IL-6在诱导M1白血病细胞分化后凋亡中的作用
作者：张纪岩 沈倍奋 王建安 张学敏k*wl, 百拇医药
单位：张纪岩(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850)； 沈倍奋(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850)； 王建安(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850)； 张学敏(国家生物医学分析中心，北京 100850)k*wl, 百拇医药
关键词：IL-6；M1；凋亡；Bcl-2/Baxk*wl, 百拇医药
免疫学杂志000105 摘 要：目的 探讨IL-6能否诱导M1小鼠急性髓样白血病细胞凋亡及其分子机制。方法 透射电镜观察细胞形态判断有无凋亡发生；RT-PCR及狭缝杂交分析bcl-2家族成员表达水平的改变。结果 IL-6诱导M1细胞向巨噬细胞方向分化后，M1细胞发生凋亡；bcl-2、bcl-XL在IL-6诱导下表达下调，bax表达上调。结论 IL-6诱导Bcl-2/Bax比例改变，使M1细胞分化后凋亡。k*wl, 百拇医药
中图分类号：R392.11 文献标识码：Ak*wl, 百拇医药
Apoptosis of M1 cells is induced by IL-6 after the cells undergo diffe-rentiation and its molecular mechanismk*wl, 百拇医药
ZHANG Ji-yan SHEN Bei-fen WANG Jian-ank*wl, 百拇医药
(Institute of Basic Medical Science，Academy of Military Medical Science，Beijing 100850，China)k*wl, 百拇医药
ZHANG Xue-mink*wl, 百拇医药
(National Center of Biomedical Analysis，Beijing 100850，China)k*wl, 百拇医药
Abstract：Objective To investigate whether and how IL-6 can induce apoptosis of M1 myeloid leukemic cells.Methods We determined the role of IL-6 in apoptosis of M1 cells with transmission electron micrograph.We also detected the effect of IL-6 on the expression level of bcl-2 family.Results IL-6 could induce apoptosis of M1 cells after the cells underwent terminal differentiation.The molecular mechanism might be that IL-6 downregulated expression of bcl-2 and bcl-XL，but up-regulated that of bax.Conclusion IL-6 makes the ration of Bcl-2/Bax change，which results in apoptosis of M1 cells.
Key words：IL-6；M1；apoptosis；Bcl-2/Bax▲te[u, 百拇医药
IL-6一贯被看作是凋亡抑制因子，它可抑制TGF β1、某些细胞毒化合物、野生型P53诱导的急性髓系白血病细胞凋亡[1]。在IL-6依赖株中，IL-6表现出更明确的抗凋亡效应——细胞在撤去IL-6后大量凋亡，其机制可能为JAK-STATs通路激活后诱导bcl-XL表达；高水平表达外源bcl-2基因能抑制IL-6饥饿的B9骨髓瘤细胞凋亡[2]。然而，由于IL-6生物学效应的多样性与双向性，细胞也可表现出不同甚至相反的效应。IL-3与IL-6联合预处理显著增强4-HC(4-hydroperoxycyclophosphamide)诱导的HL-60细胞凋亡，其机制可能为预处理增强了4-HC所致的HL-60细胞bcl-2、c-myc基因表达下调[3]。与此一致的是，我们在以M1细胞为模型的研究中发现：10～100ng/ml rhIL-6处理4～5d后，M1细胞表现出明确的凋亡特征。由于M1细胞中野生型P53缺如，我们检测了rhIL-6处理前后bcl-2家族成员bcl-2、bax、bcl-X的表达情况，探讨M1细胞在rhIL-6处理后走向调亡的可能机制。te[u, 百拇医药
1 材料和方法te[u, 百拇医药
1.1 材料te[u, 百拇医药
1.1.1 细胞：M1细胞由本所王嘉玺教授惠赠，培养于10%FCS-1640中，每2～4d传代1次。te[u, 百拇医药
1.1.2 试剂：rhIL-6(溶于含0.1BSA的PBS中)的比活性为107U/mg，AMV逆转录酶、Taq酶、BCIP、NBT等购自Promega公司。te[u, 百拇医药
1.1.3 探针及引物：含bcl-2、bax cDNA的质粒由本室保存。bcl-X引物[4]序列如下：te[u, 百拇医药
P5：5’-GTGAGTGGACGGTCAGTG-3’te[u, 百拇医药
P3：5’-TTGGACAATGGACTGGTTGA-3’te[u, 百拇医药
1.2 方法te[u, 百拇医药
1.2.1 rhIL-6对M1细胞增殖影响的检测：将M1细胞调成5×104/ml的密度，植入24孔板，每孔1ml，加0，1，10μg/ml rhIL-6各10μl(n＝2)，37°C孵箱培养，每日计数。
1.2.2 墨汁吞噬试验：将不同剂量rhIL-6处理0、1、2、3、4d的M1细胞用冰冷PBS洗2次后，调细胞密度为5×105/ml，每0.1ml加入滤纸滤过的优质墨汁10μl。37°C温育30min或4h，洗去游离墨粒，甩片，Wright’s染色，油镜下计数胞浆中吞有大小墨粒5个以上的阳性细胞。5p8e, 百拇医药
1.2.3 DNA抽提：100ng/ml rhIL-6处理后，于不同时间(0、1、2、3、4d)各取M1细胞约106，PBS洗2次后，移入1.5ml微量离心管中，离心去上清：加0.5ml裂解液(1g/L蛋白酶K；10mmol/L Tris-C1，pH8.0；150mmol/L NaCl；10mmol/L EDTA；0.4%SDS)重悬细胞，50°C过夜，不时振摇。加等体积酚抽提几次后，乙醇沉淀。沉淀溶于100μl TE(pH8.0)中，加RNase至终浓度0.5g/L，37°C保温30min后，1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。5p8e, 百拇医药
1.2.4 Wright’s染色及透射电镜观察细胞形态：按常规方法进行。5p8e, 百拇医药
1.2.5 RNA提取及RT-PCR：采用SDS/酚法提取细胞总RNA，OD260/OD280检测RNA完整性并定量。然后按下述方法进行RT-PCR，在0.5ml微量离心管中依次加入：2.5mmol/L dNTP 2.0μl，5×RT缓冲液2.0μl，RNasin 1U，随机引物100ng，RNA 1.0μg，AMV 2U，用DEPC水补足体积至10μl。混匀，室温10min，42°C 60min，95°C 5min，骤冷。分别取反转录产物1.0μl、3.0μl作为模板，在25μl体系中(含2.5μl 10×PCR缓冲液，2.0μl 2.5mmol/L dNTP，20μmol/L P5、P3各1.0μl，Taq酶1U)扩增GAPD和bcl-X。94°C 1min、60°C 1min、72°C 1min，共35个循环，72°C延伸7min。最后取5μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。5p8e, 百拇医药
1.2.6 探针制备及狭缝杂交：含有bcl-2、bax cDNA的质粒经PstI、BamHI双酶切鉴定正确后，回收345bp、222bp片段，按光敏生物素试剂盒说明书进行光敏生物素标记及狭缝杂交。5p8e, 百拇医药
2 结果
2.1 rhIL-6对M1细胞生长、分化的影响 rhIL-6明显抑制M1细胞增殖，使M1细胞饱和密度下降(见图1)。在生长停止的同时，M1细胞也恢复了终末分化，获得很强的墨汁吞噬能力，10～100ng/ml rhIL-6处理4d时，墨汁吞噬试验呈阳性的细胞达95%以上，且在30min内吞噬即达高峰，与4h无明显差异,表明M1向巨噬细胞方向分化(见图2)。
k^#3, 百拇医药
图1 rhIL-6对M1细胞生长的影响k^#3, 百拇医药
Fig1 Effect of rhIL-6 on the growth of M1 cellsk^#3, 百拇医药
A：normal control；B：incubation with 10ng/ml rhIL-6；C：incubation with 100ng/ml rhIL-6
k^#3, 百拇医药
图2 rhIL-6对M1细胞吞噬功能的影响k^#3, 百拇医药
Fig2 Effect of rhIL-6 on the phagocytic activity of M1 cells(Wright’s staining，×1000)k^#3, 百拇医药
A：normal control；B：incubation with 100ng/ml rhIL-6 for 4dk^#3, 百拇医药
2.2 rhIL-6诱导M1细胞分化后凋亡 M1向巨噬细胞分化后，在rhIL-6诱导下走向凋亡。100ng/ml rhIL-6处理4d后，M1细胞Wright’s染色可见类似凋亡小体的结构(见图3)。且细胞DNA呈典型的梯状ladder(见图4)。由于DNA梯状ladder不能作为区分坏死与凋亡的特征性标志，我们又取10ng/ml、100ng/ml处理4～5d的细胞做了透射电镜观察。电镜下可见10ng/ml、100ng/ml处理4～5d时，约有10% 的细胞呈现凋亡各期的典型形态特征：染色质核膜下凝聚呈帽状、块状或月牙状，胞浆固缩，内质网扩张，胞浆空泡化——胞核及细胞外形皱缩，核裂解成质膜包绕的团块，即凋亡小体，电镜下凋亡小体的存在是确认凋亡发生最可靠的依据。对照组则没有上述特征的细胞，说明凋亡确由rhIL-6诱导产生。
图3 100ng/ml rhIL-6作用前后M1细胞的形态变化], http://www.100md.com
Fig3 Morphological changes of M1 cells induced by 100ng/ml rhIL-6], http://www.100md.com
A，C：normal control；B，D，E，F：incubation with rhIL-6 for 4d；A，B：wright’s staining(×1000)；C，D，E，F：trans-mission electron micrograph
], http://www.100md.com
图4 100ng/ml rhIL-6作用前后M1细胞DNA的琼脂糖凝胶电泳], http://www.100md.com
Fig4 1.5% agarose gel electrophoresis of DNA samples from M1 cells treated with or without 100ng/ml rhIL-6], http://www.100md.com
2.3 凋亡的可能机制为Bcl-2/Bax比例下降 为探讨M1细胞分化后凋亡的可能机制,我们以bcl-2、bax cDNA为探针，检测了10ng/ml rhIL-6处理不同时间bcl-2、bax mRNA表达水平的改变。首先用PstI、BamH1双酶切鉴定了含bcl-2与bax cDNA的质粒，分别切出了345bp与222bp的片段，与预测相符，证实所用质粒正确。接着回收了这两个片段，按光敏生物素试剂盒说明书进行光敏生物素标记，提取细胞总RNA，进行狭缝杂交。结果表明，10ng/ml rhIL-6处理6h后，bcl-2表达即明显减低，12～24h达最大抑制；而bax的表达水平则呈上升趋势(见图5)，bax表达的改变于24h时开始出现，到48h更强。
], http://www.100md.com
图5 狭缝杂交检测10ng/ml rhIL-6处理前后M1细胞中bcl-2、bax表达水平的改变], http://www.100md.com
Fig5 Changes of expression of bcl-2 and bax are induced by rhIL-6.
A：Blot hybridization analysis of bcl-2 and bax expression in[0cn, http://www.100md.com
10ng/ml rhIL-6-treated M1 cells[0cn, http://www.100md.com
B：The hybridization signals were quantified by densitometry scanning[0cn, http://www.100md.com
and expressed as the ratios of bcl-2 to GAPD and bax to GAPD[0cn, http://www.100md.com
as a function of time of IL-6 treatment.[0cn, http://www.100md.com
我们还采用半定量RT-PCR的方法检测了M1细胞中，10ng/ml rhIL-6处理前后bcl-2家族另两个成员bcl-XL与bcl-Xs表达的改变。bcl-XL与bcl-Xs是同一基因的不同转录本，据报道，我们采用的引物若扩增出0.8Kb的片段，即代表bcl-XL；若扩增出0.6Kb的片段，则代表bcl-Xs。结果我们仅扩增出了0.8Kb的片段，未扩出0.6Kb的片段，说明细胞不表达bcl-Xs，而bcl-XL的表达水平在处理后明显减低(见图6)。
[0cn, http://www.100md.com
图6 RT-PCR检测10ng/ml rhIL-6处理前后M1细胞中bcl-X表达水平的改变[0cn, http://www.100md.com
Fig6 RT-PCR analysis of bcl-X expression in 10ng/ml rhIL-6-treated M1 cells[0cn, http://www.100md.com
1～4：GAPD；5：DL2000；6～9：bcl-X；1，6：negative control；2，7：incubation with rhIL-6 for 0d；3，8：incubation with rhIL-6 for 1d；[0cn, http://www.100md.com
4，9：incubation with rhIL-6 for 2d
3 讨论u?, http://www.100md.com
bcl-2家族与凋亡密切相关，其中bcl-2、bcl-XL等家族成员为凋亡抑制基因，而bax、bcl-Xs等为凋亡促进基因。目前认为Bcl-2/Bax比例决定细胞命运；Bcl-2与Bax可形成异源二聚体，此异源二聚体表现为抗凋亡效应；但若Bax过量，Bax则形成同源二聚体，促进细胞凋亡[5]。Bcl-XL与Bcl-2相似，亦可与Bax形成异源二聚体，有很强的抗凋亡效应，而Bcl-Xs则恰好相反，它优先与Bcl-2形成二聚体，使Bax倾向于形成同源二聚体，促进凋亡[4]。从我们的结果来看，由于IL-6处理后M1细胞中bcl-2、bcl-XL表达下调，bax表达上调，而bcl-Xs在M1细胞中不表达，故Bcl-2/Bax比例下降，Bax同源二聚体增加，细胞走向凋亡。由于凋亡发生在向巨噬细胞分化后，故我们称之为“分化后凋亡”。凋亡也部分地解释了IL-6处理后M1细胞饱和密度下降的原因。u?, http://www.100md.com
然而我们的结果与Yonish等的报道却似乎是矛盾的。1991年，Yonish等报道在野生型P53蛋白缺失的M1细胞中表达外源P53蛋白致细胞凋亡，而IL-6可抑制野生型P53蛋白诱导的凋亡[6]。为什么IL-6在野生型P53蛋白存在时抑制凋亡发生，而在野生型P53蛋白缺如时又可诱导凋亡？其机制我们一无所知。但我们可以推测：IL-6抑制P53下游分子的表达，从而拮抗了野生型P53蛋白所致的细胞凋亡；在野生型P53缺如的情况下，这种拮抗效应体现不出来，而IL-6对bcl-2家族的影响使细胞走向凋亡。u?, http://www.100md.com
尽管M1细胞的凋亡机制我们还不大清楚，但IL-6诱导M1细胞生长停止、向巨噬细胞方向分化、乃至最终凋亡的意义却是明确的。深入研究IL-6对白血病细胞的生物学效应，对于探讨白血病的发病机制、研究IL-6信号转导机制及细胞分化凋亡机制都有重要意义。u?, http://www.100md.com
作者简介：张纪岩(1972-)，女，黑龙江人，博士生，主要从事细胞因子受体的研究。u?, http://www.100md.com
参考文献：u?, http://www.100md.com
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[3] BULLOCK G，TANG C，TOURKINA E，et al.Effect of combined treatment with interleukin-3 and interleukin-6 on 4-hydroperoxycyclo-phosphamide-induced programmed cell death or apoptosis in human myeloid leukemia [J].Exp Hematol，1993，21：1640～1647.y()*|vn, 百拇医药
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[6] YONISH-RONACH E，RESNIZKY D，LOTEM J，et al.Wild-type p53 induces apoptosis of myeloid leukemic cells that is inhibited by interlukin-6 [J].Nature，1991，352：345～347.y()*|vn, 百拇医药
收稿日期：1999-03-16y()*|vn, 百拇医药
修回日期：1999-09-30(张纪岩 沈倍奋 王建安 张学敏)
单位：张纪岩(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850)； 沈倍奋(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850)； 王建安(军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850)； 张学敏(国家生物医学分析中心，北京 100850)k*wl, 百拇医药
关键词：IL-6；M1；凋亡；Bcl-2/Baxk*wl, 百拇医药
免疫学杂志000105 摘 要：目的 探讨IL-6能否诱导M1小鼠急性髓样白血病细胞凋亡及其分子机制。方法 透射电镜观察细胞形态判断有无凋亡发生；RT-PCR及狭缝杂交分析bcl-2家族成员表达水平的改变。结果 IL-6诱导M1细胞向巨噬细胞方向分化后，M1细胞发生凋亡；bcl-2、bcl-XL在IL-6诱导下表达下调，bax表达上调。结论 IL-6诱导Bcl-2/Bax比例改变，使M1细胞分化后凋亡。k*wl, 百拇医药
中图分类号：R392.11 文献标识码：Ak*wl, 百拇医药
Apoptosis of M1 cells is induced by IL-6 after the cells undergo diffe-rentiation and its molecular mechanismk*wl, 百拇医药
ZHANG Ji-yan SHEN Bei-fen WANG Jian-ank*wl, 百拇医药
(Institute of Basic Medical Science，Academy of Military Medical Science，Beijing 100850，China)k*wl, 百拇医药
ZHANG Xue-mink*wl, 百拇医药
(National Center of Biomedical Analysis，Beijing 100850，China)k*wl, 百拇医药
Abstract：Objective To investigate whether and how IL-6 can induce apoptosis of M1 myeloid leukemic cells.Methods We determined the role of IL-6 in apoptosis of M1 cells with transmission electron micrograph.We also detected the effect of IL-6 on the expression level of bcl-2 family.Results IL-6 could induce apoptosis of M1 cells after the cells underwent terminal differentiation.The molecular mechanism might be that IL-6 downregulated expression of bcl-2 and bcl-XL，but up-regulated that of bax.Conclusion IL-6 makes the ration of Bcl-2/Bax change，which results in apoptosis of M1 cells.
Key words：IL-6；M1；apoptosis；Bcl-2/Bax▲te[u, 百拇医药
IL-6一贯被看作是凋亡抑制因子，它可抑制TGF β1、某些细胞毒化合物、野生型P53诱导的急性髓系白血病细胞凋亡[1]。在IL-6依赖株中，IL-6表现出更明确的抗凋亡效应——细胞在撤去IL-6后大量凋亡，其机制可能为JAK-STATs通路激活后诱导bcl-XL表达；高水平表达外源bcl-2基因能抑制IL-6饥饿的B9骨髓瘤细胞凋亡[2]。然而，由于IL-6生物学效应的多样性与双向性，细胞也可表现出不同甚至相反的效应。IL-3与IL-6联合预处理显著增强4-HC(4-hydroperoxycyclophosphamide)诱导的HL-60细胞凋亡，其机制可能为预处理增强了4-HC所致的HL-60细胞bcl-2、c-myc基因表达下调[3]。与此一致的是，我们在以M1细胞为模型的研究中发现：10～100ng/ml rhIL-6处理4～5d后，M1细胞表现出明确的凋亡特征。由于M1细胞中野生型P53缺如，我们检测了rhIL-6处理前后bcl-2家族成员bcl-2、bax、bcl-X的表达情况，探讨M1细胞在rhIL-6处理后走向调亡的可能机制。te[u, 百拇医药
1 材料和方法te[u, 百拇医药
1.1 材料te[u, 百拇医药
1.1.1 细胞：M1细胞由本所王嘉玺教授惠赠，培养于10%FCS-1640中，每2～4d传代1次。te[u, 百拇医药
1.1.2 试剂：rhIL-6(溶于含0.1BSA的PBS中)的比活性为107U/mg，AMV逆转录酶、Taq酶、BCIP、NBT等购自Promega公司。te[u, 百拇医药
1.1.3 探针及引物：含bcl-2、bax cDNA的质粒由本室保存。bcl-X引物[4]序列如下：te[u, 百拇医药
P5：5’-GTGAGTGGACGGTCAGTG-3’te[u, 百拇医药
P3：5’-TTGGACAATGGACTGGTTGA-3’te[u, 百拇医药
1.2 方法te[u, 百拇医药
1.2.1 rhIL-6对M1细胞增殖影响的检测：将M1细胞调成5×104/ml的密度，植入24孔板，每孔1ml，加0，1，10μg/ml rhIL-6各10μl(n＝2)，37°C孵箱培养，每日计数。
1.2.2 墨汁吞噬试验：将不同剂量rhIL-6处理0、1、2、3、4d的M1细胞用冰冷PBS洗2次后，调细胞密度为5×105/ml，每0.1ml加入滤纸滤过的优质墨汁10μl。37°C温育30min或4h，洗去游离墨粒，甩片，Wright’s染色，油镜下计数胞浆中吞有大小墨粒5个以上的阳性细胞。5p8e, 百拇医药
1.2.3 DNA抽提：100ng/ml rhIL-6处理后，于不同时间(0、1、2、3、4d)各取M1细胞约106，PBS洗2次后，移入1.5ml微量离心管中，离心去上清：加0.5ml裂解液(1g/L蛋白酶K；10mmol/L Tris-C1，pH8.0；150mmol/L NaCl；10mmol/L EDTA；0.4%SDS)重悬细胞，50°C过夜，不时振摇。加等体积酚抽提几次后，乙醇沉淀。沉淀溶于100μl TE(pH8.0)中，加RNase至终浓度0.5g/L，37°C保温30min后，1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。5p8e, 百拇医药
1.2.4 Wright’s染色及透射电镜观察细胞形态：按常规方法进行。5p8e, 百拇医药
1.2.5 RNA提取及RT-PCR：采用SDS/酚法提取细胞总RNA，OD260/OD280检测RNA完整性并定量。然后按下述方法进行RT-PCR，在0.5ml微量离心管中依次加入：2.5mmol/L dNTP 2.0μl，5×RT缓冲液2.0μl，RNasin 1U，随机引物100ng，RNA 1.0μg，AMV 2U，用DEPC水补足体积至10μl。混匀，室温10min，42°C 60min，95°C 5min，骤冷。分别取反转录产物1.0μl、3.0μl作为模板，在25μl体系中(含2.5μl 10×PCR缓冲液，2.0μl 2.5mmol/L dNTP，20μmol/L P5、P3各1.0μl，Taq酶1U)扩增GAPD和bcl-X。94°C 1min、60°C 1min、72°C 1min，共35个循环，72°C延伸7min。最后取5μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。5p8e, 百拇医药
1.2.6 探针制备及狭缝杂交：含有bcl-2、bax cDNA的质粒经PstI、BamHI双酶切鉴定正确后，回收345bp、222bp片段，按光敏生物素试剂盒说明书进行光敏生物素标记及狭缝杂交。5p8e, 百拇医药
2 结果
2.1 rhIL-6对M1细胞生长、分化的影响 rhIL-6明显抑制M1细胞增殖，使M1细胞饱和密度下降(见图1)。在生长停止的同时，M1细胞也恢复了终末分化，获得很强的墨汁吞噬能力，10～100ng/ml rhIL-6处理4d时，墨汁吞噬试验呈阳性的细胞达95%以上，且在30min内吞噬即达高峰，与4h无明显差异,表明M1向巨噬细胞方向分化(见图2)。
k^#3, 百拇医药图1 rhIL-6对M1细胞生长的影响k^#3, 百拇医药
Fig1 Effect of rhIL-6 on the growth of M1 cellsk^#3, 百拇医药
A：normal control；B：incubation with 10ng/ml rhIL-6；C：incubation with 100ng/ml rhIL-6
k^#3, 百拇医药图2 rhIL-6对M1细胞吞噬功能的影响k^#3, 百拇医药
Fig2 Effect of rhIL-6 on the phagocytic activity of M1 cells(Wright’s staining，×1000)k^#3, 百拇医药
A：normal control；B：incubation with 100ng/ml rhIL-6 for 4dk^#3, 百拇医药
2.2 rhIL-6诱导M1细胞分化后凋亡 M1向巨噬细胞分化后，在rhIL-6诱导下走向凋亡。100ng/ml rhIL-6处理4d后，M1细胞Wright’s染色可见类似凋亡小体的结构(见图3)。且细胞DNA呈典型的梯状ladder(见图4)。由于DNA梯状ladder不能作为区分坏死与凋亡的特征性标志，我们又取10ng/ml、100ng/ml处理4～5d的细胞做了透射电镜观察。电镜下可见10ng/ml、100ng/ml处理4～5d时，约有10% 的细胞呈现凋亡各期的典型形态特征：染色质核膜下凝聚呈帽状、块状或月牙状，胞浆固缩，内质网扩张，胞浆空泡化——胞核及细胞外形皱缩，核裂解成质膜包绕的团块，即凋亡小体，电镜下凋亡小体的存在是确认凋亡发生最可靠的依据。对照组则没有上述特征的细胞，说明凋亡确由rhIL-6诱导产生。
图3 100ng/ml rhIL-6作用前后M1细胞的形态变化], http://www.100md.com
Fig3 Morphological changes of M1 cells induced by 100ng/ml rhIL-6], http://www.100md.com
A，C：normal control；B，D，E，F：incubation with rhIL-6 for 4d；A，B：wright’s staining(×1000)；C，D，E，F：trans-mission electron micrograph
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Fig4 1.5% agarose gel electrophoresis of DNA samples from M1 cells treated with or without 100ng/ml rhIL-6], http://www.100md.com
2.3 凋亡的可能机制为Bcl-2/Bax比例下降 为探讨M1细胞分化后凋亡的可能机制,我们以bcl-2、bax cDNA为探针，检测了10ng/ml rhIL-6处理不同时间bcl-2、bax mRNA表达水平的改变。首先用PstI、BamH1双酶切鉴定了含bcl-2与bax cDNA的质粒，分别切出了345bp与222bp的片段，与预测相符，证实所用质粒正确。接着回收了这两个片段，按光敏生物素试剂盒说明书进行光敏生物素标记，提取细胞总RNA，进行狭缝杂交。结果表明，10ng/ml rhIL-6处理6h后，bcl-2表达即明显减低，12～24h达最大抑制；而bax的表达水平则呈上升趋势(见图5)，bax表达的改变于24h时开始出现，到48h更强。
], http://www.100md.com图5 狭缝杂交检测10ng/ml rhIL-6处理前后M1细胞中bcl-2、bax表达水平的改变], http://www.100md.com
Fig5 Changes of expression of bcl-2 and bax are induced by rhIL-6.
A：Blot hybridization analysis of bcl-2 and bax expression in[0cn, http://www.100md.com
10ng/ml rhIL-6-treated M1 cells[0cn, http://www.100md.com
B：The hybridization signals were quantified by densitometry scanning[0cn, http://www.100md.com
and expressed as the ratios of bcl-2 to GAPD and bax to GAPD[0cn, http://www.100md.com
as a function of time of IL-6 treatment.[0cn, http://www.100md.com
我们还采用半定量RT-PCR的方法检测了M1细胞中，10ng/ml rhIL-6处理前后bcl-2家族另两个成员bcl-XL与bcl-Xs表达的改变。bcl-XL与bcl-Xs是同一基因的不同转录本，据报道，我们采用的引物若扩增出0.8Kb的片段，即代表bcl-XL；若扩增出0.6Kb的片段，则代表bcl-Xs。结果我们仅扩增出了0.8Kb的片段，未扩出0.6Kb的片段，说明细胞不表达bcl-Xs，而bcl-XL的表达水平在处理后明显减低(见图6)。
[0cn, http://www.100md.com图6 RT-PCR检测10ng/ml rhIL-6处理前后M1细胞中bcl-X表达水平的改变[0cn, http://www.100md.com
Fig6 RT-PCR analysis of bcl-X expression in 10ng/ml rhIL-6-treated M1 cells[0cn, http://www.100md.com
1～4：GAPD；5：DL2000；6～9：bcl-X；1，6：negative control；2，7：incubation with rhIL-6 for 0d；3，8：incubation with rhIL-6 for 1d；[0cn, http://www.100md.com
4，9：incubation with rhIL-6 for 2d
3 讨论u?, http://www.100md.com
bcl-2家族与凋亡密切相关，其中bcl-2、bcl-XL等家族成员为凋亡抑制基因，而bax、bcl-Xs等为凋亡促进基因。目前认为Bcl-2/Bax比例决定细胞命运；Bcl-2与Bax可形成异源二聚体，此异源二聚体表现为抗凋亡效应；但若Bax过量，Bax则形成同源二聚体，促进细胞凋亡[5]。Bcl-XL与Bcl-2相似，亦可与Bax形成异源二聚体，有很强的抗凋亡效应，而Bcl-Xs则恰好相反，它优先与Bcl-2形成二聚体，使Bax倾向于形成同源二聚体，促进凋亡[4]。从我们的结果来看，由于IL-6处理后M1细胞中bcl-2、bcl-XL表达下调，bax表达上调，而bcl-Xs在M1细胞中不表达，故Bcl-2/Bax比例下降，Bax同源二聚体增加，细胞走向凋亡。由于凋亡发生在向巨噬细胞分化后，故我们称之为“分化后凋亡”。凋亡也部分地解释了IL-6处理后M1细胞饱和密度下降的原因。u?, http://www.100md.com
然而我们的结果与Yonish等的报道却似乎是矛盾的。1991年，Yonish等报道在野生型P53蛋白缺失的M1细胞中表达外源P53蛋白致细胞凋亡，而IL-6可抑制野生型P53蛋白诱导的凋亡[6]。为什么IL-6在野生型P53蛋白存在时抑制凋亡发生，而在野生型P53蛋白缺如时又可诱导凋亡？其机制我们一无所知。但我们可以推测：IL-6抑制P53下游分子的表达，从而拮抗了野生型P53蛋白所致的细胞凋亡；在野生型P53缺如的情况下，这种拮抗效应体现不出来，而IL-6对bcl-2家族的影响使细胞走向凋亡。u?, http://www.100md.com
尽管M1细胞的凋亡机制我们还不大清楚，但IL-6诱导M1细胞生长停止、向巨噬细胞方向分化、乃至最终凋亡的意义却是明确的。深入研究IL-6对白血病细胞的生物学效应，对于探讨白血病的发病机制、研究IL-6信号转导机制及细胞分化凋亡机制都有重要意义。u?, http://www.100md.com
作者简介：张纪岩(1972-)，女，黑龙江人，博士生，主要从事细胞因子受体的研究。u?, http://www.100md.com
参考文献：u?, http://www.100md.com
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收稿日期：1999-03-16y()*|vn, 百拇医药
修回日期：1999-09-30(张纪岩 沈倍奋 王建安 张学敏)