湿盒孵育2h。以NBT/BCIP为显色系统，37°C显色1～10h，核固定衬染2min，脱水、封片、镜下观察。#?, http://www.100md.com
1.4.5 结果判断：光镜下GM-CSFmRNA表达阳性细胞的胞浆中可见紫蓝色颗粒，胞核染成红色。每张切片计数200个细胞，求出表达阳性细胞的百分率。反应程度依据胞浆中紫蓝色颗粒多少及颜色深浅分为强阳性(+++)，阳性(++)，弱阳性(+)和阴性(-)4级，分别计为3、2、1和0分，求积分指数。#?, http://www.100md.com
积分指数＝阳性细胞百分率×强度计分#?, http://www.100md.com
1.4.6 对照实验：实验设立的阴性对照组包括：未加探针而进行杂交；用RNase处理切片后再进行杂交，所有对照实验结果均为阴性。#?, http://www.100md.com
2 结果#?, http://www.100md.com
2.1 GM-CSFcDNA片段鉴定 扩增和提取的pUC18-GM质粒用EcoRI和BamHI双酶切后，经琼脂糖凝胶电泳分离，溴乙淀(EB)染色，在紫外检测灯下可见有约400bp的GM-CSFcDNA片段(见图1)。#?, http://www.100md.com
2.2 骨髓基质细胞(BMSC)GM-CSFmRNA的表达 GM-CSFmRNA表达阳性的BMSC胞浆中有紫蓝色颗粒，核染成红色。静止状态下BMSC的GM-CSFmRNA表达水平较低，经100u/ml IL-1诱导后BMSC的GM-CSFmRNA表达阳性率与表达强度明显提高(见图2，表1)
图 1琼脂糖凝胶电泳，示GM-CSFcDNA片段约为400bp;, 百拇医药
Fig 1Agarcose gel electrophoresis of CM-CSFcDNA fragment
;, 百拇医药图 2IL-1诱导骨髓基质细胞后，可见GM-CSFmRNA表达增强×400;, 百拇医药
Fig 2Expression of GM-CSFmRNA was markedly promoted after inducing bone marrow stromal cell with IL-1×400;, 百拇医药
表1 IL-1对骨髓基质细胞表达GM-CSFmRNA的影响;, 百拇医药
Tab 1 Effect of IL-1 on GM-CSFmRNA expression of bone marrow stromal cells Groups;, 百拇医药
Positive cell ratio(%);, 百拇医药
Index;, 百拇医药
Control;, 百拇医药
13.0±4.5(n＝18);, 百拇医药
0.18±0.07(n＝18);, 百拇医药
IL-1 group;, 百拇医药
35.7±9.4*(n＝20);, 百拇医药
0.73±0.28(n＝20);, 百拇医药
*P<0.001 compared with control2.3 胸腺细胞GM-CSFmRNA表达 原位杂交结果表明：胸腺细胞GM-CSFmRNA杂交信号为强阳性(+++)，经IL-1(100u/ml)诱导后其表达阳性率和表达强度均明显提高(见图3，表2)。
图 3IL-1诱导人胎胸腺细胞后，GM-CSFmRNA表达增强。×40092, 百拇医药
Fig 3Expression of GM-CSFmRNA was markedly promoted after inducing human fetal thymocyte.×40092, 百拇医药
表2 IL-1对人胎胸腺细胞表达GM-CSFmRNA的影响92, 百拇医药
Tab 2 Effect of IL-1 on GM-CSFmRNA expression of human fetal thymocyte Groups92, 百拇医药
Positive cell ratio(%)92, 百拇医药
Index92, 百拇医药
Control92, 百拇医药
26.4±6.60(n＝18)92, 百拇医药
0.48±0.10(n＝18)92, 百拇医药
IL-1 group92, 百拇医药
39.1±10.2*(n＝20)92, 百拇医药
0.48±0.16(n＝20)92, 百拇医药
*P<0.001 compared with control2.4 肝组织GM-CSFmRNA表达 对肝组织切片进行原位杂交，结果显示：肝小叶下静脉内皮细胞的GM-CSFmRNA表达为阳性，提示肝小叶下静脉内皮细胞具有分泌GM-CSF的能力(见图4)。
92, 百拇医药图 4胎肝GM-CSFmRNA表达，可见肝小叶下静脉内皮细胞内有阳性颗粒。×40092, 百拇医药
Fig 4GM-CSF expression of human fetal liver，positive granular in the endothial cell of sublobular vein.×400
2.5 脐血细胞、HL-60和K562细胞GM-CSFmRNA表达 用地高辛标记的GM-CSFcDNA探针，对脐血细胞、HL-60和K562细胞进行原位杂交，结果表明：在3种细胞中均未见有紫蓝色颗粒的阳性颗粒。c%+*{], http://www.100md.com
3 讨论c%+*{], http://www.100md.com
造血生长因子及其相应受体的基因表达是研究造血调控分子生物学机理的核心问题。粒巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是十分重要的早期造血调控因子，它不仅能刺激粒巨噬细胞集落的形成，而且对红系、巨核系造血祖细胞和造血干细胞的增殖分化均起着调控作用[1]。机体很多组织和细胞都能产生GM-CSF，尤其是活化的T细胞，TNF或IL-1诱导的巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞均能表达GM-CSF[5]。在实验室也可从胎肌、胎肺和胎盘等组织培养上清液中制备和提取GM-CSF。迄今为止，GM-CSF的检测多采用以细胞培养为基础的生物活性检测，该方法的缺点在于难以直观反应某种具体细胞或组织的GM-CSF基因转录水平，而且易受细胞培养中诸多因素干扰，其准确性亦受一定影响。因而探讨和寻找特异性强、灵敏度高的造血生长因子基因表达的检测方法就显得十分重要。c%+*{], http://www.100md.com
人GM-CSFcDNA基因于1985年克隆成功，并在哺乳动物细胞培养中得到表达[6]。人GM-CSF-cDNA由432bp组成，编码由144个氨基酸组成的糖蛋白，由于糖基化程度不同，GM-CSF的分子量在18～23KD之间。人与鼠的GM-CSFcDNA序列有80%的同源性，而氨基酸序列有60%的同源性，并有较强的交叉反应[7]。我们对pUC18-GM质粒进行扩增和提取，经双酶切后证明GM-CSFcDNA片段约为430bp，这与文献报道结果一致。本文以随机引物法将DIG-dUTP掺入到GM-CSFcDNA，制备出地高辛标记的GM-CSFcDNA探针。通过核酸分子原位杂交试用于多种培养细胞和组织，并严格设立阴性对照，即包括未加探针而进行杂交和用RNase处理切片后再进行杂交。结果表明：胸腺细胞、骨髓基质细胞和胎肝内皮细胞等GM-CSFmRNA阳性表达细胞的胞浆中可见紫蓝色颗粒；以IL-1诱导后骨髓基质细胞和胸腺细胞胞浆中紫蓝色颗粒明显增加，且阳性表达细胞数提高。根据计算表达阳性率和表达强度可检测GM-CSF在这些细胞和组织中的转录水平；脐血细胞、HL-60和K562等阴性表达细胞则未见胞浆中有杂交信号；而阴性对照组中各组细胞、组织均无阳性颗粒出现。结果表明：地高辛标记的GM-CSFcDNA探针具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果直观、又能长期保存和避免放射性污染等优点。
应用原位杂交技术不仅能从载玻片上直接观察细胞与组织GM-CSFmRNA的表达，还可通过与免疫组化法结合同时检测GM-CSF的蛋白表达水平，可见该研究能从基因转录和蛋白表达水平同时探讨GM-CSF的基因表达及调控因素，为进一步探讨GM-CSF在不同细胞和组织的表达与调控奠定了实验技术基础。.5]y:e, 百拇医药
*国家自然科学基金资助课题(39670880).5]y:e, 百拇医药
第一作者：男，42岁，硕士，教授.5]y:e, 百拇医药
参考文献.5]y:e, 百拇医药
1 Metcalf D.The molecular biology and function of the granulocyte-macrophage colony stimulating factors.Blood，1986，67(2)：257.5]y:e, 百拇医药
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(1998-10-22收稿：1999-01-31修回)(王亚平 王 勇 郑 敏 姜 蓉 李 静)