牛IgG Fc受体Ⅲ的分子克隆和序列分析
作者：闫玉河 张改平 李学伍 李青梅czp, http://www.100md.com
单位：闫玉河(河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南 郑州 450002)； 张改平(河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南 郑州 450002)； 李学伍(河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南 郑州 450002)； 李青梅(河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南 郑州 450002)czp, http://www.100md.com
关键词：牛FcγRⅢ(CD16)；分子克隆；序列分析czp, http://www.100md.com
免疫学杂志000106 摘 要：目的 研究牛IgG Fc受体的结 构与功能的关系。方法在构建了牛肺巨噬细胞cDNA文库的基础上，用PCR方法获得了编码牛IgG Fc受体Ⅲ(boFcγRⅢ)的全长编码基因。结果 通过分子克隆和序列分析，发现其 编码基因为507bp，共编码168个氨基酸，其中含有信号肽序列、穿膜区和胞内结构 域以及3个N-连接糖基化位点。与COLLINS等克隆的boFcγRⅢ相比，在它的 胞外区中缺失了82个氨基酸，仅有一个胞外结构域。结论 我们所克隆的cDNA片段属于编码牛的FcγRⅢA(CD16-Ⅱ)一种特殊的 基因结构形式。czp, http://www.100md.com
中图分类号：S852.4；Q78 文献标识码：Aczp, http://www.100md.com
Molecular cloning and sequence analysis of bovine IgG Fc receptor typeczp, http://www.100md.com
YAN Yu-he，ZHANG Gai-ping，LI Xue- wu，LI Qing-meiczp, http://www.100md.com
(Institute of Animal and Veterin ary Sciences，Henan Academy of Agricultur al Sciences，Zhengzhou 450002，China)czp, http://www.100md.com
Abstract：Objective In order to investigate the structural and functional relation of bovine IgG Fc rec eptor.Methods The full lengt h of gene encoding Fc receptor type Ⅲ fo r bovine IgG(boFcγRⅢ，CD16)) was obtained with PCR from the cDNA library of bov ine alveolar macrophage.Results It is shown through molecular c loning and sequen-cing that the coding gene has 507 bp and codes for 168 amino acids. There are gene sequence coding signal pe ptide，transmembrane and intracellular re gions.It als o has 3 potential N-linked glycosylation site s.Compared with the boFcγRⅢ cDNA cloned by COLLINS et al，the sequence deletes 82 amino acids and has only one extracellu lar domain.Conclusion It is suggested that this cDN A fragment may be a special form of the gene structure of bovine FcγRⅢA(CD16-Ⅱ).
Key words：bovine FcγRⅢ ( CD16)；molecular cloning；sequence analysis▲mm6:n, 百拇医药
免疫球蛋白G(IgG)Fc段的特异性受体(FcγR)属于Ig基因的超家族成员。人和哺乳动物的IgG Fc受体主要包括3种类型，即FcγRI、FcγRⅡ和FcγR Ⅲ，它们又分别被称为CD64、CD32和CD16。虽然这些受体与各自的配体(Ig G亚类)的亲和力不同，但在体内所发挥的功能相似，如参与机体对异物的识别和清除、抗 体依赖性细胞毒作用(ADCC)、抗原的处理和提呈、免疫球蛋白的分泌、细胞因子的产 生以及免疫应答的调控和信号转导等[1～3]。因此，它们在诱发机体的细胞免疫 和体液免疫方面起着十分重要的作用。研究这些受体的结构，对于进一步了解它们各自在体 内所发挥的作用以及结构与功能的关系，具有重要意义。mm6:n, 百拇医药
目前有关人和小鼠IgG Fc受体的研究较为深入，不但对编码这3类受体的基因进行了 克隆和测序，而且还在染色体中进行了定位，对其功能的研究也在进行之中[4～7] 。由于反刍类动物所具有的不同于其它哺乳类的组织解剖学特点，因此在表现对病原体 的抵抗力(免疫力)方面也有其自身的特点，而动物的IgG Fc受体与其抗病能力有直 接相关性。为此，我们以牛作为反刍类的代表，对牛FcγRⅢ(boFcγRⅢ)的结构 基因进行了克隆和序列分析。mm6:n, 百拇医药
1 材料与方法mm6:n, 百拇医药
1.1 材料mm6:n, 百拇医药
1.1.1 牛肺巨噬细胞：采自于健康屠宰牛的肺脏。mm6:n, 百拇医药
1.1.2 菌株和质粒：大肠杆菌MC1061/P3和质粒pCDM8来源于 Invitrogen公司，大肠杆菌DH5α由本室保存；质粒pUC19购自华美生物 工程公司。mm6:n, 百拇医药
1.2 方法mm6:n, 百拇医药
1.2.1 总RNA提取和mRNA的分离：按照文献[8]的方法，先用Cs Cl作垫层的梯度离心法提取牛肺巨噬细胞的总RNA，再用Oligo(dT)纤维柱分离mRNA[9]。mm6:n, 百拇医药
1.2.2 cDNA文库的构建：用随机引物将提取的mRNA反转录为 cDNA，加T4聚合酶补平，再将含有BstXI酶切位点的接头连接到cDNA的两 端；同时用BstXI酶切质粒pCDM8，回收大片段，然后用修饰过的cDNA与pC DM8大片段连接，转化大肠杆菌MC1061/P3，构成cDNA文库。
1.2.3 PCR引物的设计及合成：参照COllINS等[10] 发表的从牛 肠系膜淋巴结的单核细胞中获得的FcγRⅢ的基因序列(注册号X99695)，用Ol igo引物分析软件设计1对引物，上游引物为5’-CACTCTAACACACA GCATGT，下游引物是5’-TGGGTGAAGGATCCTCAGAT，后者 含有BamHI酶切位点。}i1, http://www.100md.com
1.2.4 PCR扩增条件及其产物的鉴定：取cDNA文库4μl，加dNTP至终浓 度为200μmol，MgCl2为1.5mmol，上下游引物各0.2μmol，T aq酶1.5U(华美生物工程公司)，总体积50μl。反应条件为94°C变性1mi n，54°C退火1min，72°C延伸2min，共进行30个循环，然后进行琼脂糖 凝胶电泳和酶切鉴定。}i1, http://www.100md.com
1.2.5 PCR产物的克隆和序列分析：先用Wizard PCR产物纯化试剂盒( Promega，美国)，按说明书要求对PCR产物进行纯化，再将PCR产物用Kle now酶(Promega，美国)补平；用BamHI酶切后，与pUC19-SmaI -BamHI连接，构成pUR3，按文献[6]的方法转化大肠杆菌DH5α，筛选重组子。将酶切鉴定过的重组子用Qiagen试剂盒(GmbH，德国)提取并纯化后，再用 373A自动序列测定系统(ABI，美国)进行荧光素标记测序。}i1, http://www.100md.com
2 结果}i1, http://www.100md.com
2.1 PCR扩增结果 根据COLLINS等[10]已发 表的从牛肠系膜淋巴结单核细胞中调取的FcγRⅢ的基因序列，本试验所设计的PC R引物 应该扩增到840bp左右的cDNA条带。但我们从牛肺巨噬细胞cDNA文库中仅扩增 到约600bp的特异性产物，无论增加或减少退火温度(从50°C到60°C)均出现 单一的600bp的cDNA条带，而从空质粒pCDM8中未能扩增到，说明该产物为特 异性产物。另外，在CDLLINS等报道的cDNA序列中，于第412位有1个Eco RI的酶切位点。当选用EcoRI酶切PCR产物时，却未能切开，表明在我们所获得的 的cDNA序列中，该位点已发生改变或已缺失。图1为PCR产物及重组质粒pUR3的鉴定。
}i1, http://www.100md.com
图1 重组质粒的酶切鉴定
Fig1 Identification of recombinants pUR3 and pSR3kdy, 百拇医药
The PCR product obtained from the cDNA library of bovine macrophages is sho wn in lane 1.The digested pUR3 and pSR3 with EcoRI and HindⅢ are respectively mi grated in lane 2 and lane 3.The marker φ x174 DNA-HaeⅢ is in lane 4.kdy, 百拇医药
2.2 序列分析结果 从序列分析结果可以发现，本试验所调取的基 因为590bp，其中阅读框架(ORF)仅为507bp，共编码168个氨基酸(终止 密码TAG除外，见图2)。经与Collins等克隆的boFcγRⅢ基因序列(简称 boFcγRⅢ-C)比较，在其编码基因的5’端和3’端序列中除有个别碱基变异外，绝 大部分的碱基是相同的，但在相当于boFcγRⅢ-C序列中的241位到486之间共 有246个碱基被缺失，即我们所克隆的boFcγRⅢ(简称boFcγRⅢ-Y)比b oFcγRⅢ-C缺失了82个氨基酸，见图3。
kdy, 百拇医药
图2 牛boFcγRⅢ-Y的cDNA序列及所推导的氨基酸序列kdy, 百拇医药
Fig.2 The nucleotiden sequence of boFcγRⅢ-Y and predicted amino acid sequencekdy, 百拇医药
The signal peptide sequence was underlined. The cysteine residues were double-underlined and the transmembrane region was underlined with wave line. The asparagine residues in parentheses indicated the potential N-linked gloycosylation sites. The stop codon was marked with asterisk.
图3 牛boFcγRⅢ-C和boFcγRⅢ-Y的氨基酸序列比较5d8mq, 百拇医药
Fig.3 A comparison of deduced amino acid sequences between boFcγRⅢ-C and boFcγRⅢ-Y5d8mq, 百拇医药
Dashes indicate the deleted amino acids in boFcγRⅢ-Y. The signal pepeide sequences were inderlined. The transmembrane regions were underlined with wave lines and the cystenie tesidues in entrancelluar domains were shadowed. Dots under the residues denote the different amino acids between two swquences.5d8mq, 百拇医药
3 讨论5d8mq, 百拇医药
研究表明[11～12]，人和哺乳动物的FcγRⅢ是一类对IgG复合物具有低 亲和力的受体，它主要有自然杀伤性细胞(NK细胞)、粒细胞、T淋巴细胞和组织中的巨 噬细胞表达。根据它本身的结构特点及其与细胞膜的结合形式不同，又将其分为两种类型。 在粒细胞上呈糖基磷脂酰基醇(GPI)形式锚定在细胞膜上的称为FcγRⅢB(又称CD16-Ⅰ)；而在NK细胞和巨噬细胞膜上表达的并具 有穿膜结构的称为FcγRⅢA(又称CD16-Ⅱ)。由于两者在结构上及与细胞膜的结 合形式上有所不同，因此在功能上亦有差异。如CD16-Ⅱ可以触发淋巴因子的分泌、C TL作用和IL-2受体的表达，而CD16-Ⅰ则不具有这一功能[12]。CO LLINS等[10]从牛肠系膜淋巴结的单核细胞中获得的boFcγRⅢ-C， 经与人以及小鼠的FcγRⅢ序列比较，其氨基酸序列同源性分别为61%和45%，还含 有相似的信号肽序列和穿膜区，应当属于牛的CD16-Ⅱ。我们所克隆的boFcγRⅢ -Y也包括有与boFcγRⅢ-C相同的信号肽、穿膜区和胞内结构，但令人惊讶的是b oFcγRⅢ-Y在其胞外域缺失了82个氨基酸，而在缺失之后的序列中，其阅读框架并 未移位，最后的终止密码子也相同，均为TAG。由于在缺失的相当于boFcγRⅢ-C 的氨基酸序列中，含有两个间隔38个氨基酸的半胱氨酸，因而，boFc γRⅢ-Y就缺失掉一个环状胞外结构域，仅剩一个胞外域。以前的序列分析表明[13，14]，人、牛和小鼠的CD16-Ⅱ的 半胱氨酸残基(C)都是相当保守的，均有4个C，即两个胞外结构域。我们知道，受体的 胞外域即Ig样结构域决定其本身与配体的亲和力，boFcγRⅢ-Y这种既不同于C D16-Ⅰ，胞外域中又比CD16-Ⅱ缺少82个氨基酸的奇特的结构特点，使我们很容 易联想到牛的FcγRⅢ很可能还有不同于一般哺乳动物的基因结构形式，它不仅具有与 CD16-Ⅱ相同的信号肽序列、穿膜区和胞内结构，还有相同的3个N-连接糖基化位点 。因此也很可能属于CD16-Ⅱ的一种特殊形式。
RAVETCH等[14]的研究发现，人CD16-Ⅰ和CD16-Ⅱ基因结 构的主要区别在于序列中6个氨基酸的不同，其中有5个位于胞外域，即36、66、82 、147和158位的氨基酸，一个接近于穿膜区(203位)。另外，在人CD16-Ⅰ 的第234位为终止密码子TGA，而CD16-Ⅱ为AGG(精氨酸)，这就决定了CD 16-Ⅱ的分子要大于CD16-Ⅰ，表现在与细胞膜的结合形式及功能上亦存在差异。b oFcγRⅢ-Y在缺失的序列中包括了第82和147位的氨基酸，其余4个氨基酸与b oFcγRⅢ-C的相同。巧合的是尽管boFcγRⅢ-Y比boFcγRⅢ-C少了8 2个氨基酸，但其3个潜在的N-连接糖基化位点(相当于boFcγRⅢ-C的第56， 63和180位)都未缺失，表明boFcγRⅢ-Y在体内的表达产物为糖蛋白。kv, 百拇医药
HIBBS等[12]的研究发现，人CD16-Ⅰ和CD16-Ⅱ的另一个主要区 别是前者可在COS-7细胞膜上完整地被表达，而后者则不能。但如果对COS-7细胞 共转染CD16-Ⅱ和IgE的Fc受体Ⅰ(FcεRI)的γ亚单位，CD16-Ⅱ即可 在COS-7细胞膜上得到表达，而穿膜区与γ亚单位的结合是这一表达过程的必要条件。 另据LANIER等[15]报道，如将CD16-Ⅱ序列中203位的苯丙氨酸( Phe)突变为丝氨酸(Ser)，可使表达产物成为含GPI的糖蛋白；相反，如将CD 16-Ⅰ序列中203位的Ser突变为Phe，则其表达产物不能形成GPI结构。由此 看出，仅有203位一个氨基酸的构成就决定了它所表达的蛋白的特性。在boFcγRⅢ -Y的序列中，相当于203位的氨基酸是Phe，按上述规则推理，其表达产物不应该含 有GPI锚结构，也不可能单独在COS-7细胞膜上得到表达。我们曾将boFcγRⅢ -Y克隆至表达载体pSV.SPORTI中，构成PSR3转染COS-7细胞 ，经用牛抗鸡红血球的 血清和抗鸡OVA血清进行鉴定，未见有功能性的受体出现，证实其不能单独在COS-7 细胞中表达。■kv, 百拇医药
基金项目：国家863计划资助项目(101-05-05-03)kv, 百拇医药
作者简介：闫玉河(1959-)，男，河南辉县人，副研究员 ，博士后，主要从事人畜共患病的分子生物学和分子免疫学的研究。kv, 百拇医药
*：本文报道的核苷酸序列已送交Genbank，其注册号为AF132036。
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收稿日期：1999-06-19;?:}%, 百拇医药
修回日期：1999-09-24(闫玉河 张改平 李学伍 李青梅)
单位：闫玉河(河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南 郑州 450002)； 张改平(河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南 郑州 450002)； 李学伍(河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南 郑州 450002)； 李青梅(河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南 郑州 450002)czp, http://www.100md.com
关键词：牛FcγRⅢ(CD16)；分子克隆；序列分析czp, http://www.100md.com
免疫学杂志000106 摘 要：目的 研究牛IgG Fc受体的结 构与功能的关系。方法在构建了牛肺巨噬细胞cDNA文库的基础上，用PCR方法获得了编码牛IgG Fc受体Ⅲ(boFcγRⅢ)的全长编码基因。结果 通过分子克隆和序列分析，发现其 编码基因为507bp，共编码168个氨基酸，其中含有信号肽序列、穿膜区和胞内结构 域以及3个N-连接糖基化位点。与COLLINS等克隆的boFcγRⅢ相比，在它的 胞外区中缺失了82个氨基酸，仅有一个胞外结构域。结论 我们所克隆的cDNA片段属于编码牛的FcγRⅢA(CD16-Ⅱ)一种特殊的 基因结构形式。czp, http://www.100md.com
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YAN Yu-he，ZHANG Gai-ping，LI Xue- wu，LI Qing-meiczp, http://www.100md.com
(Institute of Animal and Veterin ary Sciences，Henan Academy of Agricultur al Sciences，Zhengzhou 450002，China)czp, http://www.100md.com
Abstract：Objective In order to investigate the structural and functional relation of bovine IgG Fc rec eptor.Methods The full lengt h of gene encoding Fc receptor type Ⅲ fo r bovine IgG(boFcγRⅢ，CD16)) was obtained with PCR from the cDNA library of bov ine alveolar macrophage.Results It is shown through molecular c loning and sequen-cing that the coding gene has 507 bp and codes for 168 amino acids. There are gene sequence coding signal pe ptide，transmembrane and intracellular re gions.It als o has 3 potential N-linked glycosylation site s.Compared with the boFcγRⅢ cDNA cloned by COLLINS et al，the sequence deletes 82 amino acids and has only one extracellu lar domain.Conclusion It is suggested that this cDN A fragment may be a special form of the gene structure of bovine FcγRⅢA(CD16-Ⅱ).
Key words：bovine FcγRⅢ ( CD16)；molecular cloning；sequence analysis▲mm6:n, 百拇医药
免疫球蛋白G(IgG)Fc段的特异性受体(FcγR)属于Ig基因的超家族成员。人和哺乳动物的IgG Fc受体主要包括3种类型，即FcγRI、FcγRⅡ和FcγR Ⅲ，它们又分别被称为CD64、CD32和CD16。虽然这些受体与各自的配体(Ig G亚类)的亲和力不同，但在体内所发挥的功能相似，如参与机体对异物的识别和清除、抗 体依赖性细胞毒作用(ADCC)、抗原的处理和提呈、免疫球蛋白的分泌、细胞因子的产 生以及免疫应答的调控和信号转导等[1～3]。因此，它们在诱发机体的细胞免疫 和体液免疫方面起着十分重要的作用。研究这些受体的结构，对于进一步了解它们各自在体 内所发挥的作用以及结构与功能的关系，具有重要意义。mm6:n, 百拇医药
目前有关人和小鼠IgG Fc受体的研究较为深入，不但对编码这3类受体的基因进行了 克隆和测序，而且还在染色体中进行了定位，对其功能的研究也在进行之中[4～7] 。由于反刍类动物所具有的不同于其它哺乳类的组织解剖学特点，因此在表现对病原体 的抵抗力(免疫力)方面也有其自身的特点，而动物的IgG Fc受体与其抗病能力有直 接相关性。为此，我们以牛作为反刍类的代表，对牛FcγRⅢ(boFcγRⅢ)的结构 基因进行了克隆和序列分析。mm6:n, 百拇医药
1 材料与方法mm6:n, 百拇医药
1.1 材料mm6:n, 百拇医药
1.1.1 牛肺巨噬细胞：采自于健康屠宰牛的肺脏。mm6:n, 百拇医药
1.1.2 菌株和质粒：大肠杆菌MC1061/P3和质粒pCDM8来源于 Invitrogen公司，大肠杆菌DH5α由本室保存；质粒pUC19购自华美生物 工程公司。mm6:n, 百拇医药
1.2 方法mm6:n, 百拇医药
1.2.1 总RNA提取和mRNA的分离：按照文献[8]的方法，先用Cs Cl作垫层的梯度离心法提取牛肺巨噬细胞的总RNA，再用Oligo(dT)纤维柱分离mRNA[9]。mm6:n, 百拇医药
1.2.2 cDNA文库的构建：用随机引物将提取的mRNA反转录为 cDNA，加T4聚合酶补平，再将含有BstXI酶切位点的接头连接到cDNA的两 端；同时用BstXI酶切质粒pCDM8，回收大片段，然后用修饰过的cDNA与pC DM8大片段连接，转化大肠杆菌MC1061/P3，构成cDNA文库。
1.2.3 PCR引物的设计及合成：参照COllINS等[10] 发表的从牛 肠系膜淋巴结的单核细胞中获得的FcγRⅢ的基因序列(注册号X99695)，用Ol igo引物分析软件设计1对引物，上游引物为5’-CACTCTAACACACA GCATGT，下游引物是5’-TGGGTGAAGGATCCTCAGAT，后者 含有BamHI酶切位点。}i1, http://www.100md.com
1.2.4 PCR扩增条件及其产物的鉴定：取cDNA文库4μl，加dNTP至终浓 度为200μmol，MgCl2为1.5mmol，上下游引物各0.2μmol，T aq酶1.5U(华美生物工程公司)，总体积50μl。反应条件为94°C变性1mi n，54°C退火1min，72°C延伸2min，共进行30个循环，然后进行琼脂糖 凝胶电泳和酶切鉴定。}i1, http://www.100md.com
1.2.5 PCR产物的克隆和序列分析：先用Wizard PCR产物纯化试剂盒( Promega，美国)，按说明书要求对PCR产物进行纯化，再将PCR产物用Kle now酶(Promega，美国)补平；用BamHI酶切后，与pUC19-SmaI -BamHI连接，构成pUR3，按文献[6]的方法转化大肠杆菌DH5α，筛选重组子。将酶切鉴定过的重组子用Qiagen试剂盒(GmbH，德国)提取并纯化后，再用 373A自动序列测定系统(ABI，美国)进行荧光素标记测序。}i1, http://www.100md.com
2 结果}i1, http://www.100md.com
2.1 PCR扩增结果 根据COLLINS等[10]已发 表的从牛肠系膜淋巴结单核细胞中调取的FcγRⅢ的基因序列，本试验所设计的PC R引物 应该扩增到840bp左右的cDNA条带。但我们从牛肺巨噬细胞cDNA文库中仅扩增 到约600bp的特异性产物，无论增加或减少退火温度(从50°C到60°C)均出现 单一的600bp的cDNA条带，而从空质粒pCDM8中未能扩增到，说明该产物为特 异性产物。另外，在CDLLINS等报道的cDNA序列中，于第412位有1个Eco RI的酶切位点。当选用EcoRI酶切PCR产物时，却未能切开，表明在我们所获得的 的cDNA序列中，该位点已发生改变或已缺失。图1为PCR产物及重组质粒pUR3的鉴定。
}i1, http://www.100md.com图1 重组质粒的酶切鉴定
Fig1 Identification of recombinants pUR3 and pSR3kdy, 百拇医药
The PCR product obtained from the cDNA library of bovine macrophages is sho wn in lane 1.The digested pUR3 and pSR3 with EcoRI and HindⅢ are respectively mi grated in lane 2 and lane 3.The marker φ x174 DNA-HaeⅢ is in lane 4.kdy, 百拇医药
2.2 序列分析结果 从序列分析结果可以发现，本试验所调取的基 因为590bp，其中阅读框架(ORF)仅为507bp，共编码168个氨基酸(终止 密码TAG除外，见图2)。经与Collins等克隆的boFcγRⅢ基因序列(简称 boFcγRⅢ-C)比较，在其编码基因的5’端和3’端序列中除有个别碱基变异外，绝 大部分的碱基是相同的，但在相当于boFcγRⅢ-C序列中的241位到486之间共 有246个碱基被缺失，即我们所克隆的boFcγRⅢ(简称boFcγRⅢ-Y)比b oFcγRⅢ-C缺失了82个氨基酸，见图3。
kdy, 百拇医药图2 牛boFcγRⅢ-Y的cDNA序列及所推导的氨基酸序列kdy, 百拇医药
Fig.2 The nucleotiden sequence of boFcγRⅢ-Y and predicted amino acid sequencekdy, 百拇医药
The signal peptide sequence was underlined. The cysteine residues were double-underlined and the transmembrane region was underlined with wave line. The asparagine residues in parentheses indicated the potential N-linked gloycosylation sites. The stop codon was marked with asterisk.
图3 牛boFcγRⅢ-C和boFcγRⅢ-Y的氨基酸序列比较5d8mq, 百拇医药
Fig.3 A comparison of deduced amino acid sequences between boFcγRⅢ-C and boFcγRⅢ-Y5d8mq, 百拇医药
Dashes indicate the deleted amino acids in boFcγRⅢ-Y. The signal pepeide sequences were inderlined. The transmembrane regions were underlined with wave lines and the cystenie tesidues in entrancelluar domains were shadowed. Dots under the residues denote the different amino acids between two swquences.5d8mq, 百拇医药
3 讨论5d8mq, 百拇医药
研究表明[11～12]，人和哺乳动物的FcγRⅢ是一类对IgG复合物具有低 亲和力的受体，它主要有自然杀伤性细胞(NK细胞)、粒细胞、T淋巴细胞和组织中的巨 噬细胞表达。根据它本身的结构特点及其与细胞膜的结合形式不同，又将其分为两种类型。 在粒细胞上呈糖基磷脂酰基醇(GPI)形式锚定在细胞膜上的称为FcγRⅢB(又称CD16-Ⅰ)；而在NK细胞和巨噬细胞膜上表达的并具 有穿膜结构的称为FcγRⅢA(又称CD16-Ⅱ)。由于两者在结构上及与细胞膜的结 合形式上有所不同，因此在功能上亦有差异。如CD16-Ⅱ可以触发淋巴因子的分泌、C TL作用和IL-2受体的表达，而CD16-Ⅰ则不具有这一功能[12]。CO LLINS等[10]从牛肠系膜淋巴结的单核细胞中获得的boFcγRⅢ-C， 经与人以及小鼠的FcγRⅢ序列比较，其氨基酸序列同源性分别为61%和45%，还含 有相似的信号肽序列和穿膜区，应当属于牛的CD16-Ⅱ。我们所克隆的boFcγRⅢ -Y也包括有与boFcγRⅢ-C相同的信号肽、穿膜区和胞内结构，但令人惊讶的是b oFcγRⅢ-Y在其胞外域缺失了82个氨基酸，而在缺失之后的序列中，其阅读框架并 未移位，最后的终止密码子也相同，均为TAG。由于在缺失的相当于boFcγRⅢ-C 的氨基酸序列中，含有两个间隔38个氨基酸的半胱氨酸，因而，boFc γRⅢ-Y就缺失掉一个环状胞外结构域，仅剩一个胞外域。以前的序列分析表明[13，14]，人、牛和小鼠的CD16-Ⅱ的 半胱氨酸残基(C)都是相当保守的，均有4个C，即两个胞外结构域。我们知道，受体的 胞外域即Ig样结构域决定其本身与配体的亲和力，boFcγRⅢ-Y这种既不同于C D16-Ⅰ，胞外域中又比CD16-Ⅱ缺少82个氨基酸的奇特的结构特点，使我们很容 易联想到牛的FcγRⅢ很可能还有不同于一般哺乳动物的基因结构形式，它不仅具有与 CD16-Ⅱ相同的信号肽序列、穿膜区和胞内结构，还有相同的3个N-连接糖基化位点 。因此也很可能属于CD16-Ⅱ的一种特殊形式。
RAVETCH等[14]的研究发现，人CD16-Ⅰ和CD16-Ⅱ基因结 构的主要区别在于序列中6个氨基酸的不同，其中有5个位于胞外域，即36、66、82 、147和158位的氨基酸，一个接近于穿膜区(203位)。另外，在人CD16-Ⅰ 的第234位为终止密码子TGA，而CD16-Ⅱ为AGG(精氨酸)，这就决定了CD 16-Ⅱ的分子要大于CD16-Ⅰ，表现在与细胞膜的结合形式及功能上亦存在差异。b oFcγRⅢ-Y在缺失的序列中包括了第82和147位的氨基酸，其余4个氨基酸与b oFcγRⅢ-C的相同。巧合的是尽管boFcγRⅢ-Y比boFcγRⅢ-C少了8 2个氨基酸，但其3个潜在的N-连接糖基化位点(相当于boFcγRⅢ-C的第56， 63和180位)都未缺失，表明boFcγRⅢ-Y在体内的表达产物为糖蛋白。kv, 百拇医药
HIBBS等[12]的研究发现，人CD16-Ⅰ和CD16-Ⅱ的另一个主要区 别是前者可在COS-7细胞膜上完整地被表达，而后者则不能。但如果对COS-7细胞 共转染CD16-Ⅱ和IgE的Fc受体Ⅰ(FcεRI)的γ亚单位，CD16-Ⅱ即可 在COS-7细胞膜上得到表达，而穿膜区与γ亚单位的结合是这一表达过程的必要条件。 另据LANIER等[15]报道，如将CD16-Ⅱ序列中203位的苯丙氨酸( Phe)突变为丝氨酸(Ser)，可使表达产物成为含GPI的糖蛋白；相反，如将CD 16-Ⅰ序列中203位的Ser突变为Phe，则其表达产物不能形成GPI结构。由此 看出，仅有203位一个氨基酸的构成就决定了它所表达的蛋白的特性。在boFcγRⅢ -Y的序列中，相当于203位的氨基酸是Phe，按上述规则推理，其表达产物不应该含 有GPI锚结构，也不可能单独在COS-7细胞膜上得到表达。我们曾将boFcγRⅢ -Y克隆至表达载体pSV.SPORTI中，构成PSR3转染COS-7细胞 ，经用牛抗鸡红血球的 血清和抗鸡OVA血清进行鉴定，未见有功能性的受体出现，证实其不能单独在COS-7 细胞中表达。■kv, 百拇医药
基金项目：国家863计划资助项目(101-05-05-03)kv, 百拇医药
作者简介：闫玉河(1959-)，男，河南辉县人，副研究员 ，博士后，主要从事人畜共患病的分子生物学和分子免疫学的研究。kv, 百拇医药
*：本文报道的核苷酸序列已送交Genbank，其注册号为AF132036。
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收稿日期：1999-06-19;?:}%, 百拇医药
修回日期：1999-09-24(闫玉河 张改平 李学伍 李青梅)