IFNγ和IL-6或IL-1联合应用对人肝癌细胞系C1抑制物合成的作用
作者：陈晓韧 谢佩蓉 郑 萍1p, http://www.100md.com
单位：第三军医大学免疫学教研室 重庆 4000381p, http://www.100md.com
关键词：细胞因子 C1抑制物 肝癌细胞系1p, http://www.100md.com
免疫学杂志990408摘 要 为研究细胞因子联合作用时对人肝癌细胞系C1抑制物(C1INH)合成的影响，用ELISA双夹心法测定了经细胞因子联合作用后HepG2和SMMC7712细胞培养上清中C1INH的含量。结果表明：IFNγ分别与IL-6和IL-1共同作用时，能显著增加人肝癌细胞系C1INH的合成，其作用强于同剂量IFNγ的单独作用。IL-1本身不能增加HepG2细胞C1INH的合成。IL-1对IL-6的上调没有增强作用，也无抑制作用。1p, http://www.100md.com
中图号 R392.111p, http://www.100md.com
EFFECT OF COMBINATIONS IFNγ WITH IL-6 OR IL-11p, http://www.100md.com
ON COMPLEMENT 1 INHIBITOR SYNTHESIS IN1p, http://www.100md.com
HUMAN HEPATOMA CELLS1p, http://www.100md.com
Chen Xiaoren，Xie Peirong，Zheng Ping1p, http://www.100md.com
(Department of Immunology，The Third Military Medical1p, http://www.100md.com
University，Chongqing 400038)1p, http://www.100md.com
Abstract In order to study the effect of cytokine combinations on C1 inhibitor(C1INH)synthesis in human hepatoma cells，we used sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to measure the concentration of C1INH in the supernatants stimulated by cytokine combinations.The results showed that IFNγ plus IL-6 or IL-1 could signi-ficantly stimulate C1INH synthesisa，which was more powerful than IFNγ alone.IL-1 did not significantly stimulate C1INH synthesis，and it had no effect on IL-6′s upregulation or downregeulation to the C1INH synthesis.
Key words Cytokine，C1 inhibitor，Hepatoma cellsvca, 百拇医药
C1INH作为一种主要的Ⅱ类补体急性时相蛋白(APP)，其合成受多种炎性细胞因子的调控[1]。由于人体有一个复杂的调控体系，各因子都不是孤立起作用的，因此各细胞因子间存在相互影响。为了解它们共同存在的情况下对C1INH合成的影响，本文选取了人肝癌细胞系HepG2和7712细胞，研究了IFNγ、IL-6、IL-1联合作用对细胞C1INH合成的变化。现报道如下：vca, 百拇医药
1 材料和方法vca, 百拇医药
1.1 主要试剂 RPMI 1640培养基购自Gibco；新生小牛血清(NCS)购自本校检验系；rIL-6，rIL-1及rIFNγ购自北京邦定生物医学公司；C1INH标准品及兔抗人C1INH血清购自上海生物制品研究所；羊抗鼠IgG酶标抗体购自北京中山公司；C1INH单抗F7由本室制备及纯化[2]。vca, 百拇医药
1.2 细胞系 人肝癌细胞系HepG2细胞(由中科院病毒所提供)和7712细胞(由重庆医科大学范维珂教授惠赠)，分别培养于含10%灭活NCS的RPMI-1640培养液中，内含链霉素100μg/ml，青霉素100u/ml，L-谷氨酰胺2mmol。vca, 百拇医药
1.3 细胞因子对肝癌细胞系C1INH合成的调节实验vca, 百拇医药
1.3.1 细胞的制备：HepG2和7712细胞培养成单层细胞后，用0.25%的胰蛋白酶消化，同时加入0.02%的EDTA以分散细胞，经洗涤后用含10%NCS的RPMI-1640稀释成105个细胞/ml，分别加至96孔Linbro细胞培养板中，每孔200μl，置于37°C、5%CO2孵箱中培养。vca, 百拇医药
1.3.2 刺激实验：上述细胞培养至第2d，镜下观察已长成单层细胞，此时即可吸出板中培养液，根据实验要求设计对照，并将各种细胞因子用培养液稀释成所需浓度，分别加入各孔中，每孔200μl。以此为0时相点，将培养板置于孵箱中继续培养，并分别于选定的各时相点收集培养上清，-20°C冻存备测。细胞培养上清中C1INH含量的测定及数据的统计学处理按文献[3]。vca, 百拇医药
2 结果
2.1 IFNγ和IL-6的联合作用 HepG2，7712细胞铺板长成单层后，吸出原培养液，将同时有IFNγ和IL-6(各为50u/ml)的培养液加入培养板，以IFN γ(50u/ml)为对照，分别于第1、2、3、4d收集细胞培养上清，用ELISA双夹心法检测其C1INH含量。结果显示，IL-6能明显增强IFN γ的作用，其C1INH合成量大于同剂量IFN γ的单独作用(见图1、图2)。
@;, http://www.100md.com
图 1IFNγ和IL-6对HepG2细胞系C1INH合成的联合作用s值已标出。@;, http://www.100md.com
Fig 1Effect of the combination IFNγ with IL-6 on C1INH synthesis in HepG2 cells@;, http://www.100md.com
s values are presented.
@;, http://www.100md.com
图 2IFN γ和IL-6对7712细胞C1INH合成的联合作用s值已标出。@;, http://www.100md.com
Fig 2Effect of the combination IFN γ with IL-6 on C1INH synthesis in 7712 cells@;, http://www.100md.com
s values are presented.@;, http://www.100md.com
2.2 IL-1及其与IL-6的联合作用 HepG2细胞铺板长成单层后，吸出原培养液，分别加入只含IL-1(100u/ml)或IL-6(100u/ml)和同时含有IL-1及IL-6(各为100u/ml)的培养液，对照则不含细胞因子，分别收集4d培养上清并检测C1INH的含量。可以发现，与对照相比，IL-1本身不能刺激HepG2细胞C1INH合成的显著增加，它与IL-6共同作用时，不具有增强作用，也未见其对IL-6作用的抑制，与IL-6(100u/ml)相比P>0.05(见图3)。
图 3IL-1和IL-6对HepG2细胞系C1INH合成的联合作用s值已标出。:, 百拇医药
Fig 3Effect of the combination IL-1 with IL-6 on C1INH synthesis in HepG2 cells:, 百拇医药
s values are presented.:, 百拇医药
2.3 IFNγ和IL-1的联合作用 HepG2细胞铺板长成单层后，吸出原培养液，分别加入只含IFNγ(100u/ml)和IL-1(100u/ml)及同时有IFNγ和IL-1(各为100u/ml)的培养液，分别收集4d培养上清并检测C1INH的含量。结果表明：从第2d以后IL-1能明显增强IFN γ的作用，培养上清中C1INH分泌量大于同剂量IFN γ的作用，与IL-1的作用相比则有极显著差异(见图4)。
:, 百拇医药
图 4IFN γ和IL-1对HepG2细胞C1INH合成的联合作用:, 百拇医药
s值和P值已标出：*P<0.01；**P<0.001与IL-1(100u/ml)相比。:, 百拇医药
Fig 4Effect of the combination IFN γ with IL-1 on C1INH synthesis in HepG2 cells:, 百拇医药
s and P values are presented.*P<0.01；**P<0.001compared with IL-1(100u/ml).:, 百拇医药
3 讨论:, 百拇医药
细胞因子间的协同效应对C1INH合成的影响是一个非常有意义的话题。IFNγ不仅能调节IL-6的产生，还与后者有显著的协同效应。二者联合作用时，HepG2和7712细胞C1INH合成的增加量高于IFN γ的单独作用，此时若加入IL-6的抗体会影响IL-6的作用，但对IFN γ的刺激作用并无影响[4]。因此，C1INH的合成至少可通过两条途径加以诱导，一是通过IL-6，二是借助IFN γ。它们有各自不同的刺激效应，一种因子的效应在另一种因子的共同作用下可以发生显著变化。补体APP合成的诱导是参与急性时相反应的特异性细胞因子作用的结果，它反映了外来刺激和机体炎症反应的程度。
IL-1是一种单核因子，可由多种细胞合成和分泌。它与肝细胞上的Ⅰ型受体结合后，通过Ras-MAPK信号传导途径，诱导活化蛋白-1(AP-1)，NF-κB和NF-IL6转录因子等，活化多种免疫分子的启动子，从而促进其基因表达[5]，它是急性时相反应时的主要介质之一。本实验表明，IL-1本身并不影响细胞C1INH的分泌。但是，它与IFN γ共同作用时，可以显著增加C1INH的合成，其C1INH的增加量大于同剂量IFN γ的单独作用。81, 百拇医药
C1INH是一种Ⅱ类APP，在IL-6类细胞因子刺激其合成增加时，再加入IL-1类细胞因子不会产生协同作用，有时甚至可能有抑制作用[5]。在急性时相期，IL-6可以部分介导IL-1的作用，二者的相互作用可通过两种途径实现：一是在产生过程中二者的交互作用；二是增加对方膜特异性受体的表达。不过，有关IL-1与IL-6共同作用时对C1INH合成的影响的结果报道却不尽相同：Bruce等于1990年报道IL-1对IL-6有明显的抑制作用，且与IL-1的加入时间有关[4]。Falus等人则于同年报道IL-1与低剂量IL-6(10u/ml)有明显的协同作用[6]；而在本实验中，IL-1(100u/ml)和IL-6(100u/ml)共同作用时，C1INH的合成量与同剂量IL-6单独作用时的效果较为接近，未见IL-1对其有明显抑制作用(P>0.05)。产生这种现象的原因可能是多方面的，如各实验室使用的HepG2细胞系可能分属不同的克隆株，重组IL-1在生产、活性等方面也有所不同，检测方法及实验器材的差异等。因此，IL-6和IL-1共同作用时对C1INH合成的确切作用，其细胞学特性和分子机制都还有待进一步探讨。本文丰富了细胞因子对人肝细胞系C1INH合成调控的资料，并为深入研究奠定了基础。81, 百拇医药
第一作者：女，29岁，硕士(现在空军总医院检验科 北京100036)81, 百拇医药
参考文献81, 百拇医药
1 陈晓韧，谢佩蓉.细胞因子对补体急性时相蛋白C1INH合成调控机制的研究.国外医学.免疫学分册，1999，22(1)：2181, 百拇医药
2 谢佩蓉，郑 萍，姜 曼，等.抗人C1-INH单克隆抗体的制备及其在分离人血清中C1-INH的作用.免疫学杂志，1991，7(1)：2281, 百拇医药
3 陈晓韧，谢佩蓉，郑 萍，等.IFN γ对U937细胞C1抑制物合成调控作用的研究.免疫学杂志，1998，14(4)：25081, 百拇医药
4 Bruce L，Zuraw，Martin Lotz.Regulation of the hepatic synthesis of C1 inhibitor by the hepatocyte stimulating factors interleukin 6 and interferon γ.J Bio Chem，1990，265：1266481, 百拇医药
5 John E，Volanakis.Transcriptional regulation of complement genes.Ann Rev Immunol，1995，13：27781, 百拇医药
6 Falus A，Rokita H，Walcz E，et al.Hormonal regulation of complement biosynthesis in human cell lines-Ⅱ.Upregulation of the biosynthesis of complement components C3，factor B and C1 inhibitor by interleukin-6 and interleukin-1 in human hepatoma cell line.Mol Immunol 1990，27：19781, 百拇医药
(1999-05-17收稿；1999-08-31修回)(陈晓韧 谢佩蓉 郑 萍)
单位：第三军医大学免疫学教研室 重庆 4000381p, http://www.100md.com
关键词：细胞因子 C1抑制物 肝癌细胞系1p, http://www.100md.com
免疫学杂志990408摘 要 为研究细胞因子联合作用时对人肝癌细胞系C1抑制物(C1INH)合成的影响，用ELISA双夹心法测定了经细胞因子联合作用后HepG2和SMMC7712细胞培养上清中C1INH的含量。结果表明：IFNγ分别与IL-6和IL-1共同作用时，能显著增加人肝癌细胞系C1INH的合成，其作用强于同剂量IFNγ的单独作用。IL-1本身不能增加HepG2细胞C1INH的合成。IL-1对IL-6的上调没有增强作用，也无抑制作用。1p, http://www.100md.com
中图号 R392.111p, http://www.100md.com
EFFECT OF COMBINATIONS IFNγ WITH IL-6 OR IL-11p, http://www.100md.com
ON COMPLEMENT 1 INHIBITOR SYNTHESIS IN1p, http://www.100md.com
HUMAN HEPATOMA CELLS1p, http://www.100md.com
Chen Xiaoren，Xie Peirong，Zheng Ping1p, http://www.100md.com
(Department of Immunology，The Third Military Medical1p, http://www.100md.com
University，Chongqing 400038)1p, http://www.100md.com
Abstract In order to study the effect of cytokine combinations on C1 inhibitor(C1INH)synthesis in human hepatoma cells，we used sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to measure the concentration of C1INH in the supernatants stimulated by cytokine combinations.The results showed that IFNγ plus IL-6 or IL-1 could signi-ficantly stimulate C1INH synthesisa，which was more powerful than IFNγ alone.IL-1 did not significantly stimulate C1INH synthesis，and it had no effect on IL-6′s upregulation or downregeulation to the C1INH synthesis.
Key words Cytokine，C1 inhibitor，Hepatoma cellsvca, 百拇医药
C1INH作为一种主要的Ⅱ类补体急性时相蛋白(APP)，其合成受多种炎性细胞因子的调控[1]。由于人体有一个复杂的调控体系，各因子都不是孤立起作用的，因此各细胞因子间存在相互影响。为了解它们共同存在的情况下对C1INH合成的影响，本文选取了人肝癌细胞系HepG2和7712细胞，研究了IFNγ、IL-6、IL-1联合作用对细胞C1INH合成的变化。现报道如下：vca, 百拇医药
1 材料和方法vca, 百拇医药
1.1 主要试剂 RPMI 1640培养基购自Gibco；新生小牛血清(NCS)购自本校检验系；rIL-6，rIL-1及rIFNγ购自北京邦定生物医学公司；C1INH标准品及兔抗人C1INH血清购自上海生物制品研究所；羊抗鼠IgG酶标抗体购自北京中山公司；C1INH单抗F7由本室制备及纯化[2]。vca, 百拇医药
1.2 细胞系 人肝癌细胞系HepG2细胞(由中科院病毒所提供)和7712细胞(由重庆医科大学范维珂教授惠赠)，分别培养于含10%灭活NCS的RPMI-1640培养液中，内含链霉素100μg/ml，青霉素100u/ml，L-谷氨酰胺2mmol。vca, 百拇医药
1.3 细胞因子对肝癌细胞系C1INH合成的调节实验vca, 百拇医药
1.3.1 细胞的制备：HepG2和7712细胞培养成单层细胞后，用0.25%的胰蛋白酶消化，同时加入0.02%的EDTA以分散细胞，经洗涤后用含10%NCS的RPMI-1640稀释成105个细胞/ml，分别加至96孔Linbro细胞培养板中，每孔200μl，置于37°C、5%CO2孵箱中培养。vca, 百拇医药
1.3.2 刺激实验：上述细胞培养至第2d，镜下观察已长成单层细胞，此时即可吸出板中培养液，根据实验要求设计对照，并将各种细胞因子用培养液稀释成所需浓度，分别加入各孔中，每孔200μl。以此为0时相点，将培养板置于孵箱中继续培养，并分别于选定的各时相点收集培养上清，-20°C冻存备测。细胞培养上清中C1INH含量的测定及数据的统计学处理按文献[3]。vca, 百拇医药
2 结果
2.1 IFNγ和IL-6的联合作用 HepG2，7712细胞铺板长成单层后，吸出原培养液，将同时有IFNγ和IL-6(各为50u/ml)的培养液加入培养板，以IFN γ(50u/ml)为对照，分别于第1、2、3、4d收集细胞培养上清，用ELISA双夹心法检测其C1INH含量。结果显示，IL-6能明显增强IFN γ的作用，其C1INH合成量大于同剂量IFN γ的单独作用(见图1、图2)。
@;, http://www.100md.com图 1IFNγ和IL-6对HepG2细胞系C1INH合成的联合作用s值已标出。@;, http://www.100md.com
Fig 1Effect of the combination IFNγ with IL-6 on C1INH synthesis in HepG2 cells@;, http://www.100md.com
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@;, http://www.100md.com图 2IFN γ和IL-6对7712细胞C1INH合成的联合作用s值已标出。@;, http://www.100md.com
Fig 2Effect of the combination IFN γ with IL-6 on C1INH synthesis in 7712 cells@;, http://www.100md.com
s values are presented.@;, http://www.100md.com
2.2 IL-1及其与IL-6的联合作用 HepG2细胞铺板长成单层后，吸出原培养液，分别加入只含IL-1(100u/ml)或IL-6(100u/ml)和同时含有IL-1及IL-6(各为100u/ml)的培养液，对照则不含细胞因子，分别收集4d培养上清并检测C1INH的含量。可以发现，与对照相比，IL-1本身不能刺激HepG2细胞C1INH合成的显著增加，它与IL-6共同作用时，不具有增强作用，也未见其对IL-6作用的抑制，与IL-6(100u/ml)相比P>0.05(见图3)。
图 3IL-1和IL-6对HepG2细胞系C1INH合成的联合作用s值已标出。:, 百拇医药
Fig 3Effect of the combination IL-1 with IL-6 on C1INH synthesis in HepG2 cells:, 百拇医药
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2.3 IFNγ和IL-1的联合作用 HepG2细胞铺板长成单层后，吸出原培养液，分别加入只含IFNγ(100u/ml)和IL-1(100u/ml)及同时有IFNγ和IL-1(各为100u/ml)的培养液，分别收集4d培养上清并检测C1INH的含量。结果表明：从第2d以后IL-1能明显增强IFN γ的作用，培养上清中C1INH分泌量大于同剂量IFN γ的作用，与IL-1的作用相比则有极显著差异(见图4)。
:, 百拇医药图 4IFN γ和IL-1对HepG2细胞C1INH合成的联合作用:, 百拇医药
s值和P值已标出：*P<0.01；**P<0.001与IL-1(100u/ml)相比。:, 百拇医药
Fig 4Effect of the combination IFN γ with IL-1 on C1INH synthesis in HepG2 cells:, 百拇医药
s and P values are presented.*P<0.01；**P<0.001compared with IL-1(100u/ml).:, 百拇医药
3 讨论:, 百拇医药
细胞因子间的协同效应对C1INH合成的影响是一个非常有意义的话题。IFNγ不仅能调节IL-6的产生，还与后者有显著的协同效应。二者联合作用时，HepG2和7712细胞C1INH合成的增加量高于IFN γ的单独作用，此时若加入IL-6的抗体会影响IL-6的作用，但对IFN γ的刺激作用并无影响[4]。因此，C1INH的合成至少可通过两条途径加以诱导，一是通过IL-6，二是借助IFN γ。它们有各自不同的刺激效应，一种因子的效应在另一种因子的共同作用下可以发生显著变化。补体APP合成的诱导是参与急性时相反应的特异性细胞因子作用的结果，它反映了外来刺激和机体炎症反应的程度。
IL-1是一种单核因子，可由多种细胞合成和分泌。它与肝细胞上的Ⅰ型受体结合后，通过Ras-MAPK信号传导途径，诱导活化蛋白-1(AP-1)，NF-κB和NF-IL6转录因子等，活化多种免疫分子的启动子，从而促进其基因表达[5]，它是急性时相反应时的主要介质之一。本实验表明，IL-1本身并不影响细胞C1INH的分泌。但是，它与IFN γ共同作用时，可以显著增加C1INH的合成，其C1INH的增加量大于同剂量IFN γ的单独作用。81, 百拇医药
C1INH是一种Ⅱ类APP，在IL-6类细胞因子刺激其合成增加时，再加入IL-1类细胞因子不会产生协同作用，有时甚至可能有抑制作用[5]。在急性时相期，IL-6可以部分介导IL-1的作用，二者的相互作用可通过两种途径实现：一是在产生过程中二者的交互作用；二是增加对方膜特异性受体的表达。不过，有关IL-1与IL-6共同作用时对C1INH合成的影响的结果报道却不尽相同：Bruce等于1990年报道IL-1对IL-6有明显的抑制作用，且与IL-1的加入时间有关[4]。Falus等人则于同年报道IL-1与低剂量IL-6(10u/ml)有明显的协同作用[6]；而在本实验中，IL-1(100u/ml)和IL-6(100u/ml)共同作用时，C1INH的合成量与同剂量IL-6单独作用时的效果较为接近，未见IL-1对其有明显抑制作用(P>0.05)。产生这种现象的原因可能是多方面的，如各实验室使用的HepG2细胞系可能分属不同的克隆株，重组IL-1在生产、活性等方面也有所不同，检测方法及实验器材的差异等。因此，IL-6和IL-1共同作用时对C1INH合成的确切作用，其细胞学特性和分子机制都还有待进一步探讨。本文丰富了细胞因子对人肝细胞系C1INH合成调控的资料，并为深入研究奠定了基础。81, 百拇医药
第一作者：女，29岁，硕士(现在空军总医院检验科 北京100036)81, 百拇医药
参考文献81, 百拇医药
1 陈晓韧，谢佩蓉.细胞因子对补体急性时相蛋白C1INH合成调控机制的研究.国外医学.免疫学分册，1999，22(1)：2181, 百拇医药
2 谢佩蓉，郑 萍，姜 曼，等.抗人C1-INH单克隆抗体的制备及其在分离人血清中C1-INH的作用.免疫学杂志，1991，7(1)：2281, 百拇医药
3 陈晓韧，谢佩蓉，郑 萍，等.IFN γ对U937细胞C1抑制物合成调控作用的研究.免疫学杂志，1998，14(4)：25081, 百拇医药
4 Bruce L，Zuraw，Martin Lotz.Regulation of the hepatic synthesis of C1 inhibitor by the hepatocyte stimulating factors interleukin 6 and interferon γ.J Bio Chem，1990，265：1266481, 百拇医药
5 John E，Volanakis.Transcriptional regulation of complement genes.Ann Rev Immunol，1995，13：27781, 百拇医药
6 Falus A，Rokita H，Walcz E，et al.Hormonal regulation of complement biosynthesis in human cell lines-Ⅱ.Upregulation of the biosynthesis of complement components C3，factor B and C1 inhibitor by interleukin-6 and interleukin-1 in human hepatoma cell line.Mol Immunol 1990，27：19781, 百拇医药
(1999-05-17收稿；1999-08-31修回)(陈晓韧 谢佩蓉 郑 萍)