重组人GM-CSF／IL-3融合蛋白(G3)的分离纯化PURIFICATION OF RECOMBINANT HUMAN GM-CSF／IL-3 FUSION PROTEIN(G3)
作者：黄 昕 邱宗荫0o, http://www.100md.com
单位：重庆医科大学医学检验系 重庆 4000460o, http://www.100md.com
关键词：0o, http://www.100md.com
免疫学杂志9904230o, http://www.100md.com
G3是由基因工程技术构建、在大肠杆菌中高效表达获得的由GM-CSF和IL-3组成的融合蛋白，能刺激造血细胞的增殖、分化和调节免疫应答。G3的生物学活性与GM-CSF和IL-3相比有明显提高[1]。本文用抗G3单抗(MG31)分别与CNBr-Sepharose 4B和rProtein A-Sepharose FF偶联制备免疫亲和色谱(IAC)柱，对G3进行纯化，取得了满意的结果。0o, http://www.100md.com
1 材料和方法0o, http://www.100md.com
1.1 MG31单抗[2]的纯化 饱和硫酸铵溶液沉淀法。0o, http://www.100md.com
1.2 MG31-CNBr-Sepharose 4B柱(A柱)的制备 见文献[3]。0o, http://www.100md.com
1.3 MG31-rProtein A-Sepharose FF柱(B柱)的制备 参照文献[4]并作较大改进。将单抗与rProtein A-Sepharose FF在室温下偶联，加入交联剂反应两次，经封闭液作用后装柱，用0.1mol/L gly-HCl(pH3.0)和0.1mol/L硼酸盐缓冲液(pH9.0)交替清洗3轮，再经0.05mol/L Tris-HCl+0.1mol/L NaCl(pH7.8)平衡后备用。0o, http://www.100md.com
1.4 G3的纯化 G3包涵体经变性、复性和浓缩后，以2.0ml/h流速分别上样于A、B两柱，洗去杂蛋白，再分别用0.1mol/L gly-HCl(pH2.6)和50%乙二醇(pH11.0)洗脱结合的G3，收集蛋白峰，经PBS缓冲液透析后检测G3的纯度及活性。0o, http://www.100md.com
1.5 G3的纯度分析 SDS-PAGE法[5]。
1.6 G3生物学活性检测 粒-单系祖细胞体外琼脂培养法[6]。ua9, 百拇医药
2 结果与讨论ua9, 百拇医药
2.1 G3的纯化结果 复性蛋白溶液经上柱、清洗和洗脱，AB两柱具有相似的纯化曲线，但B柱的蛋白回收率高于A柱，见表1。这说明单抗定向偶联于rProtein A-Sepharose FF有助于提高IAC柱的抗原结合容量。ua9, 百拇医药
表1 两种免疫亲和色谱柱对G3的纯化结果ua9, 百拇医药
Tab 1 Purification results of G3 by two kinds ofua9, 百拇医药
immunoaffinity chromatography columns IAC columnua9, 百拇医药
Loading amoutua9, 百拇医药
(mg)ua9, 百拇医药
Recovery amoutua9, 百拇医药
(mg)ua9, 百拇医药
Recovery rateua9, 百拇医药
(%)ua9, 百拇医药
Aua9, 百拇医药
2.92ua9, 百拇医药
0.28ua9, 百拇医药
9.6ua9, 百拇医药
Bua9, 百拇医药
2.92ua9, 百拇医药
0.44ua9, 百拇医药
15.1ua9, 百拇医药
2.2 纯化G3的纯度分析 经A、B两柱纯化的G3在SDS-PAGE图谱上均呈单一谱带，说明其达到电泳纯，分子量约为31KD。
2.3 纯化G3的生物学活性检测 纯化G3经粒-单系祖细胞体外琼脂培养法发现，对正常人骨髓细胞的集落形成具有明显的促进作用，见表2。G3用IAC柱纯化后，其生物学活性明显高于纯化前，在相同的蛋白浓度下，刺激正常骨髓细胞集落形成是后者的4倍强。表2 G3对正常骨髓细胞的集落刺激作用!:, http://www.100md.com
Tab 2 Colony Stimulating action of G3 to normal bone marrow cells!:, http://www.100md.com
G3(10ng/ml)!:, http://www.100md.com
G3 sample before!:, http://www.100md.com
purification!:, http://www.100md.com
(10ng/ml)!:, http://www.100md.com
Murine muscle!:, http://www.100md.com
extract!:, http://www.100md.com
(0.2ml)!:, http://www.100md.com
A*!:, http://www.100md.com
B**!:, http://www.100md.com
CFU-GM!:, http://www.100md.com
40.0±3.46!:, http://www.100md.com
38.25±2.52!:, http://www.100md.com
9.5±2.62!:, http://www.100md.com
49.0±2.99!:, http://www.100md.com
*G3 purified by A column；**G3 purified by B column!:, http://www.100md.com
本文使用不同的化学偶联法制备MG31-CNBr-Sepharose 4B柱和MG31-rProtein A-Sepharose FF柱，成功地一步纯化了大肠杆菌表达的G3。两柱纯化产物的纯度相似，但后者对G3的回收率(15.1%)高于前者的回收率(9.6%)，因此，MG31-rProtein A-Sepharose FF 柱更合适于G3的纯化。!:, http://www.100md.com
第一作者：男，30岁，博士，讲师!:, http://www.100md.com
参考文献!:, http://www.100md.com
1 刘 吉 力，马大龙.新型双分子细胞因子融合蛋白研究进展.生物化学与生物物理进展，1994，21：194!:, http://www.100md.com
2 黄 昕，蓝 轲，范维珂，等.重组人GM-CSF/IL-3融合蛋白(G3)单克隆抗体的研制和鉴定.重庆医科大学学报，1998，23：217!:, http://www.100md.com
3 Goding JW.Monoclonal antibodies：principle and practice.2nd ed.London：Academic Press，1986，225!:, http://www.100md.com
4 Sisson TH，Castor CW.An improved method for immolilizing IgG antibodies on protein A-agrose.J Immunol Methods，1990，127：215!:, http://www.100md.com
5 Maniatis.分子克隆.金冬雁，黎孟枫译.北京：科学出版社，1992.!:, http://www.100md.com
6 刘秀玲.造血祖细胞培养技术实验手册.北京：北京出版社，1993.25(黄 昕 邱宗荫)
单位：重庆医科大学医学检验系 重庆 4000460o, http://www.100md.com
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免疫学杂志9904230o, http://www.100md.com
G3是由基因工程技术构建、在大肠杆菌中高效表达获得的由GM-CSF和IL-3组成的融合蛋白，能刺激造血细胞的增殖、分化和调节免疫应答。G3的生物学活性与GM-CSF和IL-3相比有明显提高[1]。本文用抗G3单抗(MG31)分别与CNBr-Sepharose 4B和rProtein A-Sepharose FF偶联制备免疫亲和色谱(IAC)柱，对G3进行纯化，取得了满意的结果。0o, http://www.100md.com
1 材料和方法0o, http://www.100md.com
1.1 MG31单抗[2]的纯化 饱和硫酸铵溶液沉淀法。0o, http://www.100md.com
1.2 MG31-CNBr-Sepharose 4B柱(A柱)的制备 见文献[3]。0o, http://www.100md.com
1.3 MG31-rProtein A-Sepharose FF柱(B柱)的制备 参照文献[4]并作较大改进。将单抗与rProtein A-Sepharose FF在室温下偶联，加入交联剂反应两次，经封闭液作用后装柱，用0.1mol/L gly-HCl(pH3.0)和0.1mol/L硼酸盐缓冲液(pH9.0)交替清洗3轮，再经0.05mol/L Tris-HCl+0.1mol/L NaCl(pH7.8)平衡后备用。0o, http://www.100md.com
1.4 G3的纯化 G3包涵体经变性、复性和浓缩后，以2.0ml/h流速分别上样于A、B两柱，洗去杂蛋白，再分别用0.1mol/L gly-HCl(pH2.6)和50%乙二醇(pH11.0)洗脱结合的G3，收集蛋白峰，经PBS缓冲液透析后检测G3的纯度及活性。0o, http://www.100md.com
1.5 G3的纯度分析 SDS-PAGE法[5]。
1.6 G3生物学活性检测 粒-单系祖细胞体外琼脂培养法[6]。ua9, 百拇医药
2 结果与讨论ua9, 百拇医药
2.1 G3的纯化结果 复性蛋白溶液经上柱、清洗和洗脱，AB两柱具有相似的纯化曲线，但B柱的蛋白回收率高于A柱，见表1。这说明单抗定向偶联于rProtein A-Sepharose FF有助于提高IAC柱的抗原结合容量。ua9, 百拇医药
表1 两种免疫亲和色谱柱对G3的纯化结果ua9, 百拇医药
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2.2 纯化G3的纯度分析 经A、B两柱纯化的G3在SDS-PAGE图谱上均呈单一谱带，说明其达到电泳纯，分子量约为31KD。
2.3 纯化G3的生物学活性检测 纯化G3经粒-单系祖细胞体外琼脂培养法发现，对正常人骨髓细胞的集落形成具有明显的促进作用，见表2。G3用IAC柱纯化后，其生物学活性明显高于纯化前，在相同的蛋白浓度下，刺激正常骨髓细胞集落形成是后者的4倍强。表2 G3对正常骨髓细胞的集落刺激作用!:, http://www.100md.com
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B**!:, http://www.100md.com
CFU-GM!:, http://www.100md.com
40.0±3.46!:, http://www.100md.com
38.25±2.52!:, http://www.100md.com
9.5±2.62!:, http://www.100md.com
49.0±2.99!:, http://www.100md.com
*G3 purified by A column；**G3 purified by B column!:, http://www.100md.com
本文使用不同的化学偶联法制备MG31-CNBr-Sepharose 4B柱和MG31-rProtein A-Sepharose FF柱，成功地一步纯化了大肠杆菌表达的G3。两柱纯化产物的纯度相似，但后者对G3的回收率(15.1%)高于前者的回收率(9.6%)，因此，MG31-rProtein A-Sepharose FF 柱更合适于G3的纯化。!:, http://www.100md.com
第一作者：男，30岁，博士，讲师!:, http://www.100md.com
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1 刘 吉 力，马大龙.新型双分子细胞因子融合蛋白研究进展.生物化学与生物物理进展，1994，21：194!:, http://www.100md.com
2 黄 昕，蓝 轲，范维珂，等.重组人GM-CSF/IL-3融合蛋白(G3)单克隆抗体的研制和鉴定.重庆医科大学学报，1998，23：217!:, http://www.100md.com
3 Goding JW.Monoclonal antibodies：principle and practice.2nd ed.London：Academic Press，1986，225!:, http://www.100md.com
4 Sisson TH，Castor CW.An improved method for immolilizing IgG antibodies on protein A-agrose.J Immunol Methods，1990，127：215!:, http://www.100md.com
5 Maniatis.分子克隆.金冬雁，黎孟枫译.北京：科学出版社，1992.!:, http://www.100md.com
6 刘秀玲.造血祖细胞培养技术实验手册.北京：北京出版社，1993.25(黄 昕 邱宗荫)