CD59融合蛋白表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达
作者：周镜然 白 云 姜 曼 黎万玲%3;&}9\, 百拇医药
单位：第三军医大学免疫学教研室，重庆 400038%3;&}9\, 百拇医药
关键词：CD59；融合蛋白；表达%3;&}9\, 百拇医药
免疫学杂志000205摘 要：目的探索GPI锚固蛋白的体外表达，获得具有生物学活性的可溶性游离CD59分子。方法 通过PCR选择性扩增编码成熟CD59氨基酸序列的基因片段，并将之克隆入PinPoint Xa—3质粒中。IPTG诱导融合蛋白表达，产物经亲和素树脂亲和层析。在体外微量反应性溶血抑制实验中检测重组CD59纯化样品的生物学活性。结果 筛选得到的重组子诱导后表达分子量约为22kD的生物素化CD59融合蛋白。亲和素树脂纯化得到高纯度的蛋白样品。纯化分子在反应性溶血实验中表现出溶血抑制活性。结论 本研究对体外表达无GPI—锚的可溶性游离CD59分子进行了表达探索，获得具一定生物学活性的游离重组CD59，为进一步研制应用型CD59活性分子打下基础。%3;&}9\, 百拇医药
分类号：CD59 文献标识码：A%3;&}9\, 百拇医药
文章编号：1000—8861(9900)02—0096—03%3;&}9\, 百拇医药
Recombination and expression of soluble human CD59 in E. Coli%3;&}9\, 百拇医药
ZHOU Jing-ran,BAI Yun,JIANG Man,LI Wan-ling%3;&}9\, 百拇医药
(Department of Immunology, the Third Military Medical University, Chongqing 400038,China)%3;&}9\, 百拇医药
Abstract：Objective To obtain soluble recombinant human CD59 with high activity. Methods The gene sequence which codes natural CD59 extracellular portion containing 77 amino acids was amplified with PCR. The fragment was cloned into prokaryotic expression vector PinPoint Xa-3. The recombinant protein expression was induced by IPTG and biotinylated products were purified by avidin resin. The activity of purified recombinant CD59 was evaluated by reactive assay in vitro. Resuits In PinPoint Xa-3 expression system, we obtained recombinant CD59 with a molecular wright of 22kDa. The thin layer gel scanning analysis showed that about 7% of total cell protein is newly expressed fusion protein. SDS-PAGE assay showed that the product affinity-purified by avidin resin has high purity. The reactive assay revealed that the purified protein had the activity of inhibiting hemolysis. Conclusion The fusion protein has the activity of natural CD59 to some extent.
Keywords：recombinant CD59;fusion protein; expression CD59分子是人体内重要的同源限制因子,能与C8α亚基和C9b分段特异性地结合，阻止MAC在膜上的进一步组装,而保护组织细胞免受自身补体的溶破。外源性补给CD59功能活性分子，阻止MAC在膜上的沉积并保护体内细胞免遭溶破，是控制MAC病理效应的良好途径，在某些溶血性疾病、移植排斥反应等的控制中有良好的应用前景。然而,天然CD59为GPI-锚固蛋白，其GPI-结构对它在膜上行使功能非常有利。它能使CD59在膜上定位，并易于靠近它的亲脂性作用位点，从而高效发挥其生物学功能。然欲通过基因工程、蛋白纯化的手段获得大量GPI-锚固蛋白却极其困难，目前尚无简单有效、经济可行的技术路线来实现。表达无GPI-锚的、分泌型目的蛋白，使其在溶相中发挥功能，是开发CD59这类GPI-锚固蛋白应用的可能途径。本研究中我们用PCR的方法选择性扩增编码成熟CD59分子氨基酸序列的基因片段，并将之重组入融合蛋白表达载体PinPointXa-3，在原核表达系统中获得了有功能的重组CD59融合蛋白样品。\gv, 百拇医药
1材料与方法\gv, 百拇医药
1.1实验材料JM109菌株由本室保存,PinPiontXa-3质粒购自Promega公司。CD59cDNA由本室白云博士制备。限制性内切酶、T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、PinpointXa蛋白纯化系统试剂盒分别购自华美、BoehringerMannhern、Promega公司。\gv, 百拇医药
1.2引物设计合成根据已知的CD59cDNA序列，设计了一对引物跨越成熟蛋白编码区，而不包括cDNA5'端的信号肽区和3'端的接锚信号肽编码区。上游引物5'-CCCAAGCTTCTGCAGTGCTACAACTGTCC包含起始密码子ATG，外设HindⅢ酶切位点；下游引物5'-CGCGGATCCTCATTAATTTTCAAGCTGTTCG包含两个串联的终止密码子TAA和TGA，后者为原核细胞偏性密码子，外发BamHⅠ位点。\gv, 百拇医药
1.3PCR循环条件以完整CD59cDNA链为模板进行聚合酶链式反应。循环条件为：94℃40s，46℃40s，72℃45s，共进行15个循环，最后一个循环72℃延伸5min。\gv, 百拇医药
1.4CD59重组质粒的构建质粒的提取、载体和目的基因片段的酶切、回收、连接、转化及阳性克隆的筛选鉴定均参照《分子克隆》方法进行。DNA序列分析在ABⅠ373A型DNA自动测序仪上进行。
1.5CD59融合蛋白的诱导表达将阳性克隆接种于含氨苄青霉素和2μmol/L生物素的LB培养基中，活化、扩增至OD600值达0.4～0.5左右时,加入IPTG至终浓度100μmol/L，37℃诱导4～5h。uy4\+%, http://www.100md.com
1.6CD59融合蛋白的纯化离心收集诱导后表达菌体，洗涤后于冰浴十超声破菌，离心收集上清。上清中即含可溶性菌体蛋白。以极慢的速度向亲和素树脂柱加入样品，用缓冲液反复淋洗亲和柱，再用含5mmol/L生物素的洗脱液洗脱目的蛋白。透析、浓缩后对重组CD59融合蛋白进行生物学活性测定。uy4\+%, http://www.100md.com
1.7CD59的生物学活性测定参照文献方法[5]进行微量反应性溶血抑制试验，2结果uy4\+%, http://www.100md.com
2.1PCR扩增目的片段以CD59cDNA为模板进行PCR扩增，产物进行琼脂糖凝胶电泳，可见一约240bp的特异扩增带，片段大小与理论预期—致(见图1)。uy4\+%, http://www.100md.com
图1CD59片段PCR扩增产物电泳分析uy4\+%, http://www.100md.com
Fig1ElectrophoresiesanalysisofPCRproductionuy4\+%, http://www.100md.com
1:DNAmarkersuy4\+%, http://www.100md.com
2:PCRproductionuy4\+%, http://www.100md.com
3:CD59cDNAfragmentuy4\+%, http://www.100md.com
2.2表达载体的构建及诱导表达Hind/ⅢBamHⅠ双酶切质粒PinPointXa—3CD59目的基因片段，连接后转化JMl09,进行质粒酶切分析,筛选出含目的片段的阳性克隆菌株(见图2)。DNA测序结果与预期一致。uy4\+%, http://www.100md.com
图2重组质粒PinPointCD59的限制性内切酶酶切鉴定uy4\+%, http://www.100md.com
Fig2ElectrophoresisanalysisorenzymaticdigestionofCD59recombinantplasmiduy4\+%, http://www.100md.com
1:λDNA/HindⅢmarkeruy4\+%, http://www.100md.com
2,3：recombinantplasmiddigestedbvHindⅢ/BamHⅠ
经IPTG诱导的阳性克隆菌体用15%的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS—PAGE电泳分析，结果显示在分子量约22kD处出现一新蛋白带，与理论预计的CD59融合蛋白分子量相吻合(见图3)。薄层扫描分析显示其占菌体总蛋白的7%左右。/ip, http://www.100md.com
2.3重组蛋白的纯化利用亲和素树脂柱对生物素化的融合蛋白进行纯化，用含5mmol/L生物素的缓冲液将之竞争洗脱。洗脱液经SDS—PAGE鉴定可见(见图4)，样品中主要是分子量为22kD的纯化CD59融合蛋白。/ip, http://www.100md.com
2.4CD59融合蛋白的功能鉴定纯化样品加入反应性溶血体系后，显示出溶血抑制活性，最高达到39%，说明融合蛋白具有一定的天然CD59分子功能活性。溶血抑制曲线见图5。/ip, http://www.100md.com
3讨论/ip, http://www.100md.com
本研究对CD59这一GPI—锚固分子在原核表达系统中的表达进行了探索，获得的可溶性游离分子在体外实验中证实具有天然分子功能，研究中选择的原核表达系统PinPiontXa为—带有tac启动子的融合蛋白表达载体,能表达带有126个氨基酸末端标记序列的融合蛋白,其中一赖氨酸残基可被大肠杆菌的生物素连接酶识别后生物素化。因此利用/ip, http://www.100md.com
图3PinPoint-CD59菌表达产物SDS—PAGE电泳分析/ip, http://www.100md.com
Fig3AnalysisoftheexpressionofrecombinantCD59fu-sionproteininE.ColibySDSPAGE/ip, http://www.100md.com
1：molecularweightmarker/ip, http://www.100md.com
2：DH5α/PinPoint—CD59.InducedbyIPTGf0r4h/ip, http://www.100md.com
3：DH5α,inducedbyIPTGfor4h/ip, http://www.100md.com
图4CD59融合蛋白生物素亲和素柱层析洗脱样品SDS—PAGE鉴定/ip, http://www.100md.com
Fig4AnalysisofpurifiedCD59fusionproteinbySDS—PAGE/ip, http://www.100md.com
1：molecularWeightmarker
2：recombinantCD59fusionproteinnpurificdbyavidinTesin.klw*, 百拇医药
图5纯化蛋白样品反应性溶血抑制曲线.klw*, 百拇医药
Fig5TheinhibitionofreactivelysisbypurifiedCD59fu—sionprotein.klw*, 百拇医药
亲和素柱可简便、高效地对融合蛋白进行纯化。不足的是其表达效率不高，本研究中只获得对目的蛋白70%的表达。但产物以可溶性形式存在于细胞浆中，可能对其分子折叠、构象形成和生物学活性有帮助。而产物为包涵体形式的原核表达系统虽表达效率更高，但产物生物学活性差、生性复性过程困难等弊端仍限制其应用。.klw*, 百拇医药
本研究中我们利用PCR技术，选择性扩增编码成熟CD59分子氨基酸厂了列的cDNA片段，而舍去5'端的信号肽和3'端的接锚信号肽序列。这样在原核表达系统所表达的重组CD59分子具有与天然分子相同的氨基酸序列，从而为产物的生物学活性提供了保障。由于研究中PCR所用模板是已自行克隆的CD59cDNA序列，可方便地大量获得。因此，我们在进行PCR循环中，加大模板用量(每反应lμg左右)的同时减少反应的循环次数，以期减小扩增产物的错配率。结果所获得产物中无碱基突变发生。.klw*, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770163).klw*, 百拇医药
作者简介：周镜然(1972)，女.四川威远人，博士生，主要从事补体分子生物学的研究。.klw*, 百拇医药
参考文献：.klw*, 百拇医药
[1]白 云.CD59抗原研究进展.见：朱锡华，主编.免疫学进展(第一集)[M].成都：四川科学技术出版社.1995.86～115..klw*, 百拇医药
[2]NINOMIYA H.SIMS PJ.The human complement regulatory protein CD59 binds to the α—chain of C8 and to the“b”domain of C9[J].J Biol Chem. 1992，267：13675～13680..klw*, 百拇医药
[3]MORGAN BP.Intervention in the complement sys-tem：a therapeutic strategy in inflammation[J].Biochem Soci Transa，1996,24：225～229..klw*, 百拇医药
[4]MCCONVlLLE MJ，FERGUSON MA.The struc-ture，biosynthesis and function of glycosylated phos-phatidylinositols in the parasitic protozoa and higher eukayote[J].Biochem J，1993，294：305～324..klw*, 百拇医药
[5]白 云，朱锡华.微量反应性溶血测定法IJ].免疫学杂志，1994，10(2)：127～128..klw*, 百拇医药
收稿日期：1999-10-06.klw*, 百拇医药
修稿日期：1999-10-03(周镜然 白 云 姜 曼 黎万玲)
单位：第三军医大学免疫学教研室，重庆 400038%3;&}9\, 百拇医药
关键词：CD59；融合蛋白；表达%3;&}9\, 百拇医药
免疫学杂志000205摘 要：目的探索GPI锚固蛋白的体外表达，获得具有生物学活性的可溶性游离CD59分子。方法 通过PCR选择性扩增编码成熟CD59氨基酸序列的基因片段，并将之克隆入PinPoint Xa—3质粒中。IPTG诱导融合蛋白表达，产物经亲和素树脂亲和层析。在体外微量反应性溶血抑制实验中检测重组CD59纯化样品的生物学活性。结果 筛选得到的重组子诱导后表达分子量约为22kD的生物素化CD59融合蛋白。亲和素树脂纯化得到高纯度的蛋白样品。纯化分子在反应性溶血实验中表现出溶血抑制活性。结论 本研究对体外表达无GPI—锚的可溶性游离CD59分子进行了表达探索，获得具一定生物学活性的游离重组CD59，为进一步研制应用型CD59活性分子打下基础。%3;&}9\, 百拇医药
分类号：CD59 文献标识码：A%3;&}9\, 百拇医药
文章编号：1000—8861(9900)02—0096—03%3;&}9\, 百拇医药
Recombination and expression of soluble human CD59 in E. Coli%3;&}9\, 百拇医药
ZHOU Jing-ran,BAI Yun,JIANG Man,LI Wan-ling%3;&}9\, 百拇医药
(Department of Immunology, the Third Military Medical University, Chongqing 400038,China)%3;&}9\, 百拇医药
Abstract：Objective To obtain soluble recombinant human CD59 with high activity. Methods The gene sequence which codes natural CD59 extracellular portion containing 77 amino acids was amplified with PCR. The fragment was cloned into prokaryotic expression vector PinPoint Xa-3. The recombinant protein expression was induced by IPTG and biotinylated products were purified by avidin resin. The activity of purified recombinant CD59 was evaluated by reactive assay in vitro. Resuits In PinPoint Xa-3 expression system, we obtained recombinant CD59 with a molecular wright of 22kDa. The thin layer gel scanning analysis showed that about 7% of total cell protein is newly expressed fusion protein. SDS-PAGE assay showed that the product affinity-purified by avidin resin has high purity. The reactive assay revealed that the purified protein had the activity of inhibiting hemolysis. Conclusion The fusion protein has the activity of natural CD59 to some extent.
Keywords：recombinant CD59;fusion protein; expression CD59分子是人体内重要的同源限制因子,能与C8α亚基和C9b分段特异性地结合，阻止MAC在膜上的进一步组装,而保护组织细胞免受自身补体的溶破。外源性补给CD59功能活性分子，阻止MAC在膜上的沉积并保护体内细胞免遭溶破，是控制MAC病理效应的良好途径，在某些溶血性疾病、移植排斥反应等的控制中有良好的应用前景。然而,天然CD59为GPI-锚固蛋白，其GPI-结构对它在膜上行使功能非常有利。它能使CD59在膜上定位，并易于靠近它的亲脂性作用位点，从而高效发挥其生物学功能。然欲通过基因工程、蛋白纯化的手段获得大量GPI-锚固蛋白却极其困难，目前尚无简单有效、经济可行的技术路线来实现。表达无GPI-锚的、分泌型目的蛋白，使其在溶相中发挥功能，是开发CD59这类GPI-锚固蛋白应用的可能途径。本研究中我们用PCR的方法选择性扩增编码成熟CD59分子氨基酸序列的基因片段，并将之重组入融合蛋白表达载体PinPointXa-3，在原核表达系统中获得了有功能的重组CD59融合蛋白样品。\gv, 百拇医药
1材料与方法\gv, 百拇医药
1.1实验材料JM109菌株由本室保存,PinPiontXa-3质粒购自Promega公司。CD59cDNA由本室白云博士制备。限制性内切酶、T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、PinpointXa蛋白纯化系统试剂盒分别购自华美、BoehringerMannhern、Promega公司。\gv, 百拇医药
1.2引物设计合成根据已知的CD59cDNA序列，设计了一对引物跨越成熟蛋白编码区，而不包括cDNA5'端的信号肽区和3'端的接锚信号肽编码区。上游引物5'-CCCAAGCTTCTGCAGTGCTACAACTGTCC包含起始密码子ATG，外设HindⅢ酶切位点；下游引物5'-CGCGGATCCTCATTAATTTTCAAGCTGTTCG包含两个串联的终止密码子TAA和TGA，后者为原核细胞偏性密码子，外发BamHⅠ位点。\gv, 百拇医药
1.3PCR循环条件以完整CD59cDNA链为模板进行聚合酶链式反应。循环条件为：94℃40s，46℃40s，72℃45s，共进行15个循环，最后一个循环72℃延伸5min。\gv, 百拇医药
1.4CD59重组质粒的构建质粒的提取、载体和目的基因片段的酶切、回收、连接、转化及阳性克隆的筛选鉴定均参照《分子克隆》方法进行。DNA序列分析在ABⅠ373A型DNA自动测序仪上进行。
1.5CD59融合蛋白的诱导表达将阳性克隆接种于含氨苄青霉素和2μmol/L生物素的LB培养基中，活化、扩增至OD600值达0.4～0.5左右时,加入IPTG至终浓度100μmol/L，37℃诱导4～5h。uy4\+%, http://www.100md.com
1.6CD59融合蛋白的纯化离心收集诱导后表达菌体，洗涤后于冰浴十超声破菌，离心收集上清。上清中即含可溶性菌体蛋白。以极慢的速度向亲和素树脂柱加入样品，用缓冲液反复淋洗亲和柱，再用含5mmol/L生物素的洗脱液洗脱目的蛋白。透析、浓缩后对重组CD59融合蛋白进行生物学活性测定。uy4\+%, http://www.100md.com
1.7CD59的生物学活性测定参照文献方法[5]进行微量反应性溶血抑制试验，2结果uy4\+%, http://www.100md.com
2.1PCR扩增目的片段以CD59cDNA为模板进行PCR扩增，产物进行琼脂糖凝胶电泳，可见一约240bp的特异扩增带，片段大小与理论预期—致(见图1)。uy4\+%, http://www.100md.com
图1CD59片段PCR扩增产物电泳分析uy4\+%, http://www.100md.com
Fig1ElectrophoresiesanalysisofPCRproductionuy4\+%, http://www.100md.com
1:DNAmarkersuy4\+%, http://www.100md.com
2:PCRproductionuy4\+%, http://www.100md.com
3:CD59cDNAfragmentuy4\+%, http://www.100md.com
2.2表达载体的构建及诱导表达Hind/ⅢBamHⅠ双酶切质粒PinPointXa—3CD59目的基因片段，连接后转化JMl09,进行质粒酶切分析,筛选出含目的片段的阳性克隆菌株(见图2)。DNA测序结果与预期一致。uy4\+%, http://www.100md.com
图2重组质粒PinPointCD59的限制性内切酶酶切鉴定uy4\+%, http://www.100md.com
Fig2ElectrophoresisanalysisorenzymaticdigestionofCD59recombinantplasmiduy4\+%, http://www.100md.com
1:λDNA/HindⅢmarkeruy4\+%, http://www.100md.com
2,3：recombinantplasmiddigestedbvHindⅢ/BamHⅠ
经IPTG诱导的阳性克隆菌体用15%的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS—PAGE电泳分析，结果显示在分子量约22kD处出现一新蛋白带，与理论预计的CD59融合蛋白分子量相吻合(见图3)。薄层扫描分析显示其占菌体总蛋白的7%左右。/ip, http://www.100md.com
2.3重组蛋白的纯化利用亲和素树脂柱对生物素化的融合蛋白进行纯化，用含5mmol/L生物素的缓冲液将之竞争洗脱。洗脱液经SDS—PAGE鉴定可见(见图4)，样品中主要是分子量为22kD的纯化CD59融合蛋白。/ip, http://www.100md.com
2.4CD59融合蛋白的功能鉴定纯化样品加入反应性溶血体系后，显示出溶血抑制活性，最高达到39%，说明融合蛋白具有一定的天然CD59分子功能活性。溶血抑制曲线见图5。/ip, http://www.100md.com
3讨论/ip, http://www.100md.com
本研究对CD59这一GPI—锚固分子在原核表达系统中的表达进行了探索，获得的可溶性游离分子在体外实验中证实具有天然分子功能，研究中选择的原核表达系统PinPiontXa为—带有tac启动子的融合蛋白表达载体,能表达带有126个氨基酸末端标记序列的融合蛋白,其中一赖氨酸残基可被大肠杆菌的生物素连接酶识别后生物素化。因此利用/ip, http://www.100md.com
图3PinPoint-CD59菌表达产物SDS—PAGE电泳分析/ip, http://www.100md.com
Fig3AnalysisoftheexpressionofrecombinantCD59fu-sionproteininE.ColibySDSPAGE/ip, http://www.100md.com
1：molecularweightmarker/ip, http://www.100md.com
2：DH5α/PinPoint—CD59.InducedbyIPTGf0r4h/ip, http://www.100md.com
3：DH5α,inducedbyIPTGfor4h/ip, http://www.100md.com
图4CD59融合蛋白生物素亲和素柱层析洗脱样品SDS—PAGE鉴定/ip, http://www.100md.com
Fig4AnalysisofpurifiedCD59fusionproteinbySDS—PAGE/ip, http://www.100md.com
1：molecularWeightmarker
2：recombinantCD59fusionproteinnpurificdbyavidinTesin.klw*, 百拇医药
图5纯化蛋白样品反应性溶血抑制曲线.klw*, 百拇医药
Fig5TheinhibitionofreactivelysisbypurifiedCD59fu—sionprotein.klw*, 百拇医药
亲和素柱可简便、高效地对融合蛋白进行纯化。不足的是其表达效率不高，本研究中只获得对目的蛋白70%的表达。但产物以可溶性形式存在于细胞浆中，可能对其分子折叠、构象形成和生物学活性有帮助。而产物为包涵体形式的原核表达系统虽表达效率更高，但产物生物学活性差、生性复性过程困难等弊端仍限制其应用。.klw*, 百拇医药
本研究中我们利用PCR技术，选择性扩增编码成熟CD59分子氨基酸厂了列的cDNA片段，而舍去5'端的信号肽和3'端的接锚信号肽序列。这样在原核表达系统所表达的重组CD59分子具有与天然分子相同的氨基酸序列，从而为产物的生物学活性提供了保障。由于研究中PCR所用模板是已自行克隆的CD59cDNA序列，可方便地大量获得。因此，我们在进行PCR循环中，加大模板用量(每反应lμg左右)的同时减少反应的循环次数，以期减小扩增产物的错配率。结果所获得产物中无碱基突变发生。.klw*, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770163).klw*, 百拇医药
作者简介：周镜然(1972)，女.四川威远人，博士生，主要从事补体分子生物学的研究。.klw*, 百拇医药
参考文献：.klw*, 百拇医药
[1]白 云.CD59抗原研究进展.见：朱锡华，主编.免疫学进展(第一集)[M].成都：四川科学技术出版社.1995.86～115..klw*, 百拇医药
[2]NINOMIYA H.SIMS PJ.The human complement regulatory protein CD59 binds to the α—chain of C8 and to the“b”domain of C9[J].J Biol Chem. 1992，267：13675～13680..klw*, 百拇医药
[3]MORGAN BP.Intervention in the complement sys-tem：a therapeutic strategy in inflammation[J].Biochem Soci Transa，1996,24：225～229..klw*, 百拇医药
[4]MCCONVlLLE MJ，FERGUSON MA.The struc-ture，biosynthesis and function of glycosylated phos-phatidylinositols in the parasitic protozoa and higher eukayote[J].Biochem J，1993，294：305～324..klw*, 百拇医药
[5]白 云，朱锡华.微量反应性溶血测定法IJ].免疫学杂志，1994，10(2)：127～128..klw*, 百拇医药
收稿日期：1999-10-06.klw*, 百拇医药
修稿日期：1999-10-03(周镜然 白 云 姜 曼 黎万玲)