H-2Kb基因转移诱导小鼠心肌移植免疫耐受
作者：李蓁 李树浓 徐鸿绪 曾文涛 陈规划 朱振宇*6'(0d;, 百拇医药
单位：李蓁(中山医科大学附属第一医院外科实验室，广东 广州 510080); 徐鸿绪(中山医科大学附属第一医院外科实验室，广东 广州 510080); 曾文涛(中山医科大学附属第一医院外科实验室，广东 广州 510080)； 陈规划(中山医科大学附属第一医院外科实验室，广东 广州 510080)； 李树浓(中山医科大学病理生理学教研室，广东 广州 510089)； 朱振宇(中山医科大学生物化学教研室，广东 广州 510089)*6'(0d;, 百拇医药
关键词：基因转移；小鼠；移植；免疫耐受*6'(0d;, 百拇医药
免疫学杂志000102*6'(0d;, 百拇医药
摘 要：目的 探讨H-2Kb基因转移诱导小鼠心肌移植免疫耐受的可行性。方法 通过逆转录病毒载体介导的基因转移技术，将供体小鼠(C57 BL/6)的H-2Kb基因(小鼠MHC-Ⅰ类基因)导入到受体小鼠(BALB/c)的造血细胞。结果 H-2Kb基因可以稳定地整合进小鼠造血细胞的基因内，并在受体内表达较长时间。正常对照小鼠的心肌移植物平均存活时间(MST)为9.4±1.84d。诱导耐受组小鼠的心肌移植物MST为45.7±6.001d，比对照组明显延长(P<0.05)。结论 H-2Kb基因转移诱导了供体特异性的免疫耐受，为临床移植控制排斥反应提供了一种新的方法。*6'(0d;, 百拇医药
中图分类号：R392.4 文献标识码：A*6'(0d;, 百拇医药
Induction of myocardium transplantation tolerance by H-2Kb gene transfer in mice*6'(0d;, 百拇医药
LI Zhen XU Hong-xu ZENG Wen-tao CHEN Gui-hua*6'(0d;, 百拇医药
(Laboratory of Surgery， the First Affiliated Hospital， Sun Yat-Sen University of Medical Sciences， Guangzhou 510080，China)*6'(0d;, 百拇医药
LI Shu-nong?jx, 百拇医药
(Department of Pathophysiology，Sun Yat-Sen University of Medical Sciences，Guangzhou 510089，China)?jx, 百拇医药
ZHU Zhen-yu?jx, 百拇医药
(Department of Biochemistry，Sun Yat-Sen University of Medical Sciences，Guangzhou 510089，China)?jx, 百拇医药
Abstract：Objective To look for the effect of H-2Kb gene transfer on myocardium transplantation tolerance in mice.Methods H-2Kb gene of donor mouse(C57BL/6)was transferred into the recipient(BALB/c)murine hematopoietic cells by retrovirus-mediated gene transfer technique.Results H-2Kb gene could be transferred into murine hematopoietic cells successfully，and it can express stably long in the recipient mice.The median survival time(MST)of heart graft in the induced tolerance group was significantly longer than that of the control group(45.7±6.001 days vs 9.4±1.84 days， P<0.05). Conclusion Donor-specific immune tolerance to allograft has been induced by H-2Kb gene transfer.This may provide a novel way for inhibiting transplantation rejection in clinical transplantation.
Key words：gene transfer；mouse；transplantation；immune tolerance▲w@7?\*, http://www.100md.com
器官移植的主要障碍是由于供受者之间主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex， MHC)的差异所引起的免疫排斥反应。临床上主要应用大剂量的免疫抑制剂来控制排斥反应，但这样也降低了机体对感染和肿瘤等的抵抗力。解决这一难题的有效途径，是诱导受体对供体组织抗原产生特异性免疫耐受[1]。本研究应用分子克隆技术，将供体小鼠H-2Kb基因导入受体小鼠的造血细胞，并用小鼠心肌移植的模型，初步探讨了通过H-2Kb基因转移诱导移植免疫耐受的可行性。w@7?\*, http://www.100md.com
1 材料和方法w@7?\*, http://www.100md.com
1.1 动物 BALB/c(H-2d)、C57BL/6(H-2b)、CBA/J(H-2K)近交系小鼠，8～10周龄，18～22g，雌雄兼用，由中山医科大学实验动物中心提供。w@7?\*, http://www.100md.com
1.2 试剂 脂质体(lipofectin)、G418(geneticin)、限制性内切酶和RPMI1640培养基均购自Gibco公司。AMV逆转录酶购自Promega公司。PBR322 DNA/Hinf Ⅰ Marker、pGEM-7zf Hae Ⅲ DNA Marker、PCR markers购自华美生物工程公司。FITC标记抗小鼠H-2Kb单克隆抗体购自Pharmingen公司。w@7?\*, http://www.100md.com
1.3 质粒pXN(N2-B19-H-2Kb cDNA)和空载体N2 由美国国立卫生研究院SANDRA DOREN博士惠赠。w@7?\*, http://www.100md.com
1.4 仪器 PCR仪(型号PTC-150，美国MJ-Research公司产品)。流式细胞仪(型号EPICS ELITE，美国Coulter公司产品)。心电图机(XDH-3B型，上海医用电子仪器厂)。w@7?\*, http://www.100md.com
1.5 质粒DNA的提取、酶切鉴定和纯化 按文献[2]进行。参照lipofectin说明书用脂质体介导H-2Kb基因转染包装细胞PA317。筛选抗性克隆并测定病毒滴度[3]。
1.6 BALB/c小鼠造血细胞的感染[4]及其目的基因的检测 分别提取小鼠造血细胞的DNA、RNA，用相应的基因特异引物进行PCR和RT-PCR[2]。;lsn, 百拇医药
1.7 H-2kb抗原表达的检测 用FITC标记的抗小鼠H-2Kb单克隆抗体分别标记感染及未感染的小鼠造血细胞(培养5d)，用流式细胞仪检测其H-2Kb抗原的表达。;lsn, 百拇医药
1.8 转移的H-2Kb基因在受体内的较长期表达 受体BALB/c小鼠以60Co γ射线8.0Gy全身照射后，4h内由尾静脉输入转导H-2Kb基因或空载体的BALB/c小鼠骨髓细胞悬液0.2ml/只(浓度为1.5×107/ml)。在2、8、12周，用PCR动态检测导入的基因在受体内的表达。;lsn, 百拇医药
1.9 小鼠耳后心肌移植 在受体小鼠(BALB/c，H-2Kb阴性)回输表达H-2Kb基因的造血细胞2周后，进行小鼠耳后心肌移植，观察其存活时间。参照BABANG等的方法[5]稍加修改。术后第5d起，在乙醚麻醉下用心电图机测录移植心肌的心电活动。如术后8d仍未出现心电，则为移植手术失败，不列入实验观察数据。以心电活动消失日作为排斥终点，并进行移植心肌的病理观察。;lsn, 百拇医药
1.10 统计学分析方法 实验数据均以
±s表示。多组间比较采用方差分析及Student-Newman-Keuls检验进行两两比较。显著性检验采用双侧检验，所有计算采用SPSS for Windows软件在微型计算机上进行。;lsn, 百拇医药
2 结果;lsn, 百拇医药
2.1 抗性克隆的筛选及病毒滴度 用脂质体将pXN质粒DNA转染PA317细胞，48h后加300μg/ml G418进行选择培养。2d后细胞开始死亡，10d后大部分细胞死亡，仅见散在的抗G418细胞团。2周后逐渐形成肉眼可见的抗性细胞克隆。所得病毒滴度最高可达2.2×106CFU/ml。;lsn, 百拇医药
2.2 转染后小鼠造血细胞中目的基因的检测
2.2.1 PCR检测：转染后小鼠造血细胞的DNA PCR扩增产物为274bp，说明其整合了H-2Kb cDNA基因(见图1)。
moz-%ew, 百拇医药
图1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳moz-%ew, 百拇医药
Fig1 Agarose gel electrophoresis of the PCR productmoz-%ew, 百拇医药
1：N2-vector infected mice hematopoietic cellsmoz-%ew, 百拇医药
2：non-infected mice hematopoietic cellsmoz-%ew, 百拇医药
M：PBR322DNA/Hinf I Markermoz-%ew, 百拇医药
3：infected mice hematopoietic cellsmoz-%ew, 百拇医药
4：G418-resistant PA317/H-2Kb cell clonemoz-%ew, 百拇医药
2.2.2 RT-PCR检测：转染后小鼠造血细胞的RNA RT-PCR扩增产物为409bp，是从H-2Kb mRNA反转录的cDNA片段。说明其整合了H-2Kb cDNA基因，且可以转录为mRNA(见图2)。
moz-%ew, 百拇医药
图2 RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳moz-%ew, 百拇医药
Fig2 Agarose gel electrophoresis of the RT-PCR productmoz-%ew, 百拇医药
M：PGEM-7Zf Hae Ⅲ DNA Markermoz-%ew, 百拇医药
1：N2-vector infected mice hematopoietic cellsmoz-%ew, 百拇医药
2：infected mice hematopoietic cells
3：G418-resistant PA317/H-2Kb cell clonexl}78, http://www.100md.com
4：non-infected mice hematopoietic cellsxl}78, http://www.100md.com
2.3 流式细胞仪检测H-2Kb抗原的表达 空载体转染及未转染的BALB/c小鼠造血细胞的非特异性荧光染色为1.6%，重组逆转录病毒转染后表达H-2Kb抗原的BALB/c小鼠造血细胞为43.2%。说明其细胞膜上有H-2Kb抗原的表达。xl}78, http://www.100md.com
2.4 导入的H-2Kb基因在受体内的较长期表达 输注细胞2、8、12周后，输入已转导H-2Kb基因造血细胞的受体BALB/c小鼠，其骨髓细胞DNA的PCR扩增产物为274bp，而空载体转染及未转染的受体BALB/c小鼠结果为阴性(见图3)。
xl}78, http://www.100md.com
图3 PCR检测H-2Kb基因在受体内的表达xl}78, http://www.100md.com
Fig3 Expression of H-2Kb gene in recipientM：PBR322 DNA/Hinf Ⅰ Markerxl}78, http://www.100md.com
1：C57BL/6 2：non-infected BALB/c 3：12 weeks post-transplantationxl}78, http://www.100md.com
4：8 weeks post-transplantation 5：N2-vector infected BALB/cxl}78, http://www.100md.com
6：2 weeks post-transplantationxl}78, http://www.100md.com
2.5 H-2Kb基因转移对小鼠心肌移植物存活时间的影响 重组逆转录病毒载体转染组的移植心肌存活时间明显延长，与其它组比较，有显著性差异(P<0.05)。且正常排斥第三供体CBA/J小鼠(P<0.05)。而空载体转染组、第三供体组的移植心肌平均存活时间(MST)与未转染组比较，无显著性差异(P>0.05)(见表1)。
表1 H-2Kb基因转移对小鼠心肌移植的作用(n＝10)-'u)(26, http://www.100md.com
Tab1 The effect of H-2Kb gene transfer on murine myocardium transplantation Group-'u)(26, http://www.100md.com
Donor-'u)(26, http://www.100md.com
Recipient-'u)(26, http://www.100md.com
Survival time of the graft(days)(+s)-'u)(26, http://www.100md.com
A-'u)(26, http://www.100md.com
C57BL/6-'u)(26, http://www.100md.com
BALB/c-'u)(26, http://www.100md.com
9.4±1.84＃-'u)(26, http://www.100md.com
B-'u)(26, http://www.100md.com
C57BL/6-'u)(26, http://www.100md.com
BALB/c(transfection with N2)-'u)(26, http://www.100md.com
8.8±1.48-'u)(26, http://www.100md.com
C-'u)(26, http://www.100md.com
C57BL/6-'u)(26, http://www.100md.com
BALB/c(transfection with pXN)-'u)(26, http://www.100md.com
45.7±6.001-'u)(26, http://www.100md.com
D-'u)(26, http://www.100md.com
CBA/J-'u)(26, http://www.100md.com
BALB/c(transfection with pXN)-'u)(26, http://www.100md.com
9.3±1.64＃-'u)(26, http://www.100md.com
E
CBA/J+#k], http://www.100md.com
BALB/c(transfection with N2)+#k], http://www.100md.com
9.2±1.55＃+#k], http://www.100md.com
F+#k], http://www.100md.com
CBA/J+#k], http://www.100md.com
BALB/c+#k], http://www.100md.com
9.6±1.71+#k], http://www.100md.com
*P<0.05，compared with other groups ＃P>0.05，compared with B and F；E and F or F respectively+#k], http://www.100md.com
2.6 移植心肌的组织学改变 在未转染组心电活动终点(约第9d)，未转染组、空载体转染组及第三供体组的移植心肌细胞大部分受损，心肌纤维断裂、坏死，有较多淋巴细胞及单核细胞浸润；还可见广泛出血及中性粒细胞浸润和纤维细胞增生，血管扩张、淤血。而重组逆转录病毒载体转染组的心肌结构完整，心肌纤维中未见淋巴细胞及单核细胞浸润，亦未见出血及中性粒细胞浸润。+#k], http://www.100md.com
3 讨论+#k], http://www.100md.com
转基因是否成功，可以通过对基因水平、转录水平和蛋白质水平的检测来确定。首先，用PCR在基因水平上证实外源目的基因是否已整合到靶细胞的染色体DNA上。结果显示重组逆转录病毒载体转染的BALB/c小鼠造血细胞的DNA PCR扩增产物为274bp，说明其整合了H-2Kb cDNA基因。其次，用RT-PCR在RNA水平上证实目的基因是否在靶细胞内有效地转录。结果显示重组逆转录病毒载体转染后的BALB/c小鼠造血细胞的RNA RT-PCR扩增产物为409bp，是从H-2Kb mRNA反转录的cDNA片段。说明其整合了H-2Kb cDNA基因，且能转录为mRNA。最后，通过流式细胞仪检测靶细胞膜上外源基因在蛋白质水平的表达。结果显示，逆转录病毒重组质粒转染后表达H-2Kb抗原的BALB/c小鼠造血细胞占43.2%，说明转染后的造血细胞中有H-2Kb抗原的表达。+#k], http://www.100md.com
根据我们的实验观察，用8.0Gy 60Co γ射线照射受鼠对其整体情况无影响。若不回输造血细胞，受鼠一般在照射2周后自行重建造血功能。照射后4h内由尾静脉输入转导H-2Kb基因或空载体的BALB/c小鼠骨髓细胞悬液，目的主要是抑制受鼠自身的骨髓造血细胞，从而观察导入的外源H-2Kb基因在受鼠体内的表达情况。结果表明：在输注细胞2、8、12周后，均从受体BALB/c小鼠的骨髓细胞中检测到外源H-2Kb基因的存在。提示：H-2Kb基因已稳定地整合进造血细胞的基因组内，并可以在受体内表达较长时间。
1963年，FULMER等首先报道小鼠同系新生及胚胎心脏耳后移植模型。经过不断改进，目前已建立了稳定的小鼠耳后同种心脏/心肌组织移植模型。该模型用心电作为指标来精确监测移植心肌的功能及排斥终点，指标较为客观，且手术简便，成功率高，重复性好，国内外已用于移植免疫学的研究。本实验结果显示，重组逆转录病毒载体转染组的移植心肌存活时间明显延长，与其它组比较，有显著性差异(P<0.05)。提示表达供体H-2Kb基因的造血细胞嵌合体回输受体小鼠后，在随后进行的器官移植中，可以诱导受体对供体产生一定程度的特异性免疫耐受，使来自原供体的移植物存活时间延长。这种耐受对其特定的供体具有特异的耐受性，但对第三供体的抗原仍保留其完整的免疫反应。因此可以克服由于应用免疫抑制剂使免疫功能整体下降的缺点。3kw'c{^, http://www.100md.com
利用基因转移技术诱导器官移植免疫耐受的优点是，基因修饰后的受体靶细胞带有受体自身的全部MHC抗原，因而在受者体内可以抵抗受体自身NK细胞的攻击而存活较长时间[6]，以达到诱导受体产生较长期免疫耐受的目的。要使基因修饰后的受体靶细胞长期存活，对转染靶细胞的选择就应尽量模拟正常的生理状态。所以我们选择受体小鼠骨髓造血细胞作为转移H-2Kb基因的靶细胞[7～9]，并使之成功地表达了外源MHC-Ⅰ类抗原。然后将这种表达供体MHC-Ⅰ类抗原的受体造血细胞回输受体，以小鼠心肌移植为模型，进行了诱导免疫耐受的研究。本研究为临床移植控制免疫排斥反应提供了一种新的方法和理论依据。■3kw'c{^, http://www.100md.com
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39470665)3kw'c{^, http://www.100md.com
作者简介：李蓁(1969-)，女，助理研究员，博士，主要从事移植免疫方面的研究。3kw'c{^, http://www.100md.com
参考文献：3kw'c{^, http://www.100md.com
[1]SMITH CV，ROSENGARD BR，GUZZETE PC，et al.Approaches to transplantation tolerance[J].Transplant Proc，1991，23：2157～2161.3kw'c{^, http://www.100md.com
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[3]KARGER BD，FELGNER PL，GADEK TR，et al.Evaluation of procedures for transfection using lipofectin regeagent[J].Focus，1990，12：25～29.8+7:{, 百拇医药
[4]LU L，GE Y，LI ZH，et al.CD34+++ stem/progentior cells purified from cryopreserved normal cord blood can be transduced with high efficiency by a retroviral vector and expranded ex vivo with stable integration and expression of Fanconi anemia complementation C gene[J].Cell Transplant，1995，4：493～498.8+7:{, 百拇医药
[5]BABANG G，MORRIS RE，BABANG I，et al.Eva-luation of the in vivo dose-response relationship of immunosuppressive drugs using a mouse heart transplant model：Application to cyclosporine[J].J Pharmcol Exp Therapen Tics，1988，244：259～265.8+7:{, 百拇医药
[6]ARTOUCHE A，TOURAINE JL.Reversal of chi-mera donor-to-host tolerance in a tolerance-free environment：Evidence of a non-deletional mechanism[J].Transplantation，1994，58：491～496.8+7:{, 百拇医药
[7]NIENHUIS AW，MCDONAGH KT，BODINE DM.Gene transfer into hematopoietic stem cell[J].Cancer，1991，67：2700～2704.8+7:{, 百拇医药
[8]DICK JE，REID SK，MURDOCH B，et al.Gene transfer into normal human hematopoietic cells using in vitro and in vivo assays[J].Blood，1991，78：624～629.8+7:{, 百拇医药
[9]BERNAD A，VARAS F，GALLEGO JM，et al.Ex vivo expansion and selection of retrovirally transducedbone marrow：an efficient methodology for gene-transfer to murine lympho-haemopoietic stem cells[J].Br J Haematol，1994，87：6～11.8+7:{, 百拇医药
收稿日期：1999-04-278+7:{, 百拇医药
修回日期：1999-07-27(李蓁 李树浓 徐鸿绪 曾文涛 陈规划 朱振宇)
单位：李蓁(中山医科大学附属第一医院外科实验室，广东 广州 510080); 徐鸿绪(中山医科大学附属第一医院外科实验室，广东 广州 510080); 曾文涛(中山医科大学附属第一医院外科实验室，广东 广州 510080)； 陈规划(中山医科大学附属第一医院外科实验室，广东 广州 510080)； 李树浓(中山医科大学病理生理学教研室，广东 广州 510089)； 朱振宇(中山医科大学生物化学教研室，广东 广州 510089)*6'(0d;, 百拇医药
关键词：基因转移；小鼠；移植；免疫耐受*6'(0d;, 百拇医药
免疫学杂志000102*6'(0d;, 百拇医药
摘 要：目的 探讨H-2Kb基因转移诱导小鼠心肌移植免疫耐受的可行性。方法 通过逆转录病毒载体介导的基因转移技术，将供体小鼠(C57 BL/6)的H-2Kb基因(小鼠MHC-Ⅰ类基因)导入到受体小鼠(BALB/c)的造血细胞。结果 H-2Kb基因可以稳定地整合进小鼠造血细胞的基因内，并在受体内表达较长时间。正常对照小鼠的心肌移植物平均存活时间(MST)为9.4±1.84d。诱导耐受组小鼠的心肌移植物MST为45.7±6.001d，比对照组明显延长(P<0.05)。结论 H-2Kb基因转移诱导了供体特异性的免疫耐受，为临床移植控制排斥反应提供了一种新的方法。*6'(0d;, 百拇医药
中图分类号：R392.4 文献标识码：A*6'(0d;, 百拇医药
Induction of myocardium transplantation tolerance by H-2Kb gene transfer in mice*6'(0d;, 百拇医药
LI Zhen XU Hong-xu ZENG Wen-tao CHEN Gui-hua*6'(0d;, 百拇医药
(Laboratory of Surgery， the First Affiliated Hospital， Sun Yat-Sen University of Medical Sciences， Guangzhou 510080，China)*6'(0d;, 百拇医药
LI Shu-nong?jx, 百拇医药
(Department of Pathophysiology，Sun Yat-Sen University of Medical Sciences，Guangzhou 510089，China)?jx, 百拇医药
ZHU Zhen-yu?jx, 百拇医药
(Department of Biochemistry，Sun Yat-Sen University of Medical Sciences，Guangzhou 510089，China)?jx, 百拇医药
Abstract：Objective To look for the effect of H-2Kb gene transfer on myocardium transplantation tolerance in mice.Methods H-2Kb gene of donor mouse(C57BL/6)was transferred into the recipient(BALB/c)murine hematopoietic cells by retrovirus-mediated gene transfer technique.Results H-2Kb gene could be transferred into murine hematopoietic cells successfully，and it can express stably long in the recipient mice.The median survival time(MST)of heart graft in the induced tolerance group was significantly longer than that of the control group(45.7±6.001 days vs 9.4±1.84 days， P<0.05). Conclusion Donor-specific immune tolerance to allograft has been induced by H-2Kb gene transfer.This may provide a novel way for inhibiting transplantation rejection in clinical transplantation.
Key words：gene transfer；mouse；transplantation；immune tolerance▲w@7?\*, http://www.100md.com
器官移植的主要障碍是由于供受者之间主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex， MHC)的差异所引起的免疫排斥反应。临床上主要应用大剂量的免疫抑制剂来控制排斥反应，但这样也降低了机体对感染和肿瘤等的抵抗力。解决这一难题的有效途径，是诱导受体对供体组织抗原产生特异性免疫耐受[1]。本研究应用分子克隆技术，将供体小鼠H-2Kb基因导入受体小鼠的造血细胞，并用小鼠心肌移植的模型，初步探讨了通过H-2Kb基因转移诱导移植免疫耐受的可行性。w@7?\*, http://www.100md.com
1 材料和方法w@7?\*, http://www.100md.com
1.1 动物 BALB/c(H-2d)、C57BL/6(H-2b)、CBA/J(H-2K)近交系小鼠，8～10周龄，18～22g，雌雄兼用，由中山医科大学实验动物中心提供。w@7?\*, http://www.100md.com
1.2 试剂 脂质体(lipofectin)、G418(geneticin)、限制性内切酶和RPMI1640培养基均购自Gibco公司。AMV逆转录酶购自Promega公司。PBR322 DNA/Hinf Ⅰ Marker、pGEM-7zf Hae Ⅲ DNA Marker、PCR markers购自华美生物工程公司。FITC标记抗小鼠H-2Kb单克隆抗体购自Pharmingen公司。w@7?\*, http://www.100md.com
1.3 质粒pXN(N2-B19-H-2Kb cDNA)和空载体N2 由美国国立卫生研究院SANDRA DOREN博士惠赠。w@7?\*, http://www.100md.com
1.4 仪器 PCR仪(型号PTC-150，美国MJ-Research公司产品)。流式细胞仪(型号EPICS ELITE，美国Coulter公司产品)。心电图机(XDH-3B型，上海医用电子仪器厂)。w@7?\*, http://www.100md.com
1.5 质粒DNA的提取、酶切鉴定和纯化 按文献[2]进行。参照lipofectin说明书用脂质体介导H-2Kb基因转染包装细胞PA317。筛选抗性克隆并测定病毒滴度[3]。
1.6 BALB/c小鼠造血细胞的感染[4]及其目的基因的检测 分别提取小鼠造血细胞的DNA、RNA，用相应的基因特异引物进行PCR和RT-PCR[2]。;lsn, 百拇医药
1.7 H-2kb抗原表达的检测 用FITC标记的抗小鼠H-2Kb单克隆抗体分别标记感染及未感染的小鼠造血细胞(培养5d)，用流式细胞仪检测其H-2Kb抗原的表达。;lsn, 百拇医药
1.8 转移的H-2Kb基因在受体内的较长期表达 受体BALB/c小鼠以60Co γ射线8.0Gy全身照射后，4h内由尾静脉输入转导H-2Kb基因或空载体的BALB/c小鼠骨髓细胞悬液0.2ml/只(浓度为1.5×107/ml)。在2、8、12周，用PCR动态检测导入的基因在受体内的表达。;lsn, 百拇医药
1.9 小鼠耳后心肌移植 在受体小鼠(BALB/c，H-2Kb阴性)回输表达H-2Kb基因的造血细胞2周后，进行小鼠耳后心肌移植，观察其存活时间。参照BABANG等的方法[5]稍加修改。术后第5d起，在乙醚麻醉下用心电图机测录移植心肌的心电活动。如术后8d仍未出现心电，则为移植手术失败，不列入实验观察数据。以心电活动消失日作为排斥终点，并进行移植心肌的病理观察。;lsn, 百拇医药
1.10 统计学分析方法 实验数据均以
±s表示。多组间比较采用方差分析及Student-Newman-Keuls检验进行两两比较。显著性检验采用双侧检验，所有计算采用SPSS for Windows软件在微型计算机上进行。;lsn, 百拇医药2 结果;lsn, 百拇医药
2.1 抗性克隆的筛选及病毒滴度 用脂质体将pXN质粒DNA转染PA317细胞，48h后加300μg/ml G418进行选择培养。2d后细胞开始死亡，10d后大部分细胞死亡，仅见散在的抗G418细胞团。2周后逐渐形成肉眼可见的抗性细胞克隆。所得病毒滴度最高可达2.2×106CFU/ml。;lsn, 百拇医药
2.2 转染后小鼠造血细胞中目的基因的检测
2.2.1 PCR检测：转染后小鼠造血细胞的DNA PCR扩增产物为274bp，说明其整合了H-2Kb cDNA基因(见图1)。
moz-%ew, 百拇医药图1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳moz-%ew, 百拇医药
Fig1 Agarose gel electrophoresis of the PCR productmoz-%ew, 百拇医药
1：N2-vector infected mice hematopoietic cellsmoz-%ew, 百拇医药
2：non-infected mice hematopoietic cellsmoz-%ew, 百拇医药
M：PBR322DNA/Hinf I Markermoz-%ew, 百拇医药
3：infected mice hematopoietic cellsmoz-%ew, 百拇医药
4：G418-resistant PA317/H-2Kb cell clonemoz-%ew, 百拇医药
2.2.2 RT-PCR检测：转染后小鼠造血细胞的RNA RT-PCR扩增产物为409bp，是从H-2Kb mRNA反转录的cDNA片段。说明其整合了H-2Kb cDNA基因，且可以转录为mRNA(见图2)。
moz-%ew, 百拇医药图2 RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳moz-%ew, 百拇医药
Fig2 Agarose gel electrophoresis of the RT-PCR productmoz-%ew, 百拇医药
M：PGEM-7Zf Hae Ⅲ DNA Markermoz-%ew, 百拇医药
1：N2-vector infected mice hematopoietic cellsmoz-%ew, 百拇医药
2：infected mice hematopoietic cells
3：G418-resistant PA317/H-2Kb cell clonexl}78, http://www.100md.com
4：non-infected mice hematopoietic cellsxl}78, http://www.100md.com
2.3 流式细胞仪检测H-2Kb抗原的表达 空载体转染及未转染的BALB/c小鼠造血细胞的非特异性荧光染色为1.6%，重组逆转录病毒转染后表达H-2Kb抗原的BALB/c小鼠造血细胞为43.2%。说明其细胞膜上有H-2Kb抗原的表达。xl}78, http://www.100md.com
2.4 导入的H-2Kb基因在受体内的较长期表达 输注细胞2、8、12周后，输入已转导H-2Kb基因造血细胞的受体BALB/c小鼠，其骨髓细胞DNA的PCR扩增产物为274bp，而空载体转染及未转染的受体BALB/c小鼠结果为阴性(见图3)。
xl}78, http://www.100md.com图3 PCR检测H-2Kb基因在受体内的表达xl}78, http://www.100md.com
Fig3 Expression of H-2Kb gene in recipientM：PBR322 DNA/Hinf Ⅰ Markerxl}78, http://www.100md.com
1：C57BL/6 2：non-infected BALB/c 3：12 weeks post-transplantationxl}78, http://www.100md.com
4：8 weeks post-transplantation 5：N2-vector infected BALB/cxl}78, http://www.100md.com
6：2 weeks post-transplantationxl}78, http://www.100md.com
2.5 H-2Kb基因转移对小鼠心肌移植物存活时间的影响 重组逆转录病毒载体转染组的移植心肌存活时间明显延长，与其它组比较，有显著性差异(P<0.05)。且正常排斥第三供体CBA/J小鼠(P<0.05)。而空载体转染组、第三供体组的移植心肌平均存活时间(MST)与未转染组比较，无显著性差异(P>0.05)(见表1)。
表1 H-2Kb基因转移对小鼠心肌移植的作用(n＝10)-'u)(26, http://www.100md.com
Tab1 The effect of H-2Kb gene transfer on murine myocardium transplantation Group-'u)(26, http://www.100md.com
Donor-'u)(26, http://www.100md.com
Recipient-'u)(26, http://www.100md.com
Survival time of the graft(days)(
+s)-'u)(26, http://www.100md.comA-'u)(26, http://www.100md.com
C57BL/6-'u)(26, http://www.100md.com
BALB/c-'u)(26, http://www.100md.com
9.4±1.84＃-'u)(26, http://www.100md.com
B-'u)(26, http://www.100md.com
C57BL/6-'u)(26, http://www.100md.com
BALB/c(transfection with N2)-'u)(26, http://www.100md.com
8.8±1.48-'u)(26, http://www.100md.com
C-'u)(26, http://www.100md.com
C57BL/6-'u)(26, http://www.100md.com
BALB/c(transfection with pXN)-'u)(26, http://www.100md.com
45.7±6.001-'u)(26, http://www.100md.com
D-'u)(26, http://www.100md.com
CBA/J-'u)(26, http://www.100md.com
BALB/c(transfection with pXN)-'u)(26, http://www.100md.com
9.3±1.64＃-'u)(26, http://www.100md.com
E
CBA/J+#k], http://www.100md.com
BALB/c(transfection with N2)+#k], http://www.100md.com
9.2±1.55＃+#k], http://www.100md.com
F+#k], http://www.100md.com
CBA/J+#k], http://www.100md.com
BALB/c+#k], http://www.100md.com
9.6±1.71+#k], http://www.100md.com
*P<0.05，compared with other groups ＃P>0.05，compared with B and F；E and F or F respectively+#k], http://www.100md.com
2.6 移植心肌的组织学改变 在未转染组心电活动终点(约第9d)，未转染组、空载体转染组及第三供体组的移植心肌细胞大部分受损，心肌纤维断裂、坏死，有较多淋巴细胞及单核细胞浸润；还可见广泛出血及中性粒细胞浸润和纤维细胞增生，血管扩张、淤血。而重组逆转录病毒载体转染组的心肌结构完整，心肌纤维中未见淋巴细胞及单核细胞浸润，亦未见出血及中性粒细胞浸润。+#k], http://www.100md.com
3 讨论+#k], http://www.100md.com
转基因是否成功，可以通过对基因水平、转录水平和蛋白质水平的检测来确定。首先，用PCR在基因水平上证实外源目的基因是否已整合到靶细胞的染色体DNA上。结果显示重组逆转录病毒载体转染的BALB/c小鼠造血细胞的DNA PCR扩增产物为274bp，说明其整合了H-2Kb cDNA基因。其次，用RT-PCR在RNA水平上证实目的基因是否在靶细胞内有效地转录。结果显示重组逆转录病毒载体转染后的BALB/c小鼠造血细胞的RNA RT-PCR扩增产物为409bp，是从H-2Kb mRNA反转录的cDNA片段。说明其整合了H-2Kb cDNA基因，且能转录为mRNA。最后，通过流式细胞仪检测靶细胞膜上外源基因在蛋白质水平的表达。结果显示，逆转录病毒重组质粒转染后表达H-2Kb抗原的BALB/c小鼠造血细胞占43.2%，说明转染后的造血细胞中有H-2Kb抗原的表达。+#k], http://www.100md.com
根据我们的实验观察，用8.0Gy 60Co γ射线照射受鼠对其整体情况无影响。若不回输造血细胞，受鼠一般在照射2周后自行重建造血功能。照射后4h内由尾静脉输入转导H-2Kb基因或空载体的BALB/c小鼠骨髓细胞悬液，目的主要是抑制受鼠自身的骨髓造血细胞，从而观察导入的外源H-2Kb基因在受鼠体内的表达情况。结果表明：在输注细胞2、8、12周后，均从受体BALB/c小鼠的骨髓细胞中检测到外源H-2Kb基因的存在。提示：H-2Kb基因已稳定地整合进造血细胞的基因组内，并可以在受体内表达较长时间。
1963年，FULMER等首先报道小鼠同系新生及胚胎心脏耳后移植模型。经过不断改进，目前已建立了稳定的小鼠耳后同种心脏/心肌组织移植模型。该模型用心电作为指标来精确监测移植心肌的功能及排斥终点，指标较为客观，且手术简便，成功率高，重复性好，国内外已用于移植免疫学的研究。本实验结果显示，重组逆转录病毒载体转染组的移植心肌存活时间明显延长，与其它组比较，有显著性差异(P<0.05)。提示表达供体H-2Kb基因的造血细胞嵌合体回输受体小鼠后，在随后进行的器官移植中，可以诱导受体对供体产生一定程度的特异性免疫耐受，使来自原供体的移植物存活时间延长。这种耐受对其特定的供体具有特异的耐受性，但对第三供体的抗原仍保留其完整的免疫反应。因此可以克服由于应用免疫抑制剂使免疫功能整体下降的缺点。3kw'c{^, http://www.100md.com
利用基因转移技术诱导器官移植免疫耐受的优点是，基因修饰后的受体靶细胞带有受体自身的全部MHC抗原，因而在受者体内可以抵抗受体自身NK细胞的攻击而存活较长时间[6]，以达到诱导受体产生较长期免疫耐受的目的。要使基因修饰后的受体靶细胞长期存活，对转染靶细胞的选择就应尽量模拟正常的生理状态。所以我们选择受体小鼠骨髓造血细胞作为转移H-2Kb基因的靶细胞[7～9]，并使之成功地表达了外源MHC-Ⅰ类抗原。然后将这种表达供体MHC-Ⅰ类抗原的受体造血细胞回输受体，以小鼠心肌移植为模型，进行了诱导免疫耐受的研究。本研究为临床移植控制免疫排斥反应提供了一种新的方法和理论依据。■3kw'c{^, http://www.100md.com
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39470665)3kw'c{^, http://www.100md.com
作者简介：李蓁(1969-)，女，助理研究员，博士，主要从事移植免疫方面的研究。3kw'c{^, http://www.100md.com
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收稿日期：1999-04-278+7:{, 百拇医药
修回日期：1999-07-27(李蓁 李树浓 徐鸿绪 曾文涛 陈规划 朱振宇)