云芝多糖增强巨噬细胞M-CSF的表达与分泌*
作者：庞战军 陈 瑗 周 玫e@qg, 百拇医药
单位：第一军医大学生物化学与分子生物学研究所(自由基研究室)，广州 510515)e@qg, 百拇医药
关键词：云芝多糖 巨噬细胞集落刺激因子 基因表达 动脉粥样硬化 肿瘤e@qg, 百拇医药
免疫学杂志990410摘 要 为揭示云芝多糖作用与巨噬细胞M-CSF表达与分泌的关系，采用活性测定、斑点杂交等方法，将云芝多糖对小鼠腹腔巨噬细胞M-CSF表达及分泌的影响进行了探讨。结果显示，腹腔注射云芝多糖可以提高小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中的M-CSF活性，并使巨噬细胞M-CSF mRNA的含量增加；应用mRNA合成抑制剂及蛋白合成抑制剂的研究发现，actinomycin D及cycloheximide均能阻断云芝多糖对小鼠腹腔巨噬细胞M-CSF mRNA的诱导。e@qg, 百拇医药
中图号 R392.12，R977.7e@qg, 百拇医药
POLYSACCHARIDE KRESTIN INCREASE MACROPHAGEe@qg, 百拇医药
COLONY-STIMULATING FACTOR SECRETION ANDe@qg, 百拇医药
GENE EXPRESSION IN MOUSE PERITONEAL MACROPHAGESe@qg, 百拇医药
Pang Zhanjun，Chen Yuan，Zhou Meie@qg, 百拇医药
(Research Laboratory of Free Radical Medicine，The First Military Medical University，Guangzhou 510515)e@qg, 百拇医药
Abstract In order to find out if the effect of PSK is somewhat associated with its regulation of M-CSF expression in macrophages，we investigated the effect of PSK on M-CSF secretion and gene expression of mouse peritoneal macrophages.The results showed that，PSK could increase M-CSF secretion and gene expression of mouse peritoneal macrophages，and the induction of M-CSF mRNA could be blocked by incubation with actinomycin D and cycloheximide.
Key words Polysaccharide Krestin，Macrophage colony-stimulating factor，Gene expression，Atherosclerosis，Tumorn8;, 百拇医药
巨噬细胞属于遍布于机体内多种组织的单核吞噬细胞系统，对调节机体或局部微环境的免疫状态起着主要作用，并因此与肿瘤、动脉硬化等疾病的发生、发展及转归有关。巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor， M-CSF)是一种巨噬细胞特异性的生长因子，能促进单核/巨噬细胞前体的生长、增殖与分化，增强成熟巨噬细胞的功能与存活，对许多疾病的发生发展均有影响[1]。云芝多糖(polysaccharide Krestin， PSK)是从云芝子实体提取的一种蛋白结合多糖，可以影响巨噬细胞的功能，对肿瘤、炎症、动脉粥样硬化等疾病有治疗及预防作用[2，3]。考虑到PSK与M-CSF对疾病作用上的相似，为揭示PSK作用是否通过诱导M-CSF表达，对PSK在巨噬细胞M-CSF表达与分泌上的影响进行了探讨。n8;, 百拇医药
1 材料与方法n8;, 百拇医药
1.1 试剂 云芝多糖由我室按照文献[4]报道的方法从云芝子实体中提取，平均分子量约为1 200kD，其中含糖78%，用无菌生理盐水配制成1.5%(W/V)的溶液，脂多糖含量低于50pg/ml。含2.0kb小鼠M-CSF cDNA片段的pGEM-2质粒由Dr. Stanley (Albert Einstein College of Medicine of Yeshiva University， NY)惠赠；地高辛DNA标记试剂盒、DIG Easy Hyb、尼龙杂交膜、地高辛标记的1.5kb β-actin RNA探针购自德国宝灵曼公司；DMEM细胞培养基、MTT [3-(4，5-dimethythiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide]、2-疏基异丙醇、DEPC(diethyl pyrocarbonate)、异硫氰酸胍、Sarcosyl、actinomycin D、cycloheximide、acetovanilone购自美国Sigma公司；小牛血清为杭州四季青公司产品；其它试剂均为分析纯。n8;, 百拇医药
1.2 动物处理与腹腔巨噬细胞提取 雄性昆明鼠(4～5 周龄， 20±2.0g)购自本校实验动物中心，随机分为云芝多糖处理组与对照组。给予云芝多糖处理后，将小鼠拉颈处死，用PBS腹腔灌洗法采集腹腔巨噬细胞，1 000g离心7 min，将细胞沉淀用不含血清的DMEM培养基吹成悬液，接种于平皿中。经2 h贴壁后，洗去未贴壁细胞。
1.3 巨噬细胞条件培养液M-CSF活性测定 小鼠腹腔巨噬细胞在不含血清的DMEM培养基中培养一定时间后，取培养上清即作为巨噬细胞的条件培养液，其M-CSF活性测定采用MTT法[5]。取小鼠股骨骨髓细胞，并制成约5×106/ml的细胞悬液。向96孔板中每孔依次加入50 μl DMEM培养基或50 μl巨噬细胞条件培养液、50 μl骨髓细胞悬液、20%小牛血清、2.5×10-5 M 2-疏基乙醇。置37°C、5%CO2、饱和湿度下培养4d。然后向培养板中按20 μl/孔加入5mg/ml MTT(用PBS配制)，继续培养4h后倾去上清，用二甲亚砜溶解生成的紫色结晶，并在570 nm波长下于Σ960型ELISA酶标仪上比色。l, 百拇医药
1.4 杂交探针的制备与标记 将质粒导入E coli∶HB101，经扩增表达，采用碱裂解法抽提质粒，并用聚乙二醇法纯化。用限制性酶切获得所需DNA片段，并根据文献[6]报道的方法进行分离纯化，所得的小鼠M-CSF cDNA探针长度为2.0 kb。DNA探针的标记采用非放射性的地高辛标记方法，标记过程与标记效率检测按照试剂盒产品说明操作。l, 百拇医药
1.5 细胞总RNA的提取 采用异硫氰酸胍一步法提取[7]。以1 ml变性液(4 mol/L异硫氰酸胍；250 mol/L柠檬酸钠，pH7；0.5% Sarcosyl； 0.1 mol/L 2-疏基乙醇)于培养平皿内反复吹打使细胞裂解，并将细胞裂解液转移至离心管中。依次加入0.1ml 2 mol/L NaAc(pH4)，1 ml酚(水饱和)，0.2 ml氯仿-异戊醇(49∶1)，强烈振荡10s，冰浴15 min后，4°C，10 000g，离心20 min。小心吸取水相，转移至另一离心管中，加1 ml异丙醇，置-20°C过夜沉淀RNA。4°C， 10 000g，离心20 min。RNA沉淀溶于0.3 ml变性液，移至1.5 ml Eppendorf管，加1体积的异丙醇沉淀(-20°C，1h)。4°C离心10 min，RNA沉淀用75%的乙醇悬浮，真空干燥15 min，用50 μl DEPC处理的0.5% SDS于65°C下溶解10 min。用紫外分光光度法定量。l, 百拇医药
1.6 斑点杂交 按照文献报道的方法[8]稍加修改。将RNA样品在微量离心管中与下列试剂混合：RNA 10 μl、甲酰胺20 μl、37%甲醛7 μl、20×SSC 2μl， 68°C保温15 min，并迅速置冰浴中。将变性处理过的RNA样品在尼龙杂交膜上点样，于120°C烘烤15～30min固定。预温DIG Easy Hyb至杂交温度(42 °C)，取适当体积与膜在杂交温度共温30 min，轻微搅动。DNA探针经煮沸变性。按5～25ng/ml加至杂交液中，与膜继续杂交16 h。用2×SSC，0.1% SDS室温下洗膜2×5 min。再用0.1×SSC，0.1% SDS 68°C下不断搅动洗膜2×15 min。按照宝灵曼探针标记试剂盒产品说明检测杂交信号。将杂交膜放在热的二甲酰胺中脱色，并于68°C下在探针剥离液(50%甲酰胺；50mM Tris-C1，pH8；1% SDS)中洗30 min×2次以剥离探针，再与下一种探针杂交。
1.7 数据处理 杂交膜显色后，在UVP′s GDS 7500 Gel Documentation System上进行图像处理，杂交斑点的灰度值采用GelBase/GelBlot Pro软件包进行分析。数据均表示为均数±标准差(
±s)，统计学分析均采用两样本均数比较的t检验。7, 百拇医药
2 结果7, 百拇医药
2.1 腹腔注射云芝多糖使小鼠腹腔巨噬细胞M-CSF分泌增加 给实验组小鼠连续3 d腹腔注射1.5%云芝多糖，对照组以生理盐水代替，停注2 d后采集腹腔巨噬细胞，并于小平皿在不含血清的DMEM培养基中培养。从第2 d起，每隔24 h从培养体系中吸取100 μl条件培养液，并补充100 μl新鲜的DMEM培养基，连续7 d。然后用MTT法测定所取的条件培养液的集落刺激因子活性，以OD值作为测定指标。结果发现(见图1)，经云芝多糖处理的小鼠腹腔巨噬细胞的条件培养液具有比正常细胞更高的集落刺激因子活性，表现在其促使小鼠骨髓细胞增殖的能力提高。
7, 百拇医药
图 1PSK处理的小鼠腹腔巨噬细胞条件培养液中的集落刺激因子活性7, 百拇医药
Fig 1The colony stimulating activity of non-PSK-or PSK-treated mouse peritoneal macrophages conditioned medium (PM-CM)7, 百拇医药
Data were expressed as±s，n＝6.7, 百拇医药
2.2 云芝多糖增加小鼠腹腔巨噬细胞M-CSF基因的表达 云芝多糖处理组小鼠接受1.5%云芝多糖腹腔注射0.2ml×3d，对照组给予等量的生理盐水。停注2d后，采集腹腔巨噬细胞并提取总RNA，斑点杂交检测M-CSF基因的表达。结果显示：云芝多糖可以提高小鼠腹腔巨噬细胞M-CSF基因的表达(见图2)。
图 2PSK诱导小鼠腹腔巨噬细胞M-CSF表达ezw, 百拇医药
Fig 2PSK induced M-CSF expression in mouse peritoneal macrophagesezw, 百拇医药
Mice received PSK injection peritoneally(1.5%， 0.2ml) for 3 days before resident macrophages were collected by peritoneal lavage. The content of M-CSF mRNA in the cells was detected using dot hybridization analysis. The picture was scanned by a UVP′s GDS 7500 Gel Documentation System and the optical density was determined by GelBase/GelBlot Pro analysis. Data were expressed as±s，n＝3.As compared to the control，*P<0.05.ezw, 百拇医药
2.3 云芝多糖对小鼠腹腔巨噬细胞M-CSF基因表达的调节 给予小鼠腹腔注射1.5%云芝多糖0.2ml×1d，腹腔灌洗法采集腹腔巨噬细胞，接种于4个平皿中，经2 h贴壁以纯化巨噬细胞。在细胞培养基中分别加入下列试剂：actinomycin D 5μg/ml； cycloheximide 30μg/ml； acetovanilone 50μg/ml；另一组作为对照。作用24 h后，提取细胞总RNA，斑点杂交检测M-CSF mRNA的含量。结果显示：经actinomycin D或cycloheximide处理的细胞M-CSF mRNA的含量减少(见图3)。
图 3Actinomycin D、 cycloheximide和acetovanilone对PSK诱导的[.7as?., http://www.100md.com
小鼠腹腔巨噬细胞M-CSF表达的影响[.7as?., http://www.100md.com
Fig 3Effect of actinomycin D， cycloheximide and acetovanilone on the induction of M-CSF expression in mouse peritoneal macrophages by PSK[.7as?., http://www.100md.com
Mice received PSK injection peritoneally(1.5%，0.2 ml)for only 1 day before resident macrophages were collected by peritoneal lavage. The cells were incubated with actinomycin D(5μg/ml)， cycloheximide(30μg/ml) and acetovanilone (50μg/ml) respectively for another 24 hours. And the content of M-CSF mRNA in the cells was detected using dot hybridization analysis. The picture was scanned by a UVP′s GDS 7500 Gel Documentation System and the optical density was determined by GelBase/GelBlot Pro analysis.[.7as?., http://www.100md.com
1：actinomycin D；2：cycloheximide；3：acetovanilone；4：control. Data were expressed as±s， n＝3. As compared to the control，*P<0.05.[.7as?., http://www.100md.com
3 讨论[.7as?., http://www.100md.com
M-CSF是可由单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、纤维母细胞等分泌的一种巨噬细胞特异性的生长因子，能促进单核/巨噬细胞前体的生长、增殖与分化，多种M-CSF基因已被克隆。M-CSF是一种糖蛋白，以自分泌或旁分泌的形式释放，被邻近或自身的M-CSF受体识别和结合，激活受体激酶而发挥作用。M-CSF能激活成熟巨噬细胞的一系列功能[9]，其中包括促使巨噬细胞排出细胞内胆固醇，激活细胞内胆固醇水解酶、胆固醇脂酰转移酶等以降低细胞内胆固醇含量，并能在基因调控、蛋白合成、蛋白稳定性等水平上增加巨噬细胞清道夫受体的表达，从而在动脉粥样硬化疾病发生发展过程中起重要作用。我们以前的研究还发现重组人M-CSF(rhM-CSF)能够防止tbOOH对小鼠腹腔巨噬细胞的氧化损伤[10]。近年来发现，rhM-CSF在抗肿瘤、抗炎治疗上具有重要作用。而在动脉粥样硬化疾病方面的研究则证实：持续静脉给予外源性M-CSF能够抑制Watanabe遗传性高脂血症家兔泡沫细胞形成、防止动脉粥样硬化的发展和缩小动脉粥样硬化斑块的面积[11]。
云芝多糖(PSK)是良好的非特异性免疫调节剂，其在抗肿瘤细胞生长，抑制肿瘤病灶转移，提高机体免疫抗病能力等方面的研究和应用已受到广泛重视。实验证明：口服PSK可以显著抑制肿瘤细胞的生长，提高CD4+T细胞的抗癌能力[12]；放疗后的肿瘤患者经用PSK治疗，取得更理想的抑瘤效果[13]；PSK在治疗食道癌、胃癌、肺癌时与化疗或放疗联合，可以减轻副作用及防止免疫功能下降[2]；PSK可以防止氧化修饰低密度脂蛋白(Ox-LDL)对巨噬细胞的氧化损伤以及继发的巨噬细胞泡沫样变[14]；PSK能够预防和治疗实验性动脉粥样硬化[15]。)2, 百拇医药
巨噬细胞作为机体内重要的免疫细胞，参与了几乎所有与机体或局部免疫状态改变有关的疾病的病理过程，包括炎症、肿瘤、动脉粥样硬化等。云芝多糖在疾病治疗中的作用可能通过影响巨噬细胞的功能，包括增强巨噬细胞对氧化损伤的抗性，提高巨噬细胞杀伤病原体或瘤细胞的能力等。考虑到以上提及的云芝多糖及M-CSF生物学作用上的相似之处，我们推测云芝多糖的部分生物学作用可能通过调节巨噬细胞等M-CSF的生成而实现。因此我们探讨了云芝多糖对小鼠腹腔巨噬细胞M-CSF表达与分泌的影响，结果发现：腹腔注射云芝多糖可以增加小鼠腹腔巨噬细胞M-CSF的基因表达及分泌。)2, 百拇医药
actinomycin D常被用来抑制mRNA的合成；cycloheximide是蛋白合成的抑制剂；而acetovanilone则可以抑制细胞内源性O2-.的产生[16]。应用三种抑制剂的研究显示，actinomycin D和cycloheximide可以减少云芝多糖处理的小鼠腹腔巨噬细胞M-CSF mRNA合成，说明云芝多糖在转录水平对巨噬细胞M-CSF表达产生影响，并且某种新蛋白质的合成可能参与了云芝多糖对M-CSF基因的诱导，而诱导细胞内源性O2-.产生可能不是云芝多糖影响巨噬细胞M-CSF表达的主要途径。但其细胞内信号转导的分子机制有待进一步揭示。)2, 百拇医药
作为一种非特异性的免疫调节剂，云芝多糖还有很多其它的生物学效应。其可以增加机体IFN-γ、IL-2的产生和T淋巴细胞增殖，激活NK细胞[17]，抑制人肿瘤细胞热休克蛋白HSP47及HSP60的表达[18]；还具有失活单纯疱疹病毒(herpes simplex virus， HSV)的作用[19]。云芝多糖是许许多多蛋白结合多糖中的一种，研究云芝多糖的生物学作用与机理将有助于深入了解复合多糖的药理学功用。
*国家自然科学基金资助项目(39570867，39670197)3:, 百拇医药
第一作者：男，26岁，博士3:, 百拇医药
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(1998-11-30收稿；1999-03-16修回)(庞战军 陈 瑗 周 玫)
单位：第一军医大学生物化学与分子生物学研究所(自由基研究室)，广州 510515)e@qg, 百拇医药
关键词：云芝多糖 巨噬细胞集落刺激因子 基因表达 动脉粥样硬化 肿瘤e@qg, 百拇医药
免疫学杂志990410摘 要 为揭示云芝多糖作用与巨噬细胞M-CSF表达与分泌的关系，采用活性测定、斑点杂交等方法，将云芝多糖对小鼠腹腔巨噬细胞M-CSF表达及分泌的影响进行了探讨。结果显示，腹腔注射云芝多糖可以提高小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中的M-CSF活性，并使巨噬细胞M-CSF mRNA的含量增加；应用mRNA合成抑制剂及蛋白合成抑制剂的研究发现，actinomycin D及cycloheximide均能阻断云芝多糖对小鼠腹腔巨噬细胞M-CSF mRNA的诱导。e@qg, 百拇医药
中图号 R392.12，R977.7e@qg, 百拇医药
POLYSACCHARIDE KRESTIN INCREASE MACROPHAGEe@qg, 百拇医药
COLONY-STIMULATING FACTOR SECRETION ANDe@qg, 百拇医药
GENE EXPRESSION IN MOUSE PERITONEAL MACROPHAGESe@qg, 百拇医药
Pang Zhanjun，Chen Yuan，Zhou Meie@qg, 百拇医药
(Research Laboratory of Free Radical Medicine，The First Military Medical University，Guangzhou 510515)e@qg, 百拇医药
Abstract In order to find out if the effect of PSK is somewhat associated with its regulation of M-CSF expression in macrophages，we investigated the effect of PSK on M-CSF secretion and gene expression of mouse peritoneal macrophages.The results showed that，PSK could increase M-CSF secretion and gene expression of mouse peritoneal macrophages，and the induction of M-CSF mRNA could be blocked by incubation with actinomycin D and cycloheximide.
Key words Polysaccharide Krestin，Macrophage colony-stimulating factor，Gene expression，Atherosclerosis，Tumorn8;, 百拇医药
巨噬细胞属于遍布于机体内多种组织的单核吞噬细胞系统，对调节机体或局部微环境的免疫状态起着主要作用，并因此与肿瘤、动脉硬化等疾病的发生、发展及转归有关。巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor， M-CSF)是一种巨噬细胞特异性的生长因子，能促进单核/巨噬细胞前体的生长、增殖与分化，增强成熟巨噬细胞的功能与存活，对许多疾病的发生发展均有影响[1]。云芝多糖(polysaccharide Krestin， PSK)是从云芝子实体提取的一种蛋白结合多糖，可以影响巨噬细胞的功能，对肿瘤、炎症、动脉粥样硬化等疾病有治疗及预防作用[2，3]。考虑到PSK与M-CSF对疾病作用上的相似，为揭示PSK作用是否通过诱导M-CSF表达，对PSK在巨噬细胞M-CSF表达与分泌上的影响进行了探讨。n8;, 百拇医药
1 材料与方法n8;, 百拇医药
1.1 试剂 云芝多糖由我室按照文献[4]报道的方法从云芝子实体中提取，平均分子量约为1 200kD，其中含糖78%，用无菌生理盐水配制成1.5%(W/V)的溶液，脂多糖含量低于50pg/ml。含2.0kb小鼠M-CSF cDNA片段的pGEM-2质粒由Dr. Stanley (Albert Einstein College of Medicine of Yeshiva University， NY)惠赠；地高辛DNA标记试剂盒、DIG Easy Hyb、尼龙杂交膜、地高辛标记的1.5kb β-actin RNA探针购自德国宝灵曼公司；DMEM细胞培养基、MTT [3-(4，5-dimethythiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide]、2-疏基异丙醇、DEPC(diethyl pyrocarbonate)、异硫氰酸胍、Sarcosyl、actinomycin D、cycloheximide、acetovanilone购自美国Sigma公司；小牛血清为杭州四季青公司产品；其它试剂均为分析纯。n8;, 百拇医药
1.2 动物处理与腹腔巨噬细胞提取 雄性昆明鼠(4～5 周龄， 20±2.0g)购自本校实验动物中心，随机分为云芝多糖处理组与对照组。给予云芝多糖处理后，将小鼠拉颈处死，用PBS腹腔灌洗法采集腹腔巨噬细胞，1 000g离心7 min，将细胞沉淀用不含血清的DMEM培养基吹成悬液，接种于平皿中。经2 h贴壁后，洗去未贴壁细胞。
1.3 巨噬细胞条件培养液M-CSF活性测定 小鼠腹腔巨噬细胞在不含血清的DMEM培养基中培养一定时间后，取培养上清即作为巨噬细胞的条件培养液，其M-CSF活性测定采用MTT法[5]。取小鼠股骨骨髓细胞，并制成约5×106/ml的细胞悬液。向96孔板中每孔依次加入50 μl DMEM培养基或50 μl巨噬细胞条件培养液、50 μl骨髓细胞悬液、20%小牛血清、2.5×10-5 M 2-疏基乙醇。置37°C、5%CO2、饱和湿度下培养4d。然后向培养板中按20 μl/孔加入5mg/ml MTT(用PBS配制)，继续培养4h后倾去上清，用二甲亚砜溶解生成的紫色结晶，并在570 nm波长下于Σ960型ELISA酶标仪上比色。l, 百拇医药
1.4 杂交探针的制备与标记 将质粒导入E coli∶HB101，经扩增表达，采用碱裂解法抽提质粒，并用聚乙二醇法纯化。用限制性酶切获得所需DNA片段，并根据文献[6]报道的方法进行分离纯化，所得的小鼠M-CSF cDNA探针长度为2.0 kb。DNA探针的标记采用非放射性的地高辛标记方法，标记过程与标记效率检测按照试剂盒产品说明操作。l, 百拇医药
1.5 细胞总RNA的提取 采用异硫氰酸胍一步法提取[7]。以1 ml变性液(4 mol/L异硫氰酸胍；250 mol/L柠檬酸钠，pH7；0.5% Sarcosyl； 0.1 mol/L 2-疏基乙醇)于培养平皿内反复吹打使细胞裂解，并将细胞裂解液转移至离心管中。依次加入0.1ml 2 mol/L NaAc(pH4)，1 ml酚(水饱和)，0.2 ml氯仿-异戊醇(49∶1)，强烈振荡10s，冰浴15 min后，4°C，10 000g，离心20 min。小心吸取水相，转移至另一离心管中，加1 ml异丙醇，置-20°C过夜沉淀RNA。4°C， 10 000g，离心20 min。RNA沉淀溶于0.3 ml变性液，移至1.5 ml Eppendorf管，加1体积的异丙醇沉淀(-20°C，1h)。4°C离心10 min，RNA沉淀用75%的乙醇悬浮，真空干燥15 min，用50 μl DEPC处理的0.5% SDS于65°C下溶解10 min。用紫外分光光度法定量。l, 百拇医药
1.6 斑点杂交 按照文献报道的方法[8]稍加修改。将RNA样品在微量离心管中与下列试剂混合：RNA 10 μl、甲酰胺20 μl、37%甲醛7 μl、20×SSC 2μl， 68°C保温15 min，并迅速置冰浴中。将变性处理过的RNA样品在尼龙杂交膜上点样，于120°C烘烤15～30min固定。预温DIG Easy Hyb至杂交温度(42 °C)，取适当体积与膜在杂交温度共温30 min，轻微搅动。DNA探针经煮沸变性。按5～25ng/ml加至杂交液中，与膜继续杂交16 h。用2×SSC，0.1% SDS室温下洗膜2×5 min。再用0.1×SSC，0.1% SDS 68°C下不断搅动洗膜2×15 min。按照宝灵曼探针标记试剂盒产品说明检测杂交信号。将杂交膜放在热的二甲酰胺中脱色，并于68°C下在探针剥离液(50%甲酰胺；50mM Tris-C1，pH8；1% SDS)中洗30 min×2次以剥离探针，再与下一种探针杂交。
1.7 数据处理 杂交膜显色后，在UVP′s GDS 7500 Gel Documentation System上进行图像处理，杂交斑点的灰度值采用GelBase/GelBlot Pro软件包进行分析。数据均表示为均数±标准差(
±s)，统计学分析均采用两样本均数比较的t检验。7, 百拇医药2 结果7, 百拇医药
2.1 腹腔注射云芝多糖使小鼠腹腔巨噬细胞M-CSF分泌增加 给实验组小鼠连续3 d腹腔注射1.5%云芝多糖，对照组以生理盐水代替，停注2 d后采集腹腔巨噬细胞，并于小平皿在不含血清的DMEM培养基中培养。从第2 d起，每隔24 h从培养体系中吸取100 μl条件培养液，并补充100 μl新鲜的DMEM培养基，连续7 d。然后用MTT法测定所取的条件培养液的集落刺激因子活性，以OD值作为测定指标。结果发现(见图1)，经云芝多糖处理的小鼠腹腔巨噬细胞的条件培养液具有比正常细胞更高的集落刺激因子活性，表现在其促使小鼠骨髓细胞增殖的能力提高。
7, 百拇医药图 1PSK处理的小鼠腹腔巨噬细胞条件培养液中的集落刺激因子活性7, 百拇医药
Fig 1The colony stimulating activity of non-PSK-or PSK-treated mouse peritoneal macrophages conditioned medium (PM-CM)7, 百拇医药
Data were expressed as
±s，n＝6.7, 百拇医药2.2 云芝多糖增加小鼠腹腔巨噬细胞M-CSF基因的表达 云芝多糖处理组小鼠接受1.5%云芝多糖腹腔注射0.2ml×3d，对照组给予等量的生理盐水。停注2d后，采集腹腔巨噬细胞并提取总RNA，斑点杂交检测M-CSF基因的表达。结果显示：云芝多糖可以提高小鼠腹腔巨噬细胞M-CSF基因的表达(见图2)。
图 2PSK诱导小鼠腹腔巨噬细胞M-CSF表达ezw, 百拇医药
Fig 2PSK induced M-CSF expression in mouse peritoneal macrophagesezw, 百拇医药
Mice received PSK injection peritoneally(1.5%， 0.2ml) for 3 days before resident macrophages were collected by peritoneal lavage. The content of M-CSF mRNA in the cells was detected using dot hybridization analysis. The picture was scanned by a UVP′s GDS 7500 Gel Documentation System and the optical density was determined by GelBase/GelBlot Pro analysis. Data were expressed as
±s，n＝3.As compared to the control，*P<0.05.ezw, 百拇医药2.3 云芝多糖对小鼠腹腔巨噬细胞M-CSF基因表达的调节 给予小鼠腹腔注射1.5%云芝多糖0.2ml×1d，腹腔灌洗法采集腹腔巨噬细胞，接种于4个平皿中，经2 h贴壁以纯化巨噬细胞。在细胞培养基中分别加入下列试剂：actinomycin D 5μg/ml； cycloheximide 30μg/ml； acetovanilone 50μg/ml；另一组作为对照。作用24 h后，提取细胞总RNA，斑点杂交检测M-CSF mRNA的含量。结果显示：经actinomycin D或cycloheximide处理的细胞M-CSF mRNA的含量减少(见图3)。
图 3Actinomycin D、 cycloheximide和acetovanilone对PSK诱导的[.7as?., http://www.100md.com
小鼠腹腔巨噬细胞M-CSF表达的影响[.7as?., http://www.100md.com
Fig 3Effect of actinomycin D， cycloheximide and acetovanilone on the induction of M-CSF expression in mouse peritoneal macrophages by PSK[.7as?., http://www.100md.com
Mice received PSK injection peritoneally(1.5%，0.2 ml)for only 1 day before resident macrophages were collected by peritoneal lavage. The cells were incubated with actinomycin D(5μg/ml)， cycloheximide(30μg/ml) and acetovanilone (50μg/ml) respectively for another 24 hours. And the content of M-CSF mRNA in the cells was detected using dot hybridization analysis. The picture was scanned by a UVP′s GDS 7500 Gel Documentation System and the optical density was determined by GelBase/GelBlot Pro analysis.[.7as?., http://www.100md.com
1：actinomycin D；2：cycloheximide；3：acetovanilone；4：control. Data were expressed as
±s， n＝3. As compared to the control，*P<0.05.[.7as?., http://www.100md.com3 讨论[.7as?., http://www.100md.com
M-CSF是可由单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、纤维母细胞等分泌的一种巨噬细胞特异性的生长因子，能促进单核/巨噬细胞前体的生长、增殖与分化，多种M-CSF基因已被克隆。M-CSF是一种糖蛋白，以自分泌或旁分泌的形式释放，被邻近或自身的M-CSF受体识别和结合，激活受体激酶而发挥作用。M-CSF能激活成熟巨噬细胞的一系列功能[9]，其中包括促使巨噬细胞排出细胞内胆固醇，激活细胞内胆固醇水解酶、胆固醇脂酰转移酶等以降低细胞内胆固醇含量，并能在基因调控、蛋白合成、蛋白稳定性等水平上增加巨噬细胞清道夫受体的表达，从而在动脉粥样硬化疾病发生发展过程中起重要作用。我们以前的研究还发现重组人M-CSF(rhM-CSF)能够防止tbOOH对小鼠腹腔巨噬细胞的氧化损伤[10]。近年来发现，rhM-CSF在抗肿瘤、抗炎治疗上具有重要作用。而在动脉粥样硬化疾病方面的研究则证实：持续静脉给予外源性M-CSF能够抑制Watanabe遗传性高脂血症家兔泡沫细胞形成、防止动脉粥样硬化的发展和缩小动脉粥样硬化斑块的面积[11]。
云芝多糖(PSK)是良好的非特异性免疫调节剂，其在抗肿瘤细胞生长，抑制肿瘤病灶转移，提高机体免疫抗病能力等方面的研究和应用已受到广泛重视。实验证明：口服PSK可以显著抑制肿瘤细胞的生长，提高CD4+T细胞的抗癌能力[12]；放疗后的肿瘤患者经用PSK治疗，取得更理想的抑瘤效果[13]；PSK在治疗食道癌、胃癌、肺癌时与化疗或放疗联合，可以减轻副作用及防止免疫功能下降[2]；PSK可以防止氧化修饰低密度脂蛋白(Ox-LDL)对巨噬细胞的氧化损伤以及继发的巨噬细胞泡沫样变[14]；PSK能够预防和治疗实验性动脉粥样硬化[15]。)2, 百拇医药
巨噬细胞作为机体内重要的免疫细胞，参与了几乎所有与机体或局部免疫状态改变有关的疾病的病理过程，包括炎症、肿瘤、动脉粥样硬化等。云芝多糖在疾病治疗中的作用可能通过影响巨噬细胞的功能，包括增强巨噬细胞对氧化损伤的抗性，提高巨噬细胞杀伤病原体或瘤细胞的能力等。考虑到以上提及的云芝多糖及M-CSF生物学作用上的相似之处，我们推测云芝多糖的部分生物学作用可能通过调节巨噬细胞等M-CSF的生成而实现。因此我们探讨了云芝多糖对小鼠腹腔巨噬细胞M-CSF表达与分泌的影响，结果发现：腹腔注射云芝多糖可以增加小鼠腹腔巨噬细胞M-CSF的基因表达及分泌。)2, 百拇医药
actinomycin D常被用来抑制mRNA的合成；cycloheximide是蛋白合成的抑制剂；而acetovanilone则可以抑制细胞内源性O2-.的产生[16]。应用三种抑制剂的研究显示，actinomycin D和cycloheximide可以减少云芝多糖处理的小鼠腹腔巨噬细胞M-CSF mRNA合成，说明云芝多糖在转录水平对巨噬细胞M-CSF表达产生影响，并且某种新蛋白质的合成可能参与了云芝多糖对M-CSF基因的诱导，而诱导细胞内源性O2-.产生可能不是云芝多糖影响巨噬细胞M-CSF表达的主要途径。但其细胞内信号转导的分子机制有待进一步揭示。)2, 百拇医药
作为一种非特异性的免疫调节剂，云芝多糖还有很多其它的生物学效应。其可以增加机体IFN-γ、IL-2的产生和T淋巴细胞增殖，激活NK细胞[17]，抑制人肿瘤细胞热休克蛋白HSP47及HSP60的表达[18]；还具有失活单纯疱疹病毒(herpes simplex virus， HSV)的作用[19]。云芝多糖是许许多多蛋白结合多糖中的一种，研究云芝多糖的生物学作用与机理将有助于深入了解复合多糖的药理学功用。
*国家自然科学基金资助项目(39570867，39670197)3:, 百拇医药
第一作者：男，26岁，博士3:, 百拇医药
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(1998-11-30收稿；1999-03-16修回)(庞战军 陈 瑗 周 玫)