人 CD20胞外区基因在原核系统中的表达
作者：洪海燕 舒翠玲 郭燕翔 王建安 沈倍奋:, http://www.100md.com
单位：洪海燕(北京基础医学研究所，北京 100850)；舒翠玲(北京基础医学研究所，北京 100850)；郭燕翔(北京基础医学研究所，北京 100850)；王建安(北京基础医学研究所，北京 100850)；沈倍奋(北京基础医学研究所，北京 100850):, http://www.100md.com
关键词：人CD20分子；原核表达；蛋白纯化:, http://www.100md.com
免疫学杂志000303 [摘 要]目的 将CD20胞外区基因在大肠杆菌中表达，并研究表达产物作为抗原筛选抗体的可能性。方法 设计引物从pUC19/CD20质粒上钓取CD20胞外区基因，克隆到pExSec Ⅰ载体上，在大肠杆菌中融合表达。结果 表达产物的相对分子质量(Mr)约为26000，Western-blot鉴定能够为抗CD20分子的mAb所识别。利用初步纯化的CD20胞外区融合蛋白为抗原，建立了检测CD20mAb的ELISA方法。结论 为研制CD20分子的mAb奠定了基础。:, http://www.100md.com
[中图分类号]R329.25；R589.2 [文献标识码]A:, http://www.100md.com
[文章编号]1000-8861(2000)03-0172-03:, http://www.100md.com
Cloning and fusion expression of human CD20 in Escherichia coli:, http://www.100md.com
HONG Hai-yan，SHU Cui-ling，GUO Yan-xiang，WANG Jian-an，SHEN Bei-fen:, http://www.100md.com
(Beijing Basic Medical Institute，Beijing 100850，China):, http://www.100md.com
[Abstract] Objective To get the antigen of CD20.Methods We cloned the extracellar region gene of CD20 from plasmid pUC19/CD20，and expressed it as inclusion bodies in pExSec I proyoatic system.Results Westernblot showed that the expressed protein could specifically bind to the mAb of the CD20，and it weighted about 26kd.The purified products could be used as an antigen to screen the mAb of CD20.Conclusion This experiment lay a foundation of preparation for the mAb against human CD20.
[Key words]human CD20； E.coli expression； protein purification9m11-v2, 百拇医药
CD20是B细胞表面特有的抗原结构，是一种跨膜的非糖基化蛋白，由胞外区、跨膜区和胞内区三部分组成，胞外区基因长132bp，编码44个氨基酸。CD20通过参与组成Ca2+离子通道对B细胞的分化和成熟进行调控，同时它还通过细胞内的酪氨酸激酶信号转导途径对细胞周期进行调控。研究发现CD20的过度表达与细胞癌变有关，已证明，CD20分子在B细胞淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤等疾病中的表达量异常增高。同样是B细胞表面标志，CD20分子比CD19分子更具特异性，以CD20抗体富集恶性肿瘤病人外周血中的癌细胞，进行外周血干细胞移植是一条行而有效的治疗方法。尽管CD20分子的信号转导途径和确切的作用机制还不清楚，该分子的mAb已在国外被应用到临床上对上述疾病进行诊断和治疗，而国内有关CD20分子的研究才刚刚开始。研制抗CD20分子的mAb，对于B细胞相关的白血病的诊断和治疗有重要的指导意义和使用价值。9m11-v2, 百拇医药
1 材料与方法9m11-v2, 百拇医药
1.1 材料 pUC19/CD20质粒带有CD20部分基因；pExSecI载体含有T7启动子及卡那霉素抗性基因，由本室保存。菌种DH5α，JM109及BL-21(DE-3)为本室保存；Taq酶、T4酶及其他工具酶，均为GIBCO公司产品。9m11-v2, 百拇医药
1.2 引物设计与合成 引物以人CD20分子胞外区基因为模板，利用Goldkey软件辅助设计，由本室在ABI公司的391A型DNA自动合成仪上合成。9m11-v2, 百拇医药
1.3 CD20胞外区基因克隆 突变及酶切位点和保护碱基的引入，使引物与原序列的同源性减小。PCR扩增采用二步扩增的办法，先进行低严谨性扩增(30°C退火2min，5个循环)，再进行高严谨性扩增(50°C退火1min，25个循环)。回收PCR产物，按图1方案构建pExSec I/CD20重组质粒，酶切筛选重组质粒。
9m11-v2, 百拇医药
SZZ：signal and ZZ sepuence of protein A9m11-v2, 百拇医药
图1pExSecI/CD20质粒构建
Fig 1Schematic construction of pExSec I/CD20@}^-g2], 百拇医药
1.4 序列分析 在PE公司310型DNA自动测序仪上完成。@}^-g2], 百拇医药
1.5 诱导表达 重组质粒转化BL-21(DE-3)感受态细菌，涂Kana(卡那霉素50μg/ml)固体LB平板，从平板上挑取单个菌落接种于5ml含Kana的LB液体培养基中，37°C振荡培养12h左右，10%接种于含Kana的LB液体培养基中，37°C恒温摇床中振荡培养1.5h，OD600nm约为0.6～0.8，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG，37°C诱导6h。@}^-g2], 百拇医药
1.6 表达产物鉴定 参照《分子克隆》作SDS-PAGE及用标准的CD20mAb作Western-blot鉴定。@}^-g2], 百拇医药
1.7 包涵体的初步纯化 空质粒和重组质粒分别转化BL-21细菌，小量发酵，回收菌体，用pH8.0含50mmol/L Tris-Cl、0.1mol/L NaCl的洗液洗一遍，超声破碎，10 000r/min离心10min，回收包涵体。1mol/L尿素、1.5mol/L尿素分别洗一遍，10 000r/min离心10min，沉淀于8mol/L尿素中室温溶解5h，5 000r/min离心10min，取上清于0.1xPBS、0.5mmol/L EDTA中4°C透析24h，分装后于4°C保存。@}^-g2], 百拇医药
2 结果@}^-g2], 百拇医药
2.1 引物设计 为适应原核表达的需要，将上游引物进行碱基突变，将原核中的稀有密码子变为常见密码子。上、下游引物分别引入EcoRI和BamHI酶切位点及相应的保护碱基。计算机模拟检索引物自身无发卡结构，且引物之间不形成二聚体。扩增长度应为147bp。@}^-g2], 百拇医药
上游引物：@}^-g2], 百拇医药
5′CGG↑AATTCAAAAATCTCTCACTTCCTGAAAATGGA3′@}^-g2], 百拇医药
EcoRI 起始密码子@}^-g2], 百拇医药
引物全长35bp，GC含量为53.33%，与全长基因的508～542位互补。@}^-g2], 百拇医药
下游引物：
5′CGCG↑GATCCTAAGTAGGTAGATGGGGA3′!1, 百拇医药
BamHI 终止密码子!1, 百拇医药
引物全长30bp，GC含量为31.43%，与全长基因的622～651位互补。!1, 百拇医药
2.2 人CD20胞外区基因扩增 PCR扩增30个循环，可以得到约150bp的清晰条带(见图2)。按图1方案进行基因克隆，连接液转化感受态细菌DH5a，扩增细菌，小量提取质粒，用EcoRI和BamHI酶切，可切下约150bp的片段，与预期大小相同，说明PCR产物按我们设计的酶切位点插入pExSec I载体。
!1, 百拇医药
图2PCR产物的琼脂糖电泳!1, 百拇医药
Fig 2Identification of PCR products!1, 百拇医药
1：pBR322/BstNI；2：pUC19/CD20；3，4，5：PCR products!1, 百拇医药
2.3 人CD20胞外区基因的序列测定 在PE公司310型DNA自动测序仪上完成。测序结果与GenBank中人CD20全长基因相比较，第564位碱基发生突变(A→G)，尽管编码第57位氨基酸的基因由AGA变为AGG，但二者都是编码精氨酸的密码子。!1, 百拇医药
2.4 诱导表达 SDS-PAGE结果显示，与pExSec I空质粒转化菌比较，pExSec I/CD20质粒转化菌在Mr为26000处出现一条蛋白表达条带，与推算值相符。!1, 百拇医药
2.5 包涵体纯化 初步纯化的包涵体，纯度约为50%(见图3)。按公式“蛋白浓度(mg/ml)＝OD280/1.65”计算初步纯化的非重组蛋白(BP)和重组蛋白(BPCD20)的浓度分别为0.521mg/ml和0.853mg/ml。
!1, 百拇医药
图3包涵体纯化!1, 百拇医药
Fig 3Purification of CD20 inclusion
M：MW standards of protein； 1：Induced pExSecI； 2：Induced pExSec I/CD20； 3.4：purified inclusion)/6v, 百拇医药
2.6 Western-blot鉴定 以pExSec I空质粒转化菌作为阴性对照，重组质粒转化菌在Mr为26000处出现阳性条带(见图4)。
)/6v, 百拇医药
图4 Western-blot结果)/6v, 百拇医药
Fig 4Results of Western-blot)/6v, 百拇医药
1.3：induced pExSec I/CD20；M：MW standards of protein)/6v, 百拇医药
2.7 建立ELISA方法 非重组蛋白(BP)和重组蛋白(BPCD20)的浓度分别为0.521mg/ml和0.853mg/ml。将BPCD20稀释1.65倍之后，再将二者同时进行梯度稀释包被酶联板，用含5%脱脂奶粉和2%兔血清的PBST封闭，同时用含2%兔血清的PBST洗板，标准的CD20mAb做1∶200稀释作为一抗，以辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠Ig(HRP-RAM)为二抗，OPD系统显色。结果如表1。)/6v, 百拇医药
表 1 不同包被浓度下BP和BPCD20与CD20抗体结合的比较)/6v, 百拇医药
Tab 1 Comparison of BP and BPCD20 binding to CD20 antibody in various concentration Concentration of protein(μg/ml))/6v, 百拇医药
Optimal density(490nm))/6v, 百拇医药
BP)/6v, 百拇医药
BPCD20)/6v, 百拇医药
10)/6v, 百拇医药
1.11±0.03)/6v, 百拇医药
1.40±0.02
5.2/n^2q|^, 百拇医药
0.75±0.07/n^2q|^, 百拇医药
1.14±0.07/n^2q|^, 百拇医药
1.3/n^2q|^, 百拇医药
0.19±0.04/n^2q|^, 百拇医药
0.47±0.00/n^2q|^, 百拇医药
0.65/n^2q|^, 百拇医药
0/n^2q|^, 百拇医药
0.16±0.01/n^2q|^, 百拇医药
0.52/n^2q|^, 百拇医药
0/n^2q|^, 百拇医药
0.01±0.00/n^2q|^, 百拇医药
表中可见随着包被的蛋白浓度逐渐降低，特异性逐渐升高，因此可以选择蛋白浓度为0.65～1.3μg/ml包被酶联板。/n^2q|^, 百拇医药
3 讨论/n^2q|^, 百拇医药
人CD20分子为膜结合型蛋白，分为胞外段、跨膜区和胞内区三部分。目前，已报道的抗CD的20mAb都识别胞外段的同一位点，因此我们选择了该分子的胞外段进行表达，以期用此筛选能分泌CD20mAb的杂交瘤细胞株。/n^2q|^, 百拇医药
为适应原核表达的需要，我们将上游引物5′端进行了碱基突变，将原核中的稀有密码子突变为常见密码子，但突变及酶切位点的引入，使上游引物与原基因序列同源性变小，给PCR扩增造成困难。为此，我们采用二步扩增的办法，即先进行低严谨性扩增(30°C退火2min，5个循环)，再进行高严谨性扩增(50°C退火1min，25个循环)。这样，既保证引物能充分与模板结合，又保证扩增的特异性。/n^2q|^, 百拇医药
尽管第564位碱基发生突变(A→G)即编码第57位氨基酸的基因由AGA变为AGG，但是二者都是编码精氨酸的密码子，后者更适于原核表达的需要。/n^2q|^, 百拇医药
pExSecI质粒含有T7强启动子，适合在C-端融合短肽进行表达，且表达效率较其他载体高，因而，我们选用其来融合表达CD20胞外区基因，但该载体本身表达的蛋白为金葡球菌A蛋白(protein-A)，而protein-A与各种Ig均有一定的结合能力。我们选有兔血清封闭，并在洗涤液中加入了兔血清，利用兔血清封闭protein-A，把protein-A与辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠Ig(HRP-RAM)结合的可能性降低到最小。通过优化包被、封闭、洗涤3个方面的条件，我们建立了筛选抗CD20 mAb的ELISA方法，为研制CD20分子的mAb奠定了基础。
[基金项目]国家“863”生物技术抗体工程资助项目(863-102-09-01-03)hf, http://www.100md.com
[作者简介]洪海燕(1974-)，女，黑龙江哈尔滨市人，博士，主要从事微生物与免疫学研究，现在第二军医大学微生物教研室，上海 200054。hf, http://www.100md.com
[参考文献]hf, http://www.100md.com
[1]STAMENKVOIC I，SEED B.Analysis of two cDNA clones encoding the B lymphocyte antigen CD20 (B1，BP35)，a type Ⅲ integral membrane protein[J].J Exp Med，1988，167：1975～1980.hf, http://www.100md.com
[2]TEDDER T，STREULI M，STUAR F，et al.Isolation and structure of a cDNA encoding the B1 CD20 cell-surface antigen of human B lymphocyte[J].Proc Natl Acd Sic USA，1988，85：208～212.hf, http://www.100md.com
[3]孙志贤，汲言山，沈倍奋，等.现代生物化学理论与研究技术[M].北京：军事医学出版社，1995.391～413.hf, http://www.100md.com
[4]J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇.分子克隆实验指南[M].金冬雁译.第2版.北京：科学出版社，1992.830～893.hf, http://www.100md.com
[5]CLANDI BN，FRANK M，KLAUS H.Expression of the pheromone 3-encoding gene of euplotes octocarinatus using a novel bacterial secretion vector[J].Gene，1994，150：187～192.hf, http://www.100md.com
[6]TEDDER TF，ENGEL P.CD20：a regulator of cell-cycle progression of B lymphocytes[J].Immunol Today，1994，15(9)：450～454.hf, http://www.100md.com
[收稿日期] 1999-09-24；[修回日期]2000-01-13(洪海燕 舒翠玲 郭燕翔 王建安 沈倍奋)
单位：洪海燕(北京基础医学研究所，北京 100850)；舒翠玲(北京基础医学研究所，北京 100850)；郭燕翔(北京基础医学研究所，北京 100850)；王建安(北京基础医学研究所，北京 100850)；沈倍奋(北京基础医学研究所，北京 100850):, http://www.100md.com
关键词：人CD20分子；原核表达；蛋白纯化:, http://www.100md.com
免疫学杂志000303 [摘 要]目的 将CD20胞外区基因在大肠杆菌中表达，并研究表达产物作为抗原筛选抗体的可能性。方法 设计引物从pUC19/CD20质粒上钓取CD20胞外区基因，克隆到pExSec Ⅰ载体上，在大肠杆菌中融合表达。结果 表达产物的相对分子质量(Mr)约为26000，Western-blot鉴定能够为抗CD20分子的mAb所识别。利用初步纯化的CD20胞外区融合蛋白为抗原，建立了检测CD20mAb的ELISA方法。结论 为研制CD20分子的mAb奠定了基础。:, http://www.100md.com
[中图分类号]R329.25；R589.2 [文献标识码]A:, http://www.100md.com
[文章编号]1000-8861(2000)03-0172-03:, http://www.100md.com
Cloning and fusion expression of human CD20 in Escherichia coli:, http://www.100md.com
HONG Hai-yan，SHU Cui-ling，GUO Yan-xiang，WANG Jian-an，SHEN Bei-fen:, http://www.100md.com
(Beijing Basic Medical Institute，Beijing 100850，China):, http://www.100md.com
[Abstract] Objective To get the antigen of CD20.Methods We cloned the extracellar region gene of CD20 from plasmid pUC19/CD20，and expressed it as inclusion bodies in pExSec I proyoatic system.Results Westernblot showed that the expressed protein could specifically bind to the mAb of the CD20，and it weighted about 26kd.The purified products could be used as an antigen to screen the mAb of CD20.Conclusion This experiment lay a foundation of preparation for the mAb against human CD20.
[Key words]human CD20； E.coli expression； protein purification9m11-v2, 百拇医药
CD20是B细胞表面特有的抗原结构，是一种跨膜的非糖基化蛋白，由胞外区、跨膜区和胞内区三部分组成，胞外区基因长132bp，编码44个氨基酸。CD20通过参与组成Ca2+离子通道对B细胞的分化和成熟进行调控，同时它还通过细胞内的酪氨酸激酶信号转导途径对细胞周期进行调控。研究发现CD20的过度表达与细胞癌变有关，已证明，CD20分子在B细胞淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤等疾病中的表达量异常增高。同样是B细胞表面标志，CD20分子比CD19分子更具特异性，以CD20抗体富集恶性肿瘤病人外周血中的癌细胞，进行外周血干细胞移植是一条行而有效的治疗方法。尽管CD20分子的信号转导途径和确切的作用机制还不清楚，该分子的mAb已在国外被应用到临床上对上述疾病进行诊断和治疗，而国内有关CD20分子的研究才刚刚开始。研制抗CD20分子的mAb，对于B细胞相关的白血病的诊断和治疗有重要的指导意义和使用价值。9m11-v2, 百拇医药
1 材料与方法9m11-v2, 百拇医药
1.1 材料 pUC19/CD20质粒带有CD20部分基因；pExSecI载体含有T7启动子及卡那霉素抗性基因，由本室保存。菌种DH5α，JM109及BL-21(DE-3)为本室保存；Taq酶、T4酶及其他工具酶，均为GIBCO公司产品。9m11-v2, 百拇医药
1.2 引物设计与合成 引物以人CD20分子胞外区基因为模板，利用Goldkey软件辅助设计，由本室在ABI公司的391A型DNA自动合成仪上合成。9m11-v2, 百拇医药
1.3 CD20胞外区基因克隆 突变及酶切位点和保护碱基的引入，使引物与原序列的同源性减小。PCR扩增采用二步扩增的办法，先进行低严谨性扩增(30°C退火2min，5个循环)，再进行高严谨性扩增(50°C退火1min，25个循环)。回收PCR产物，按图1方案构建pExSec I/CD20重组质粒，酶切筛选重组质粒。
9m11-v2, 百拇医药SZZ：signal and ZZ sepuence of protein A9m11-v2, 百拇医药
图1pExSecI/CD20质粒构建
Fig 1Schematic construction of pExSec I/CD20@}^-g2], 百拇医药
1.4 序列分析 在PE公司310型DNA自动测序仪上完成。@}^-g2], 百拇医药
1.5 诱导表达 重组质粒转化BL-21(DE-3)感受态细菌，涂Kana(卡那霉素50μg/ml)固体LB平板，从平板上挑取单个菌落接种于5ml含Kana的LB液体培养基中，37°C振荡培养12h左右，10%接种于含Kana的LB液体培养基中，37°C恒温摇床中振荡培养1.5h，OD600nm约为0.6～0.8，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG，37°C诱导6h。@}^-g2], 百拇医药
1.6 表达产物鉴定 参照《分子克隆》作SDS-PAGE及用标准的CD20mAb作Western-blot鉴定。@}^-g2], 百拇医药
1.7 包涵体的初步纯化 空质粒和重组质粒分别转化BL-21细菌，小量发酵，回收菌体，用pH8.0含50mmol/L Tris-Cl、0.1mol/L NaCl的洗液洗一遍，超声破碎，10 000r/min离心10min，回收包涵体。1mol/L尿素、1.5mol/L尿素分别洗一遍，10 000r/min离心10min，沉淀于8mol/L尿素中室温溶解5h，5 000r/min离心10min，取上清于0.1xPBS、0.5mmol/L EDTA中4°C透析24h，分装后于4°C保存。@}^-g2], 百拇医药
2 结果@}^-g2], 百拇医药
2.1 引物设计 为适应原核表达的需要，将上游引物进行碱基突变，将原核中的稀有密码子变为常见密码子。上、下游引物分别引入EcoRI和BamHI酶切位点及相应的保护碱基。计算机模拟检索引物自身无发卡结构，且引物之间不形成二聚体。扩增长度应为147bp。@}^-g2], 百拇医药
上游引物：@}^-g2], 百拇医药
5′CGG↑AATTCAAAAATCTCTCACTTCCTGAAAATGGA3′@}^-g2], 百拇医药
EcoRI 起始密码子@}^-g2], 百拇医药
引物全长35bp，GC含量为53.33%，与全长基因的508～542位互补。@}^-g2], 百拇医药
下游引物：
5′CGCG↑GATCCTAAGTAGGTAGATGGGGA3′!1, 百拇医药
BamHI 终止密码子!1, 百拇医药
引物全长30bp，GC含量为31.43%，与全长基因的622～651位互补。!1, 百拇医药
2.2 人CD20胞外区基因扩增 PCR扩增30个循环，可以得到约150bp的清晰条带(见图2)。按图1方案进行基因克隆，连接液转化感受态细菌DH5a，扩增细菌，小量提取质粒，用EcoRI和BamHI酶切，可切下约150bp的片段，与预期大小相同，说明PCR产物按我们设计的酶切位点插入pExSec I载体。
!1, 百拇医药图2PCR产物的琼脂糖电泳!1, 百拇医药
Fig 2Identification of PCR products!1, 百拇医药
1：pBR322/BstNI；2：pUC19/CD20；3，4，5：PCR products!1, 百拇医药
2.3 人CD20胞外区基因的序列测定 在PE公司310型DNA自动测序仪上完成。测序结果与GenBank中人CD20全长基因相比较，第564位碱基发生突变(A→G)，尽管编码第57位氨基酸的基因由AGA变为AGG，但二者都是编码精氨酸的密码子。!1, 百拇医药
2.4 诱导表达 SDS-PAGE结果显示，与pExSec I空质粒转化菌比较，pExSec I/CD20质粒转化菌在Mr为26000处出现一条蛋白表达条带，与推算值相符。!1, 百拇医药
2.5 包涵体纯化 初步纯化的包涵体，纯度约为50%(见图3)。按公式“蛋白浓度(mg/ml)＝OD280/1.65”计算初步纯化的非重组蛋白(BP)和重组蛋白(BPCD20)的浓度分别为0.521mg/ml和0.853mg/ml。
!1, 百拇医药图3包涵体纯化!1, 百拇医药
Fig 3Purification of CD20 inclusion
M：MW standards of protein； 1：Induced pExSecI； 2：Induced pExSec I/CD20； 3.4：purified inclusion)/6v, 百拇医药
2.6 Western-blot鉴定 以pExSec I空质粒转化菌作为阴性对照，重组质粒转化菌在Mr为26000处出现阳性条带(见图4)。
)/6v, 百拇医药图4 Western-blot结果)/6v, 百拇医药
Fig 4Results of Western-blot)/6v, 百拇医药
1.3：induced pExSec I/CD20；M：MW standards of protein)/6v, 百拇医药
2.7 建立ELISA方法 非重组蛋白(BP)和重组蛋白(BPCD20)的浓度分别为0.521mg/ml和0.853mg/ml。将BPCD20稀释1.65倍之后，再将二者同时进行梯度稀释包被酶联板，用含5%脱脂奶粉和2%兔血清的PBST封闭，同时用含2%兔血清的PBST洗板，标准的CD20mAb做1∶200稀释作为一抗，以辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠Ig(HRP-RAM)为二抗，OPD系统显色。结果如表1。)/6v, 百拇医药
表 1 不同包被浓度下BP和BPCD20与CD20抗体结合的比较)/6v, 百拇医药
Tab 1 Comparison of BP and BPCD20 binding to CD20 antibody in various concentration Concentration of protein(μg/ml))/6v, 百拇医药
Optimal density(490nm))/6v, 百拇医药
BP)/6v, 百拇医药
BPCD20)/6v, 百拇医药
10)/6v, 百拇医药
1.11±0.03)/6v, 百拇医药
1.40±0.02
5.2/n^2q|^, 百拇医药
0.75±0.07/n^2q|^, 百拇医药
1.14±0.07/n^2q|^, 百拇医药
1.3/n^2q|^, 百拇医药
0.19±0.04/n^2q|^, 百拇医药
0.47±0.00/n^2q|^, 百拇医药
0.65/n^2q|^, 百拇医药
0/n^2q|^, 百拇医药
0.16±0.01/n^2q|^, 百拇医药
0.52/n^2q|^, 百拇医药
0/n^2q|^, 百拇医药
0.01±0.00/n^2q|^, 百拇医药
表中可见随着包被的蛋白浓度逐渐降低，特异性逐渐升高，因此可以选择蛋白浓度为0.65～1.3μg/ml包被酶联板。/n^2q|^, 百拇医药
3 讨论/n^2q|^, 百拇医药
人CD20分子为膜结合型蛋白，分为胞外段、跨膜区和胞内区三部分。目前，已报道的抗CD的20mAb都识别胞外段的同一位点，因此我们选择了该分子的胞外段进行表达，以期用此筛选能分泌CD20mAb的杂交瘤细胞株。/n^2q|^, 百拇医药
为适应原核表达的需要，我们将上游引物5′端进行了碱基突变，将原核中的稀有密码子突变为常见密码子，但突变及酶切位点的引入，使上游引物与原基因序列同源性变小，给PCR扩增造成困难。为此，我们采用二步扩增的办法，即先进行低严谨性扩增(30°C退火2min，5个循环)，再进行高严谨性扩增(50°C退火1min，25个循环)。这样，既保证引物能充分与模板结合，又保证扩增的特异性。/n^2q|^, 百拇医药
尽管第564位碱基发生突变(A→G)即编码第57位氨基酸的基因由AGA变为AGG，但是二者都是编码精氨酸的密码子，后者更适于原核表达的需要。/n^2q|^, 百拇医药
pExSecI质粒含有T7强启动子，适合在C-端融合短肽进行表达，且表达效率较其他载体高，因而，我们选用其来融合表达CD20胞外区基因，但该载体本身表达的蛋白为金葡球菌A蛋白(protein-A)，而protein-A与各种Ig均有一定的结合能力。我们选有兔血清封闭，并在洗涤液中加入了兔血清，利用兔血清封闭protein-A，把protein-A与辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠Ig(HRP-RAM)结合的可能性降低到最小。通过优化包被、封闭、洗涤3个方面的条件，我们建立了筛选抗CD20 mAb的ELISA方法，为研制CD20分子的mAb奠定了基础。
[基金项目]国家“863”生物技术抗体工程资助项目(863-102-09-01-03)hf, http://www.100md.com
[作者简介]洪海燕(1974-)，女，黑龙江哈尔滨市人，博士，主要从事微生物与免疫学研究，现在第二军医大学微生物教研室，上海 200054。hf, http://www.100md.com
[参考文献]hf, http://www.100md.com
[1]STAMENKVOIC I，SEED B.Analysis of two cDNA clones encoding the B lymphocyte antigen CD20 (B1，BP35)，a type Ⅲ integral membrane protein[J].J Exp Med，1988，167：1975～1980.hf, http://www.100md.com
[2]TEDDER T，STREULI M，STUAR F，et al.Isolation and structure of a cDNA encoding the B1 CD20 cell-surface antigen of human B lymphocyte[J].Proc Natl Acd Sic USA，1988，85：208～212.hf, http://www.100md.com
[3]孙志贤，汲言山，沈倍奋，等.现代生物化学理论与研究技术[M].北京：军事医学出版社，1995.391～413.hf, http://www.100md.com
[4]J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇.分子克隆实验指南[M].金冬雁译.第2版.北京：科学出版社，1992.830～893.hf, http://www.100md.com
[5]CLANDI BN，FRANK M，KLAUS H.Expression of the pheromone 3-encoding gene of euplotes octocarinatus using a novel bacterial secretion vector[J].Gene，1994，150：187～192.hf, http://www.100md.com
[6]TEDDER TF，ENGEL P.CD20：a regulator of cell-cycle progression of B lymphocytes[J].Immunol Today，1994，15(9)：450～454.hf, http://www.100md.com
[收稿日期] 1999-09-24；[修回日期]2000-01-13(洪海燕 舒翠玲 郭燕翔 王建安 沈倍奋)