小鼠白细胞介素-12融合蛋白编码基因的构建与表达研究
作者：成军 赵鸿 钟彦伟 刘妍 杨继珍 董菁 斯崇文 王勤环i&vk, 百拇医药
单位：成军(解放军302医院传染病研究所基因治疗研究中心，北京 100039)； 钟彦伟(解放军302医院传染病研究所基因治疗研究中心，北京 100039)； 刘妍(解放军302医院传染病研究所基因治疗研究中心，北京 100039)； 杨继珍(解放军302医院传染病研究所基因治疗研究中心，北京 100039)；i&vk, 百拇医药
关键词：白细胞介素-12；融合蛋白；转染；多聚酶链反应；甘氨酸接头i&vk, 百拇医药
免疫学杂志000110i&vk, 百拇医药
摘 要：目的 构建小鼠白细胞介素-12的融合基因，并进行初号表达。方法 通过重叠序列引物的设计与多聚酶链反应(PCR)技术，将小鼠IL-12的40kDa多肽链基因与35kDa多肽链基因，以甘氨酸接头(Gly4Ser)3序列连接成为融合蛋白编码基因，构建融合蛋白表达载体，转染小鼠成纤维细胞SVT2，表达具有生物学活性的融合蛋白型IL-12。结果 构建的小鼠IL-12表达载体经测序无突变发生。以G418筛选转染的SVT2细胞，获得数十个抗性细胞克隆，测定其IL-12生物学活性，分泌量达52.1～112.6pg/ml。表达的融合型小鼠IL-12具有生物学活性。结论 构建并表达了单链型小鼠白细胞介素-12。i&vk, 百拇医药
中图分类号：R392.11 文献标识码：Ai&vk, 百拇医药
Construction of murine interleukin-12 fusion protein coding gene and its expression in murine fibroblast cellsi&vk, 百拇医药
CHENG Jun ZHONG Yan-wei LIU Yan YANG Ji-zhen DONG Qing(Gene Therapy Research Center， Institute of Infectious Diseases， the 302 Hospital of PLA， Beijing 100039， China)i&vk, 百拇医药
ZHAO Hong SI Chong-wen WANG Qin-huani&vk, 百拇医药
(Department of Infectious Diseases， the First School of Clinical Medicine， Beijing Medical University， Beijing 100034，China)
Abstract：Objective To construct murine interleukin-12(IL-12) fusion protein coding sequence and express it in murine fibroblast cell line SVT2.Methods IL-12 fusion protein gene was constructed by overlaping primer design and polymerase chain reaction(PCR) amplification. The recombinant sequence was insert into pCR 2.1 and transfected into murine fibroblast cells with lipofectin method. G418 resistant cell clones were selected and IL-12 activity in culture medium was evaluated by measuring interferon γ(IFN γ) secretion of murine splenocyte stimulated by conditioned medium IL-12 secretion level was also detected.Results The capability of culture medium stimulating splenocyte proliferation was demonstrated. The concentration of IL-12 in culture supernatant ranged from 52.1 to 112.6 pg/ml.Conclusion According to the results， we conclude that recombinant vector could express bioactive IL-12 from transfected murine fibroblast cells.sd}t, 百拇医药
Key words：interleukin-12； fusion protein； transfection； polymerase chain reaction； glycine linker▲sd}t, 百拇医药
白细胞介素-12(IL-12)又称为自然杀伤细胞刺激因子(NKSF)，是一种由35kDa和40kDa两条多肽链借助二硫键的形成构成的异二聚体型细胞因子，主要作用于T细胞与NK细胞[1～3]。IL-12这两条多肽链是由两条不同的基因编码的，其表达调控的性质也不相同，由于IL-12是由2个不同的基因编码的，因而无论是以基因工程技术表达重组的IL-12，还是作为目的基因进行基因治疗，还是以其表达质粒DNA作为DNA疫苗的免疫共刺激信号，都涉及到了能同时表达两个基因的表达载体的构建。目前常用的绝大多数表达载体只能表达单一的外源基因，而且更为严重的是40kDa多肽过量表达形成的单体及同二聚体可与IL-12异二聚体竞争性结合特异性的受体，因而具有对天然的IL-12分子生物学活性的抑制作用，为IL-12的表达研究带来了很大困难。为此，本文以多聚酶链反应技术，将2个编码基因通过接头序列连接在一起，构建了融合蛋白的表达载体，并证明这种表达的融合蛋白具有天然IL-12的生物学活性。
1 材料与方法|7, 百拇医药
1.1 小鼠IL-12融合蛋白编码基因的构建 小鼠IL-12的35KDa和40kDa两条多肽链的cDNA片段克隆在pBluescript载体中，作为构建融合蛋白基因多聚酶链反应的模板。以引物1(5’-CTCGGAATTCATGTGTCCTCAGAAGCTAACCATC-3＇)和引物2(5＇-CCCGACCCACCACCGCCCGAGCCACC|7, 百拇医药
GCCACCGGATCGGACC CTGCAGG-3’＇)扩增40kDa多肽链基因片段；以引物3(5’-CGGGCGGTGGT|7, 百拇医药
GGGTCGGGTGGGGGCGGATCTAGGGTCATTCCAGTCTCTG-3＇)和引物4(5’-CTCGGGATCCTCAGGCGGA|7, 百拇医药
GCTCAGATAG-3’)扩增35kDa多肽链基因片段。以上述2种PCR产物混合作为模板，以引物1和4进行第三次PCR扩增，即获得上游为40kDa、下游为35kDa，中间为甘氨酸接头(Gly4Ser)3的融合蛋白的编码基因，克隆到pCR2.1(Invitrogen公司)中，命名为pCRIL-12(40-35)。|7, 百拇医药
1.2 融合蛋白编码基因的序列测定 参照文献[4]的方法对pCRIL-12(40-35)的核苷酸序列进行测定。|7, 百拇医药
1.3 小鼠IL-12融合蛋白真核表达载体的构建 以HindⅢ和XhoⅠ两种限制性内切酶分别消化pCRIL-12(40-35)和真核表达载体pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司)，收获从前者切割的1.6kb的融合型IL-12编码基因片段，定向克隆到pcDNA3.1(+)相应酶切位点上，为pCDIL-12(40-35)。|7, 百拇医药
1.4 小鼠成纤维细胞的体外转染 于转染实验的前1d，小鼠成纤维细胞SVT2以胰酶和EDTA溶液消化，使其密度达1×105/ml。转染前2h更换以完全新鲜培养基。转染时，先以不含胎牛血清的培养基冲洗细胞3次。以8μg的pcDNA3.1(+)或pCDIL-12(40-35)脂质体质粒DNA分别与80μl的脂质体在聚苯乙烯管中轻轻振荡混匀，室温下培育20min，以不含胎牛血清的培养基稀释脂质体-DNA混合物，转移到SVT2细胞的表面，转染11h，换以含有500μg/ml G418的选择性培养基。每3～4d更换选择培养基，直至肉眼可见的细胞集落出现。先以直型弯头吸管，以胰酶消化，将细胞集落先转移到24孔板中培养，长满后再转至细胞培养瓶中，收获上清测定IL-12的生物学活性。
1.5 IL-12生物学活性的测定 小鼠IL-12的生物学活性以文献[1]方法测定。以抗-IL-12的单克隆抗体包被96孔细胞培养板过夜，加入转染细胞的培养上清，以捕获分泌表达的重组小鼠IL-12，每孔加入1×104个Balb/c小鼠脾细胞的悬液，培养48 h，收集上清，以酶联免疫吸附法(ELISA)测定其中的干扰素γ(IFN γ)的诱导水平。同时以标准生物学活性的小鼠IL-12作为阳性对照，并制备标准曲线。d92o, http://www.100md.com
1.6 融合蛋白型IL-12对小鼠脾细胞增殖的刺激作用 以无菌技术制备Balb/c小鼠脾细胞悬液，调整细胞密度达1×106/ml。加入转染的SVT2细胞的培养上清作为融合型IL-12的来源，并以倍比稀释的已知浓度的IL-12作为对照，培养48h，加入3H-胸腺嘧啶核苷(lμCi/孔)，18h后收集细胞，beta计数器测定其CPM值。d92o, http://www.100md.com
2 结果d92o, http://www.100md.com
2.1 小鼠IL-12融合蛋白基因表达载体的构建 通过重叠序列引物的设计与3轮多聚酶链反应的扩增，获得预期为1.6kb的DNA片段，克隆到pCR2.1载体中后，经序列测定证实，与文献[1]所报道的小鼠IL-12的基因序列完全一致,而且人工设计的甘氨酸接头序列也正确无误。d92o, http://www.100md.com
2.2 小鼠IL-12融合蛋白基因转染细胞系的建立 以pCDIL-12(40-35)真核重组表达载体转染小鼠成纤维细胞系SVT2，并以新霉素类似物G418筛选，获得数十个抗性细胞克隆。仅选择其中部分细胞克隆，测定其上清中融合型IL-12的生物学活性。d92o, http://www.100md.com
2.3 小鼠融合型IL-12生物学活性的测定 根据小鼠IL-12能够诱导小鼠脾细胞分泌干扰素γ的作用特点，以其诱导IFN γ产生能力为标准，测定其生物学活性。同时，用已知浓度的小鼠IL-12作为阳性对照，检测结果用于制作标准曲线，并计算每106个细胞24h分泌到细胞培养上清中融合蛋白型IL-12的数量。其中4个典型细胞克隆分泌融合蛋白的水平如表1所示。d92o, http://www.100md.com
表1 4个稳定转化细胞克隆上清中IL-12的表达活性d92o, http://www.100md.com
Tab1 IL-12 expressive activities in supernatants of 4 stable transfectants
NO%+, 百拇医药
IL-12 activities(pg/ml)%+, 百拇医药
5%+, 百拇医药
83.8%+, 百拇医药
6%+, 百拇医药
112.6%+, 百拇医药
8%+, 百拇医药
96.3%+, 百拇医药
9%+, 百拇医药
52.1%+, 百拇医药
2.4 小鼠融合型IL-12促进小鼠脾细胞的增殖作用 小鼠IL-12生物学活性作用的靶细胞主要是T细胞和NK细胞，因而以3H-胸腺嘧啶核苷掺入法，对分泌表达的融合蛋白型小鼠IL-12对小鼠脾细胞增殖的促进作用进行检测。其结果如表2所示。表2 稳定转化细胞表达IL-12及对小鼠脾细胞增殖反应的促进作用%+, 百拇医药
Tab2 Promotion of expressed IL-12 on the proliferation of murine splenocytes IL-12 standard%+, 百拇医药
(pg/ml)%+, 百拇医药
CPM%+, 百拇医药
Clone No%+, 百拇医药
CPM%+, 百拇医药
3 000%+, 百拇医药
15 201 444%+, 百拇医药
SVT2%+, 百拇医药
399 372%+, 百拇医药
1 000%+, 百拇医药
12 401 165%+, 百拇医药
2%+, 百拇医药
366 350
333.3h^*.5]x, 百拇医药
1 010 914h^*.5]x, 百拇医药
3h^*.5]x, 百拇医药
647h^*.5]x, 百拇医药
111.1h^*.5]x, 百拇医药
732 691h^*.5]x, 百拇医药
4h^*.5]x, 百拇医药
431 417h^*.5]x, 百拇医药
37.0h^*.5]x, 百拇医药
673 616h^*.5]x, 百拇医药
5h^*.5]x, 百拇医药
545 507h^*.5]x, 百拇医药
12.3h^*.5]x, 百拇医药
553 564h^*.5]x, 百拇医药
6h^*.5]x, 百拇医药
696 692h^*.5]x, 百拇医药
4.1h^*.5]x, 百拇医药
497 465h^*.5]x, 百拇医药
7h^*.5]x, 百拇医药
544 549h^*.5]x, 百拇医药
1.4h^*.5]x, 百拇医药
491 436h^*.5]x, 百拇医药
8h^*.5]x, 百拇医药
695 676h^*.5]x, 百拇医药
Medium 1h^*.5]x, 百拇医药
1 729h^*.5]x, 百拇医药
9h^*.5]x, 百拇医药
653 586h^*.5]x, 百拇医药
Medium 2h^*.5]x, 百拇医药
2 346
pcDNA3.1(+)[;%hr, 百拇医药
384 326[;%hr, 百拇医药
3 讨论[;%hr, 百拇医药
小鼠IL-12由40kDa和35kDa的两个亚单位构成异二聚体蛋白质分子。这两种亚单位分别由两个不同的基因编码，这是IL-12分子生物学的一个显著的特点。为了实现具有生物学活性的IL-12的表达，采用了一系列不同的表达策略。如将两种基因分别克隆到两个不同的表达载体中，进行共转染，或先后顺序转染，得到两种多肽的同时表达，然后组装成二聚体形式。将两种基因分别重组到同一载体的两个不同的启动子下游，也可以实现IL-12活性蛋白的表达。但要使这两种基因在同一个启动子的指导下进行表达，两种基因之间必须插入一段所谓的内部核糖体进入位点(IRES)序列。位于上游的基因通过帽状结构形成机制进行翻译，位于下游的基因则通过IRES依赖性的机制进行翻译，以实现两种不同蛋白的同步表达。如果以腺病毒表达载体表达IL-12，则可以用IL-12的两种基因分别替换腺病毒基因组中的E1和E3基因区，一方面实现了同时表达两种基因的需要，又去除了腺病毒基因组中的致病基因部分，保证了腺病毒载体的安全性。但采取上述表达策略，难以保证两种基因的表达效率相同，在一定程度上影响了具有生物学活性的IL-12二聚体的形成。更为严重的是，如果40kDa亚单位表达相对过量，单体或二聚体形式的40kDa亚单位可以竞争性与异二聚体型IL-12特异性受体结合，反而阻断了天然的IL-12的生物学活性的发挥。如果采用融合蛋白的表达策略，则可以避免上述不利情况的发生[4]。国内也构建了双亚基共表达人IL-12的重组腺病毒表达载体，获得了具有生物学活性的人IL-12的表达，为IL-12的基因治疗研究，打下了坚实的基础[5]。[;%hr, 百拇医药
IL-12的生物学活性是多方面的，主要是通过激活T和NK细胞，同时对于IFN γ及主要组织相容性抗原复合体(MHC)的表达具有显著的诱导作用，因而在抗肿瘤[6]、抗病毒[7，8]以及作为DNA疫苗免疫共刺激信号[9]等领域都有广泛的应用前景。本文利用了IL-12诱生IFN γ的作用测定其生物学活性。转染上清中融合型IL-12诱生IFN γ的能力，相当于52.1～112.6 pg/ml重组的IL-12的生物学活性。融合型IL-12对小鼠脾细胞增殖促进实验的研究结果表明，以SVT2的培养上清或以空白对照pcDNA3.1(+)转染的SVT2细胞培养上清都能取得较培养基对照组本身更强的脾细胞增殖促进作用。不排除SVT2本身有分泌表达IL-12的能力，或能够产生其它类型的促进脾细胞增殖的可溶性因子[10]。比较转染细胞培养上清中融合型IL-12诱生IFN γ的能力与脾细胞增殖的促进作用，发现两种实验结果完全一致。对于融合型IL-12的IFN γ诱生能力测定中，对于转染细胞培养上清中融合型IL-12先以IL-12的单克隆抗体进行捕获，排除了其它可能的IFN γ诱生因素，因而保证了IL-12生物学活性测定的特异性。
在这一融合蛋白表达载体的构建中，引入了甘氨酸接头序列，主要是考虑到了异二聚体空间结构的形成的需要。这一接头序列的引入，其潜在的不利因素是产生新的抗原表位，引发机体产生针对融合蛋白的免疫应答。但在单链抗体表达融合基因的研究中，引入了这种甘氨酸接头序列，没有观察到抗体的产生及不良反应的发生[11]。■e5f/, http://www.100md.com
作者简介：成 军(1963-)，男，山东高青县人，副主任医师，博士，主要从事与遗传病相关的基因克隆化、基因治疗与基因疫苗的研究。e5f/, http://www.100md.com
作者单位： 董菁(解放军302医院传染病研究所基因治疗研究中心，北京 100039)； 赵鸿(解放军302医院传染病研究所基因治疗研究中心，北京 100039)； 斯崇文(北京医科大学第一医院传染病科，北京 100034)； 王勤环(北京医科大学第一医院传染病科，北京 100034)e5f/, http://www.100md.com
参考文献：e5f/, http://www.100md.com
[1]SCHOENHAUT DS， CHUA AO， WOLITZKY AG， et al. Cloning and expression of murine IL-12[J]. J Immunol， 1992，148：3433～3440.e5f/, http://www.100md.com
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收稿日期：1999-04-02qtk, 百拇医药
修回日期：1999-07-27(成军 赵鸿 钟彦伟 刘妍 杨继珍 董菁 斯崇文 王勤环)
单位：成军(解放军302医院传染病研究所基因治疗研究中心，北京 100039)； 钟彦伟(解放军302医院传染病研究所基因治疗研究中心，北京 100039)； 刘妍(解放军302医院传染病研究所基因治疗研究中心，北京 100039)； 杨继珍(解放军302医院传染病研究所基因治疗研究中心，北京 100039)；i&vk, 百拇医药
关键词：白细胞介素-12；融合蛋白；转染；多聚酶链反应；甘氨酸接头i&vk, 百拇医药
免疫学杂志000110i&vk, 百拇医药
摘 要：目的 构建小鼠白细胞介素-12的融合基因，并进行初号表达。方法 通过重叠序列引物的设计与多聚酶链反应(PCR)技术，将小鼠IL-12的40kDa多肽链基因与35kDa多肽链基因，以甘氨酸接头(Gly4Ser)3序列连接成为融合蛋白编码基因，构建融合蛋白表达载体，转染小鼠成纤维细胞SVT2，表达具有生物学活性的融合蛋白型IL-12。结果 构建的小鼠IL-12表达载体经测序无突变发生。以G418筛选转染的SVT2细胞，获得数十个抗性细胞克隆，测定其IL-12生物学活性，分泌量达52.1～112.6pg/ml。表达的融合型小鼠IL-12具有生物学活性。结论 构建并表达了单链型小鼠白细胞介素-12。i&vk, 百拇医药
中图分类号：R392.11 文献标识码：Ai&vk, 百拇医药
Construction of murine interleukin-12 fusion protein coding gene and its expression in murine fibroblast cellsi&vk, 百拇医药
CHENG Jun ZHONG Yan-wei LIU Yan YANG Ji-zhen DONG Qing(Gene Therapy Research Center， Institute of Infectious Diseases， the 302 Hospital of PLA， Beijing 100039， China)i&vk, 百拇医药
ZHAO Hong SI Chong-wen WANG Qin-huani&vk, 百拇医药
(Department of Infectious Diseases， the First School of Clinical Medicine， Beijing Medical University， Beijing 100034，China)
Abstract：Objective To construct murine interleukin-12(IL-12) fusion protein coding sequence and express it in murine fibroblast cell line SVT2.Methods IL-12 fusion protein gene was constructed by overlaping primer design and polymerase chain reaction(PCR) amplification. The recombinant sequence was insert into pCR 2.1 and transfected into murine fibroblast cells with lipofectin method. G418 resistant cell clones were selected and IL-12 activity in culture medium was evaluated by measuring interferon γ(IFN γ) secretion of murine splenocyte stimulated by conditioned medium IL-12 secretion level was also detected.Results The capability of culture medium stimulating splenocyte proliferation was demonstrated. The concentration of IL-12 in culture supernatant ranged from 52.1 to 112.6 pg/ml.Conclusion According to the results， we conclude that recombinant vector could express bioactive IL-12 from transfected murine fibroblast cells.sd}t, 百拇医药
Key words：interleukin-12； fusion protein； transfection； polymerase chain reaction； glycine linker▲sd}t, 百拇医药
白细胞介素-12(IL-12)又称为自然杀伤细胞刺激因子(NKSF)，是一种由35kDa和40kDa两条多肽链借助二硫键的形成构成的异二聚体型细胞因子，主要作用于T细胞与NK细胞[1～3]。IL-12这两条多肽链是由两条不同的基因编码的，其表达调控的性质也不相同，由于IL-12是由2个不同的基因编码的，因而无论是以基因工程技术表达重组的IL-12，还是作为目的基因进行基因治疗，还是以其表达质粒DNA作为DNA疫苗的免疫共刺激信号，都涉及到了能同时表达两个基因的表达载体的构建。目前常用的绝大多数表达载体只能表达单一的外源基因，而且更为严重的是40kDa多肽过量表达形成的单体及同二聚体可与IL-12异二聚体竞争性结合特异性的受体，因而具有对天然的IL-12分子生物学活性的抑制作用，为IL-12的表达研究带来了很大困难。为此，本文以多聚酶链反应技术，将2个编码基因通过接头序列连接在一起，构建了融合蛋白的表达载体，并证明这种表达的融合蛋白具有天然IL-12的生物学活性。
1 材料与方法|7, 百拇医药
1.1 小鼠IL-12融合蛋白编码基因的构建 小鼠IL-12的35KDa和40kDa两条多肽链的cDNA片段克隆在pBluescript载体中，作为构建融合蛋白基因多聚酶链反应的模板。以引物1(5’-CTCGGAATTCATGTGTCCTCAGAAGCTAACCATC-3＇)和引物2(5＇-CCCGACCCACCACCGCCCGAGCCACC|7, 百拇医药
GCCACCGGATCGGACC CTGCAGG-3’＇)扩增40kDa多肽链基因片段；以引物3(5’-CGGGCGGTGGT|7, 百拇医药
GGGTCGGGTGGGGGCGGATCTAGGGTCATTCCAGTCTCTG-3＇)和引物4(5’-CTCGGGATCCTCAGGCGGA|7, 百拇医药
GCTCAGATAG-3’)扩增35kDa多肽链基因片段。以上述2种PCR产物混合作为模板，以引物1和4进行第三次PCR扩增，即获得上游为40kDa、下游为35kDa，中间为甘氨酸接头(Gly4Ser)3的融合蛋白的编码基因，克隆到pCR2.1(Invitrogen公司)中，命名为pCRIL-12(40-35)。|7, 百拇医药
1.2 融合蛋白编码基因的序列测定 参照文献[4]的方法对pCRIL-12(40-35)的核苷酸序列进行测定。|7, 百拇医药
1.3 小鼠IL-12融合蛋白真核表达载体的构建 以HindⅢ和XhoⅠ两种限制性内切酶分别消化pCRIL-12(40-35)和真核表达载体pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司)，收获从前者切割的1.6kb的融合型IL-12编码基因片段，定向克隆到pcDNA3.1(+)相应酶切位点上，为pCDIL-12(40-35)。|7, 百拇医药
1.4 小鼠成纤维细胞的体外转染 于转染实验的前1d，小鼠成纤维细胞SVT2以胰酶和EDTA溶液消化，使其密度达1×105/ml。转染前2h更换以完全新鲜培养基。转染时，先以不含胎牛血清的培养基冲洗细胞3次。以8μg的pcDNA3.1(+)或pCDIL-12(40-35)脂质体质粒DNA分别与80μl的脂质体在聚苯乙烯管中轻轻振荡混匀，室温下培育20min，以不含胎牛血清的培养基稀释脂质体-DNA混合物，转移到SVT2细胞的表面，转染11h，换以含有500μg/ml G418的选择性培养基。每3～4d更换选择培养基，直至肉眼可见的细胞集落出现。先以直型弯头吸管，以胰酶消化，将细胞集落先转移到24孔板中培养，长满后再转至细胞培养瓶中，收获上清测定IL-12的生物学活性。
1.5 IL-12生物学活性的测定 小鼠IL-12的生物学活性以文献[1]方法测定。以抗-IL-12的单克隆抗体包被96孔细胞培养板过夜，加入转染细胞的培养上清，以捕获分泌表达的重组小鼠IL-12，每孔加入1×104个Balb/c小鼠脾细胞的悬液，培养48 h，收集上清，以酶联免疫吸附法(ELISA)测定其中的干扰素γ(IFN γ)的诱导水平。同时以标准生物学活性的小鼠IL-12作为阳性对照，并制备标准曲线。d92o, http://www.100md.com
1.6 融合蛋白型IL-12对小鼠脾细胞增殖的刺激作用 以无菌技术制备Balb/c小鼠脾细胞悬液，调整细胞密度达1×106/ml。加入转染的SVT2细胞的培养上清作为融合型IL-12的来源，并以倍比稀释的已知浓度的IL-12作为对照，培养48h，加入3H-胸腺嘧啶核苷(lμCi/孔)，18h后收集细胞，beta计数器测定其CPM值。d92o, http://www.100md.com
2 结果d92o, http://www.100md.com
2.1 小鼠IL-12融合蛋白基因表达载体的构建 通过重叠序列引物的设计与3轮多聚酶链反应的扩增，获得预期为1.6kb的DNA片段，克隆到pCR2.1载体中后，经序列测定证实，与文献[1]所报道的小鼠IL-12的基因序列完全一致,而且人工设计的甘氨酸接头序列也正确无误。d92o, http://www.100md.com
2.2 小鼠IL-12融合蛋白基因转染细胞系的建立 以pCDIL-12(40-35)真核重组表达载体转染小鼠成纤维细胞系SVT2，并以新霉素类似物G418筛选，获得数十个抗性细胞克隆。仅选择其中部分细胞克隆，测定其上清中融合型IL-12的生物学活性。d92o, http://www.100md.com
2.3 小鼠融合型IL-12生物学活性的测定 根据小鼠IL-12能够诱导小鼠脾细胞分泌干扰素γ的作用特点，以其诱导IFN γ产生能力为标准，测定其生物学活性。同时，用已知浓度的小鼠IL-12作为阳性对照，检测结果用于制作标准曲线，并计算每106个细胞24h分泌到细胞培养上清中融合蛋白型IL-12的数量。其中4个典型细胞克隆分泌融合蛋白的水平如表1所示。d92o, http://www.100md.com
表1 4个稳定转化细胞克隆上清中IL-12的表达活性d92o, http://www.100md.com
Tab1 IL-12 expressive activities in supernatants of 4 stable transfectants
NO%+, 百拇医药
IL-12 activities(pg/ml)%+, 百拇医药
5%+, 百拇医药
83.8%+, 百拇医药
6%+, 百拇医药
112.6%+, 百拇医药
8%+, 百拇医药
96.3%+, 百拇医药
9%+, 百拇医药
52.1%+, 百拇医药
2.4 小鼠融合型IL-12促进小鼠脾细胞的增殖作用 小鼠IL-12生物学活性作用的靶细胞主要是T细胞和NK细胞，因而以3H-胸腺嘧啶核苷掺入法，对分泌表达的融合蛋白型小鼠IL-12对小鼠脾细胞增殖的促进作用进行检测。其结果如表2所示。表2 稳定转化细胞表达IL-12及对小鼠脾细胞增殖反应的促进作用%+, 百拇医药
Tab2 Promotion of expressed IL-12 on the proliferation of murine splenocytes IL-12 standard%+, 百拇医药
(pg/ml)%+, 百拇医药
CPM%+, 百拇医药
Clone No%+, 百拇医药
CPM%+, 百拇医药
3 000%+, 百拇医药
15 201 444%+, 百拇医药
SVT2%+, 百拇医药
399 372%+, 百拇医药
1 000%+, 百拇医药
12 401 165%+, 百拇医药
2%+, 百拇医药
366 350
333.3h^*.5]x, 百拇医药
1 010 914h^*.5]x, 百拇医药
3h^*.5]x, 百拇医药
647h^*.5]x, 百拇医药
111.1h^*.5]x, 百拇医药
732 691h^*.5]x, 百拇医药
4h^*.5]x, 百拇医药
431 417h^*.5]x, 百拇医药
37.0h^*.5]x, 百拇医药
673 616h^*.5]x, 百拇医药
5h^*.5]x, 百拇医药
545 507h^*.5]x, 百拇医药
12.3h^*.5]x, 百拇医药
553 564h^*.5]x, 百拇医药
6h^*.5]x, 百拇医药
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4.1h^*.5]x, 百拇医药
497 465h^*.5]x, 百拇医药
7h^*.5]x, 百拇医药
544 549h^*.5]x, 百拇医药
1.4h^*.5]x, 百拇医药
491 436h^*.5]x, 百拇医药
8h^*.5]x, 百拇医药
695 676h^*.5]x, 百拇医药
Medium 1h^*.5]x, 百拇医药
1 729h^*.5]x, 百拇医药
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653 586h^*.5]x, 百拇医药
Medium 2h^*.5]x, 百拇医药
2 346
pcDNA3.1(+)[;%hr, 百拇医药
384 326[;%hr, 百拇医药
3 讨论[;%hr, 百拇医药
小鼠IL-12由40kDa和35kDa的两个亚单位构成异二聚体蛋白质分子。这两种亚单位分别由两个不同的基因编码，这是IL-12分子生物学的一个显著的特点。为了实现具有生物学活性的IL-12的表达，采用了一系列不同的表达策略。如将两种基因分别克隆到两个不同的表达载体中，进行共转染，或先后顺序转染，得到两种多肽的同时表达，然后组装成二聚体形式。将两种基因分别重组到同一载体的两个不同的启动子下游，也可以实现IL-12活性蛋白的表达。但要使这两种基因在同一个启动子的指导下进行表达，两种基因之间必须插入一段所谓的内部核糖体进入位点(IRES)序列。位于上游的基因通过帽状结构形成机制进行翻译，位于下游的基因则通过IRES依赖性的机制进行翻译，以实现两种不同蛋白的同步表达。如果以腺病毒表达载体表达IL-12，则可以用IL-12的两种基因分别替换腺病毒基因组中的E1和E3基因区，一方面实现了同时表达两种基因的需要，又去除了腺病毒基因组中的致病基因部分，保证了腺病毒载体的安全性。但采取上述表达策略，难以保证两种基因的表达效率相同，在一定程度上影响了具有生物学活性的IL-12二聚体的形成。更为严重的是，如果40kDa亚单位表达相对过量，单体或二聚体形式的40kDa亚单位可以竞争性与异二聚体型IL-12特异性受体结合，反而阻断了天然的IL-12的生物学活性的发挥。如果采用融合蛋白的表达策略，则可以避免上述不利情况的发生[4]。国内也构建了双亚基共表达人IL-12的重组腺病毒表达载体，获得了具有生物学活性的人IL-12的表达，为IL-12的基因治疗研究，打下了坚实的基础[5]。[;%hr, 百拇医药
IL-12的生物学活性是多方面的，主要是通过激活T和NK细胞，同时对于IFN γ及主要组织相容性抗原复合体(MHC)的表达具有显著的诱导作用，因而在抗肿瘤[6]、抗病毒[7，8]以及作为DNA疫苗免疫共刺激信号[9]等领域都有广泛的应用前景。本文利用了IL-12诱生IFN γ的作用测定其生物学活性。转染上清中融合型IL-12诱生IFN γ的能力，相当于52.1～112.6 pg/ml重组的IL-12的生物学活性。融合型IL-12对小鼠脾细胞增殖促进实验的研究结果表明，以SVT2的培养上清或以空白对照pcDNA3.1(+)转染的SVT2细胞培养上清都能取得较培养基对照组本身更强的脾细胞增殖促进作用。不排除SVT2本身有分泌表达IL-12的能力，或能够产生其它类型的促进脾细胞增殖的可溶性因子[10]。比较转染细胞培养上清中融合型IL-12诱生IFN γ的能力与脾细胞增殖的促进作用，发现两种实验结果完全一致。对于融合型IL-12的IFN γ诱生能力测定中，对于转染细胞培养上清中融合型IL-12先以IL-12的单克隆抗体进行捕获，排除了其它可能的IFN γ诱生因素，因而保证了IL-12生物学活性测定的特异性。
在这一融合蛋白表达载体的构建中，引入了甘氨酸接头序列，主要是考虑到了异二聚体空间结构的形成的需要。这一接头序列的引入，其潜在的不利因素是产生新的抗原表位，引发机体产生针对融合蛋白的免疫应答。但在单链抗体表达融合基因的研究中，引入了这种甘氨酸接头序列，没有观察到抗体的产生及不良反应的发生[11]。■e5f/, http://www.100md.com
作者简介：成 军(1963-)，男，山东高青县人，副主任医师，博士，主要从事与遗传病相关的基因克隆化、基因治疗与基因疫苗的研究。e5f/, http://www.100md.com
作者单位： 董菁(解放军302医院传染病研究所基因治疗研究中心，北京 100039)； 赵鸿(解放军302医院传染病研究所基因治疗研究中心，北京 100039)； 斯崇文(北京医科大学第一医院传染病科，北京 100034)； 王勤环(北京医科大学第一医院传染病科，北京 100034)e5f/, http://www.100md.com
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收稿日期：1999-04-02qtk, 百拇医药
修回日期：1999-07-27(成军 赵鸿 钟彦伟 刘妍 杨继珍 董菁 斯崇文 王勤环)