噬菌体随机肽库的应用
作者：李华 朱锡华-9[|3g{, 百拇医药
单位：李华(全军免疫学研究所，第三军医大学免疫学教研室，重庆 400038)；朱锡华(全军免疫学研究所，第三军医大学免疫学教研室，重庆 400038)-9[|3g{, 百拇医药
关键词：肽库；噬菌体呈现-9[|3g{, 百拇医药
免疫学杂志000521-9[|3g{, 百拇医药
[摘 要] 生物大分子间的相互作用是一切生命现象的基础。近年来，噬菌体随机肽库已成为探索受体与配体之间相互作用结合位点、寻求高亲和力生物活性的配体分子、探测未知蛋白空间结构表位的有利工具，在蛋白分子相互识别的研究、新型疫苗的研制、以及药物的开发等领域具有广泛应用前景。本综述旨在介绍它在几个方面的重要应用。-9[|3g{, 百拇医药
[中图分类号] R371.3 [文献标识码] A-9[|3g{, 百拇医药
[文章编号]1000-8861(2000)05-0387-04-9[|3g{, 百拇医药
Application of the phage display random peptide library-9[|3g{, 百拇医药
生物大分子间的相互作用是一切生命现象的基础。机体内众多的生物学效应，包括免疫应答、信号传导、基因调控、细胞凋亡等，都是通过生物大分子之间或亚基之间的相互作用而实现的，因而生物大分子结构与功能的研究一直是分子生物学研究的中心。分子特定的功能依赖于它所具有的特定结构。为深入全面地了解蛋白分子的功能，必须了解蛋白质的结构，特别是蛋白分子某种功能所对应的特定空间结构，这对于研究和分析生物大分子相互作用的机理以及分子结构与功能之间的关系，进而在分子水平上认识生物体系至关重要。研究分子间相互作用的方法有许多，其中，噬菌体随机肽库是近年来新兴的一个探索受体与配体之间相互作用结合位点、寻求高亲和力生物活性的配体分子、探测未知蛋白空间结构表位的有利工具，在蛋白分子相互识别的研究、新型疫苗的研制、以及药物的开发等领域具有广泛应用前景。-9[|3g{, 百拇医药
1 噬菌体随机肽库-9[|3g{, 百拇医药
噬菌体随机肽库是由上亿种与噬菌体外壳蛋白以融合的形式呈现在噬菌体表面的多肽所组成，库中上亿种多肽分别呈现在上亿个噬菌体表面，众多重组型噬菌体便组成了噬菌体随机肽库。随机肽库所用的噬菌体为丝状噬菌体fl、fd和M13。与其它噬菌体不同，丝状噬菌体并不裂解宿主菌，而是以分泌形式扩增，每个感染细胞内每代可产生上百个病毒颗粒，因此，获得的噬菌体滴度很高，约1010～1012 pfu/ml，足以满足库容的需要。扩增时，病毒基因从细胞膜上溢出时被外壳蛋白包被。噬菌体的外壳蛋白pVⅢ约2 700～3 000个拷贝，包绕病毒基因组螺旋对称排列，构成圆管型的噬菌体外壳。PⅢ外壳蛋白在噬菌体的最尾端，约3～5个拷贝，能与细菌F纤毛结合，是噬菌体感染大肠杆菌所必需。噬菌体随机肽库中，表达的多肽连接在外壳蛋白gpⅢ或gpⅧ的N端，呈现在噬菌体表面。由于特异的融合型多肽是通过对固相化靶分子的亲和力来筛选，因而可以在预先不知道多肽结构的情况下，对上亿种噬菌体组成的肽库进行高效筛选和富集。筛选出的噬菌体克隆通过再次感染细菌得到扩增，该克隆所呈现的多肽间接通过克隆噬菌体DNA测序获得。靶分子的每个结合部位均存在各自特定的结合模型(motif，基序)。从筛选出的噬菌体克隆这些多肽序列中可以反映出这种结合模型。将此基序与靶分子的天然配体结构进行比较，可以知道这些多肽模拟的是配体的哪一个空间结合部位。实际上，噬菌体肽库的融合型多肽与靶分子的结合是直接从三维结构上模拟了天然配体分子与靶分子结合的结合部位，从而给我们提供了分析生物大分子相互作用的有效信息。
2 蛋白分子结构分析{m@, 百拇医药
蛋白分子的结构与功能紧密相连。研究蛋白分子间的结合以往通常需要蛋白分子的空间结构为基础。然而蛋白分子的空间结构并不如一级结构那样容易获得，纯化蛋白分子单晶体获得的极大困难使得靠晶体衍射分析获取精确的分子空间结构数据受阻。并且，蛋白分子的构象是可变的，在生物体内液相环境中的构象并不一定与固相结构完全相同；用软件预测蛋白分子的空间结构也仅有50%～60%的准确性。通过对蛋白分子识别的衍射分析，发现两个分子相互作用所需的绝大部分结合能由少数几个关键残基的相互作用来提供，含有关键残基的短肽可以模拟蛋白分子折叠产生的表位与其受体发生结合。由于噬菌体呈现的多肽能够与靶分子结合，因而通过亲和筛选可以从噬菌体随机肽库中筛选与靶分子结合的多肽，即让多肽模拟天然配体的结合部位与靶分子结合，直接测知配体与受体的结合位点。利用化学合成交叠肽的方法研究蛋白分子存在一定的局限性：仅能获得连续性表位的信息。而噬菌体肽库的多肽不仅可以模拟蛋白分子连续性序列构成的结合部位而且可以模拟非连续性序列经过折叠而构成的结合部位，因而同时获得所有表位的信息，并且反应均在液相进行，接近生物体内的液相环境，可较好反映实际情况。{m@, 百拇医药
基于此原理，利用噬菌体肽库技术已经确定了许多蛋白分子的相互作用位点，包括组成的SH3与酪氨酸蛋白激酶的结合位点[1]、胞浆蛋白p47phox与细胞色素b558的结合位点[2]、甲病毒属E2糖蛋白的血细胞凝集素激活区域[3]、蛋白酶抑制剂巨球蛋白α2与细胞膜受体的结合位点[4]等。除此之外，噬菌体肽库技术在研究酶在激活过程中亚基间的装配方面也显示出独特的优势。DELEO等人利用随机肽库研究了中性粒细胞NADPH依赖的氧化酶激活过程中亚基间的装配。NADPH氧化酶是多亚基蛋白，由胞膜上的细胞色素b和p91-phox、p22-phox及p47-phox亚基组成，其中p47-phox只是在细胞激活过程中才从胞浆移动到胞膜并与之结合。将gp91-phox和gp22-phox的序列与用p47-phox筛选噬菌体肽库得到的序列进行比较，发现存在同源性区域，揭示了它们之间的结合位点。以这些序列合成的游离多肽在体外试验中发现可抑制NADPH氧化酶的装配[5]。{m@, 百拇医药
另外，在分析蛋白结构的突变对功能的影响时，噬菌体肽库技术体现了自身的优势。构建针对某一蛋白分子的突变型肽库，即在编码这个蛋白的cDNA基础上，将某一区段的序列换成随机序列，这样可同时对数百个、甚至数千个的突变体进行分析，并找到亲和力最大、活性最高的突变体，弥补了点突变一次只能通过一个突变体来分析部分氨基酸的改变对其功能影响的不足。
蛋白质与DNA的相互作用一直为人们所关注，由于方法学的限制，对该领域了解甚少。锌指结构是与DNA结合的小型蛋白质结构模块，存在于大量真核转录因子中，了解分子特异性识别的模型有助于设计针对某一特定的核苷酸序列的高亲和力锌指蛋白分子[6]。Zif268是从鼠转录因子中获得的具有3个指结构域的锌指蛋白。Zif268与DNA的晶体结构发现每个指结构域以每3个碱基的间隔插入DNA双螺旋的大沟槽中，蛋白与DNA的识别是通过锌指结构侧链上4个氨基酸对密码子的识别。ISALAN等通过构建含Zif268与DNA结合区域的部分随机噬菌体肽库进行分析，发现如果将锌指结构邻近的氨基酸随机化，则可以消除上述选择性结合，提示锌指结构临近氨基酸可能决定了与不同序列的DNA结合。用含有Zif268结合位点的密码子筛选肽库，获得了高亲和力锌指结构模型。!%a{?-7, http://www.100md.com
3 MHC多态性研究!%a{?-7, http://www.100md.com
抗原提呈中，抗原呈递细胞将摄入的抗原大分子在胞内降解为多肽，其中一些免疫原性决定簇与胞内MHCⅡ类分子相结合，运送到胞膜表面，形成修饰的复合物分子，以被CD4+T细胞识别。由于MHC结合的多肽存在着1个适于MHC结合的“序列模型”(基序)，而这种基序的特异性正是MHC等位基因特异性的表现，因此可以通过不同MHC等位基因的“多肽结合基序”分析这种MHC等位基因的特异性。噬菌体随机肽库提供了模拟抗原多肽的来源，可以同时分析多个MHC等位基因的结合特性，寻找高亲和力多肽配体。例如，西部非洲不易感染疟疾 和B型肝炎病毒人群的DR13等位基因仅是HLA-DRβ链第86位的氨基酸不同，分别为缬氨酸和甘氨酸。用亲和纯化的HLA-DR13从噬菌体肽库中钓出与之结合的多肽，通过MHC与多肽的结合基序分析MHCⅡ分子的结合特点[7]。用3个结构相似的MHCⅡ分子筛库获得的3组表位序列既有共同点，也有各自的特点：第1位上都是Tyr残基，第4位上都是Met残基，每1组的第6位表现出等位基因特异性的保守残基。作者推测Tyr和Met都是锚定在3个MHCⅡ分子共有的2个“口袋”中，而噬菌体多肽第6位上的残基则与MHCⅡ分子等位基因特异性结合有关[8]。这类分析对于自身免疫性疾病的研究和疫苗的设计非常有参考价值。!%a{?-7, http://www.100md.com
4 多肽药物筛选!%a{?-7, http://www.100md.com
在多肽药物设计和寻找过程中，肽库筛选是非常有应用前景的技术，它不仅提供了新的药理学导向来源，而且大大提高了筛选的工作效率。一般肽库含有107个不同的多肽，远大于传统医药工业筛选新药所用的数量；并且，从大量有机化合物中反复筛选、鉴别和纯化往往需要几年的工作量，费时、获率又极低。噬菌体肽库技术高效、方便的筛选使它在这一领域倍受青睐，已经得到了许多具有天然配体活性的多肽。其中最成功的例子是1996年WRIGHTON筛选到具有EPO功能活性的由二键连接的环形短肽。他用重组可溶性红细胞生成素(EPOR)先筛选与gp Ⅷ融合表达的构象约束型噬菌体八肽库，得到与EPOR特异性结合，且不与BSA、TNF的胞外区、神经生长因子(NGFR)、IR-2R(α、β和亚基)以及E选择素结合的环肽。此环肽虽能与EPO竞争结合EPOR，但亲和力较低。为了得到高亲和力多肽，进一步构建了多肽较长的突变型14肽库，并减少多肽在噬菌体表面呈现的价数，以此增大筛选强度。由此获得的环肽亲和力增加了10～50倍，虽然天然EPO在一级结构中无此序列，但体外和体内的一系列生物学实验均证明它们的确能模拟EPO；诱发受体形成二聚体、传导信号、触发生长和分化以及体内刺激网织红细胞的生成[9]。与此同时，有人测定了EPO模拟肽与EPOR复合物的三维结构，发现复合物的四级结构是由2条多肽和2个受体形成的T型对称结构，完全不同于生长激素受体复合物的不对称结构。这些研究提示：噬菌体随机肽库不仅可用来筛选具有生物学活性的多肽，而且可以用于设计具有蛋白激素类物质活性的小分子量模拟肽。
从肽库中寻找拮抗型多肽，也有许多成功的例子。血小板上的凝血酶受体在凝血酶的作用下暴露1条束缚性配体，与受体的激动剂结合。为了得到受体的拮抗性多肽，直接用血小板钓库，用凝血酶受体的1种促效性多肽洗脱。经筛选，获得能与血小板上凝血酶受体发生免疫沉淀反应的多肽。测序后发现这些多肽小配体均存在同共的特点：1个精氨酸残基后接1个脯氨酸。其中1条多肽能对促效性多肽引起的血小板聚集起拮抗作用，并能抑制凝血酶触发的5-羟色胺的释放和酪氨酸磷酸化。抗聚集的活性比以往报道的凝血酶受体拮抗性多肽高10倍[10]。此外还获得了在体外鼠和人TNF-α的细胞毒性实验中具有抑制作用的多肽[11]，抑制乙酰胆碱受体与其抗体结合的六肽、抑制成纤维细胞生长因子bFGF诱导的基底血管内皮细胞增生的六肽、中性粒细胞弹性蛋白酶HNE的抑制多肽以及在不知道分子结构的情况下也可以通过噬菌体肽库技术获得糜蛋白酶的拮抗性多肽[12]等。其中，有的多肽还能模拟天然抗原在小鼠体内产生相同的免疫应答[13]。特别是利用重组可溶性IL-1受体钓库所得的短肽与IL-1r亲和力约为2 nmol/L，接近天然IL-1ra(1.6±0.9 nmol/L)，是迄今为止第一个高亲和力的具有拮抗作用的受体结合肽。按筛库得到的基序设计合成的多肽能抑制IL-1诱导的种种生物学效应，如抑制IL-1诱导表皮纤维母细胞产生IL-8，抑制IL-1诱导IL-6分泌等。为了获得能抑制肿瘤细胞侵害和转移的多肽，KOIVUNEN等用约束型肽库筛选与多种肿瘤细胞的靶分子整全素α5β1结合的多肽，发现均含有RGD序列，在体外可抑制肿瘤细胞的转移[14]。另外，在治疗系统性红斑狼疮方面，用抗双链DNA抗体筛库钓取多肽小抗原，获得了在小鼠体内可避免抗DNA抗体在肾脏的沉积的可溶性多肽，为临床治疗提供了一个新的方法。ovr%*0q, 百拇医药
5 抗原表位分析免疫苗设计ovr%*0q, 百拇医药
微生物蛋白抗原表位的分析对于疫苗的合理设计是非常必要的。1987年兴起的Pepscan技术是化学合成许多肽段通过实验反复验证筛选出靶分子的结构探针，进而分析蛋白的抗原性及微生物蛋白的表位。但是，依此方法仅能获得抗原的线性表位，构象型表位则无法获知。噬菌体肽库技术则解决了这一问题，它可以同时分析蛋白抗原线性表位和构角型表位。噬菌体随机肽库含有的大量不同序列结构多肽可作为任何靶抗原表位的模拟肽。用靶抗原的单抗筛库得到的特异性多肽正是成功地模拟了靶抗原表位的模拟肽，它们反映了抗原结合位点的特定构象。虽然有的多肽与抗原的一级结构不是完全一样，但它们也能与抗原一同竞争结合抗体，表明抗体对抗原的结合位点与多肽是一样的，多肽模拟的是抗原通过折叠在三级结构水平上形成的结合位点，即筛选到的这种表位是构象型表位。运用肽库的最大优点是不需要靶蛋白的任何结构，利用其抗体或受体捕获噬菌体肽库中的小配体，这为疫苗的设计提供了极大方便。利用肽库确定了沙眼衣原体主要外壳蛋白的表位[15]、HBsAg的表位[8]、HCV的核心抗原表位[16]，HIV gp120蛋白和HCV核心蛋白的表位[17]、链激酶的人B细胞表位[18]等。特别是，丝状噬菌体在多种动物系统中都具有良好的免疫原性，可作为载体，与抗原模拟肽结合成为完全抗原。实验证明：呈现外源多肽的噬菌体可引起小鼠类似于天然抗原引起的免疫应答，产生的抗体能与天然抗原反应[19]。可见，噬菌体随机肽库比化学合成的肽库有许多优点：由生物体转录翻译产生的多肽具有生物学活性，无需纯化，并达到70%～94%的纯度要求；不需要将多肽与载体连接，因为从噬菌体肽库得到的多肽已经是一个融合型分子；在筛选中无需纯化，因为噬菌体多肽直接与靶分子发生富集；多肽可通过噬菌体扩增而增加；试验费用低。此外，如果需要游离型多肽，可以在外源随机DNA片断末端增加编码Asp-Pro的序列，在酸性环境下利用盐酸胍切割而获得。
6 疾病检测*iz}k&, 百拇医药
感染性疾病患者的血清含有针对抗原的各种抗体。只有在天然抗原是微生物或者是已被克隆表达的情况下才容易获得纯抗原来鉴定特异性的抗体。有些疾病的诊断，例如自身免疫性疾病，也需要自身抗原来鉴定体内自身抗体的存在。如果未知天然抗原或者抗原不容易获得，那么可以利用噬菌体随机肽库技术获得疾病特异性噬菌体位(phagotop)，应用于临床疾病的检测：与患者血清发生特异性反应而与正常血清不发生反应。例如，用HBV疫苗免疫的人血清筛选肽库，并用多个患者的血清样本和正常血清作进一步鉴定，得到HBsAg抗原性模拟肽。这样可以不需要天然抗原的信息直接用这些多肽鉴定疾病相关抗体。PREZZI直接用感染了人肝炎C病毒患者的一组血清样本筛选出能与这些血清反应而不与正常血清反应的特异性噬菌体克隆。此外，这些噬菌体呈现的多肽可作为抗原中和抗几种HCV蛋白的兔抗体。用2株抗人乙肝表面抗原(HBsAg)的单抗筛选十五肽库，获得的多肽不仅可与抗人乙肝表面抗原(HBsAg)单抗结合，而且可与乙肝患者的血清特异性结合。在天然抗原的序列中找到了与其相似的多肽序列，进一步表明所筛到的抗原型表位可作为临床的检测试剂[8]。此外，还获得了可用于临床疾病检测的支原体肺炎模拟性抗原表位15肽[19]。当然，这种方法也使用于其他疾病患者血清的检测。*iz}k&, 百拇医药
7 结语*iz}k&, 百拇医药
噬菌体随机肽库日益受到人们的重视，噬菌体随机肽库技术也日趋成熟，并根据应用目的不同而构建了各种不同的肽库，在分子生物学研究中广泛应用，成为研究分子识别的有利工具。当然，作为一种新技术，也有它应用的局限性，例如所得的多肽是融合型的，在研究MHCⅠ类分子结合的多肽模型中不太适合，因为游离的羧基及氨基端对于多肽是否能与MHCⅠ类分子结合起重要作用[20]；虽然可以确定蛋白分子的结合位点，但了解分子折叠的立体构象还需借助衍射结晶学方法。*iz}k&, 百拇医药
[作者简介] 李 华(1971-)，女，四川成都市人，实验师，硕士，主要从事分子免疫学研究。*iz}k&, 百拇医药
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[收稿日期] 1999-04-16；[修回日期] 1999-09-06(李华 朱锡华)
单位：李华(全军免疫学研究所，第三军医大学免疫学教研室，重庆 400038)；朱锡华(全军免疫学研究所，第三军医大学免疫学教研室，重庆 400038)-9[|3g{, 百拇医药
关键词：肽库；噬菌体呈现-9[|3g{, 百拇医药
免疫学杂志000521-9[|3g{, 百拇医药
[摘 要] 生物大分子间的相互作用是一切生命现象的基础。近年来，噬菌体随机肽库已成为探索受体与配体之间相互作用结合位点、寻求高亲和力生物活性的配体分子、探测未知蛋白空间结构表位的有利工具，在蛋白分子相互识别的研究、新型疫苗的研制、以及药物的开发等领域具有广泛应用前景。本综述旨在介绍它在几个方面的重要应用。-9[|3g{, 百拇医药
[中图分类号] R371.3 [文献标识码] A-9[|3g{, 百拇医药
[文章编号]1000-8861(2000)05-0387-04-9[|3g{, 百拇医药
Application of the phage display random peptide library-9[|3g{, 百拇医药
生物大分子间的相互作用是一切生命现象的基础。机体内众多的生物学效应，包括免疫应答、信号传导、基因调控、细胞凋亡等，都是通过生物大分子之间或亚基之间的相互作用而实现的，因而生物大分子结构与功能的研究一直是分子生物学研究的中心。分子特定的功能依赖于它所具有的特定结构。为深入全面地了解蛋白分子的功能，必须了解蛋白质的结构，特别是蛋白分子某种功能所对应的特定空间结构，这对于研究和分析生物大分子相互作用的机理以及分子结构与功能之间的关系，进而在分子水平上认识生物体系至关重要。研究分子间相互作用的方法有许多，其中，噬菌体随机肽库是近年来新兴的一个探索受体与配体之间相互作用结合位点、寻求高亲和力生物活性的配体分子、探测未知蛋白空间结构表位的有利工具，在蛋白分子相互识别的研究、新型疫苗的研制、以及药物的开发等领域具有广泛应用前景。-9[|3g{, 百拇医药
1 噬菌体随机肽库-9[|3g{, 百拇医药
噬菌体随机肽库是由上亿种与噬菌体外壳蛋白以融合的形式呈现在噬菌体表面的多肽所组成，库中上亿种多肽分别呈现在上亿个噬菌体表面，众多重组型噬菌体便组成了噬菌体随机肽库。随机肽库所用的噬菌体为丝状噬菌体fl、fd和M13。与其它噬菌体不同，丝状噬菌体并不裂解宿主菌，而是以分泌形式扩增，每个感染细胞内每代可产生上百个病毒颗粒，因此，获得的噬菌体滴度很高，约1010～1012 pfu/ml，足以满足库容的需要。扩增时，病毒基因从细胞膜上溢出时被外壳蛋白包被。噬菌体的外壳蛋白pVⅢ约2 700～3 000个拷贝，包绕病毒基因组螺旋对称排列，构成圆管型的噬菌体外壳。PⅢ外壳蛋白在噬菌体的最尾端，约3～5个拷贝，能与细菌F纤毛结合，是噬菌体感染大肠杆菌所必需。噬菌体随机肽库中，表达的多肽连接在外壳蛋白gpⅢ或gpⅧ的N端，呈现在噬菌体表面。由于特异的融合型多肽是通过对固相化靶分子的亲和力来筛选，因而可以在预先不知道多肽结构的情况下，对上亿种噬菌体组成的肽库进行高效筛选和富集。筛选出的噬菌体克隆通过再次感染细菌得到扩增，该克隆所呈现的多肽间接通过克隆噬菌体DNA测序获得。靶分子的每个结合部位均存在各自特定的结合模型(motif，基序)。从筛选出的噬菌体克隆这些多肽序列中可以反映出这种结合模型。将此基序与靶分子的天然配体结构进行比较，可以知道这些多肽模拟的是配体的哪一个空间结合部位。实际上，噬菌体肽库的融合型多肽与靶分子的结合是直接从三维结构上模拟了天然配体分子与靶分子结合的结合部位，从而给我们提供了分析生物大分子相互作用的有效信息。
2 蛋白分子结构分析{m@, 百拇医药
蛋白分子的结构与功能紧密相连。研究蛋白分子间的结合以往通常需要蛋白分子的空间结构为基础。然而蛋白分子的空间结构并不如一级结构那样容易获得，纯化蛋白分子单晶体获得的极大困难使得靠晶体衍射分析获取精确的分子空间结构数据受阻。并且，蛋白分子的构象是可变的，在生物体内液相环境中的构象并不一定与固相结构完全相同；用软件预测蛋白分子的空间结构也仅有50%～60%的准确性。通过对蛋白分子识别的衍射分析，发现两个分子相互作用所需的绝大部分结合能由少数几个关键残基的相互作用来提供，含有关键残基的短肽可以模拟蛋白分子折叠产生的表位与其受体发生结合。由于噬菌体呈现的多肽能够与靶分子结合，因而通过亲和筛选可以从噬菌体随机肽库中筛选与靶分子结合的多肽，即让多肽模拟天然配体的结合部位与靶分子结合，直接测知配体与受体的结合位点。利用化学合成交叠肽的方法研究蛋白分子存在一定的局限性：仅能获得连续性表位的信息。而噬菌体肽库的多肽不仅可以模拟蛋白分子连续性序列构成的结合部位而且可以模拟非连续性序列经过折叠而构成的结合部位，因而同时获得所有表位的信息，并且反应均在液相进行，接近生物体内的液相环境，可较好反映实际情况。{m@, 百拇医药
基于此原理，利用噬菌体肽库技术已经确定了许多蛋白分子的相互作用位点，包括组成的SH3与酪氨酸蛋白激酶的结合位点[1]、胞浆蛋白p47phox与细胞色素b558的结合位点[2]、甲病毒属E2糖蛋白的血细胞凝集素激活区域[3]、蛋白酶抑制剂巨球蛋白α2与细胞膜受体的结合位点[4]等。除此之外，噬菌体肽库技术在研究酶在激活过程中亚基间的装配方面也显示出独特的优势。DELEO等人利用随机肽库研究了中性粒细胞NADPH依赖的氧化酶激活过程中亚基间的装配。NADPH氧化酶是多亚基蛋白，由胞膜上的细胞色素b和p91-phox、p22-phox及p47-phox亚基组成，其中p47-phox只是在细胞激活过程中才从胞浆移动到胞膜并与之结合。将gp91-phox和gp22-phox的序列与用p47-phox筛选噬菌体肽库得到的序列进行比较，发现存在同源性区域，揭示了它们之间的结合位点。以这些序列合成的游离多肽在体外试验中发现可抑制NADPH氧化酶的装配[5]。{m@, 百拇医药
另外，在分析蛋白结构的突变对功能的影响时，噬菌体肽库技术体现了自身的优势。构建针对某一蛋白分子的突变型肽库，即在编码这个蛋白的cDNA基础上，将某一区段的序列换成随机序列，这样可同时对数百个、甚至数千个的突变体进行分析，并找到亲和力最大、活性最高的突变体，弥补了点突变一次只能通过一个突变体来分析部分氨基酸的改变对其功能影响的不足。
蛋白质与DNA的相互作用一直为人们所关注，由于方法学的限制，对该领域了解甚少。锌指结构是与DNA结合的小型蛋白质结构模块，存在于大量真核转录因子中，了解分子特异性识别的模型有助于设计针对某一特定的核苷酸序列的高亲和力锌指蛋白分子[6]。Zif268是从鼠转录因子中获得的具有3个指结构域的锌指蛋白。Zif268与DNA的晶体结构发现每个指结构域以每3个碱基的间隔插入DNA双螺旋的大沟槽中，蛋白与DNA的识别是通过锌指结构侧链上4个氨基酸对密码子的识别。ISALAN等通过构建含Zif268与DNA结合区域的部分随机噬菌体肽库进行分析，发现如果将锌指结构邻近的氨基酸随机化，则可以消除上述选择性结合，提示锌指结构临近氨基酸可能决定了与不同序列的DNA结合。用含有Zif268结合位点的密码子筛选肽库，获得了高亲和力锌指结构模型。!%a{?-7, http://www.100md.com
3 MHC多态性研究!%a{?-7, http://www.100md.com
抗原提呈中，抗原呈递细胞将摄入的抗原大分子在胞内降解为多肽，其中一些免疫原性决定簇与胞内MHCⅡ类分子相结合，运送到胞膜表面，形成修饰的复合物分子，以被CD4+T细胞识别。由于MHC结合的多肽存在着1个适于MHC结合的“序列模型”(基序)，而这种基序的特异性正是MHC等位基因特异性的表现，因此可以通过不同MHC等位基因的“多肽结合基序”分析这种MHC等位基因的特异性。噬菌体随机肽库提供了模拟抗原多肽的来源，可以同时分析多个MHC等位基因的结合特性，寻找高亲和力多肽配体。例如，西部非洲不易感染疟疾 和B型肝炎病毒人群的DR13等位基因仅是HLA-DRβ链第86位的氨基酸不同，分别为缬氨酸和甘氨酸。用亲和纯化的HLA-DR13从噬菌体肽库中钓出与之结合的多肽，通过MHC与多肽的结合基序分析MHCⅡ分子的结合特点[7]。用3个结构相似的MHCⅡ分子筛库获得的3组表位序列既有共同点，也有各自的特点：第1位上都是Tyr残基，第4位上都是Met残基，每1组的第6位表现出等位基因特异性的保守残基。作者推测Tyr和Met都是锚定在3个MHCⅡ分子共有的2个“口袋”中，而噬菌体多肽第6位上的残基则与MHCⅡ分子等位基因特异性结合有关[8]。这类分析对于自身免疫性疾病的研究和疫苗的设计非常有参考价值。!%a{?-7, http://www.100md.com
4 多肽药物筛选!%a{?-7, http://www.100md.com
在多肽药物设计和寻找过程中，肽库筛选是非常有应用前景的技术，它不仅提供了新的药理学导向来源，而且大大提高了筛选的工作效率。一般肽库含有107个不同的多肽，远大于传统医药工业筛选新药所用的数量；并且，从大量有机化合物中反复筛选、鉴别和纯化往往需要几年的工作量，费时、获率又极低。噬菌体肽库技术高效、方便的筛选使它在这一领域倍受青睐，已经得到了许多具有天然配体活性的多肽。其中最成功的例子是1996年WRIGHTON筛选到具有EPO功能活性的由二键连接的环形短肽。他用重组可溶性红细胞生成素(EPOR)先筛选与gp Ⅷ融合表达的构象约束型噬菌体八肽库，得到与EPOR特异性结合，且不与BSA、TNF的胞外区、神经生长因子(NGFR)、IR-2R(α、β和亚基)以及E选择素结合的环肽。此环肽虽能与EPO竞争结合EPOR，但亲和力较低。为了得到高亲和力多肽，进一步构建了多肽较长的突变型14肽库，并减少多肽在噬菌体表面呈现的价数，以此增大筛选强度。由此获得的环肽亲和力增加了10～50倍，虽然天然EPO在一级结构中无此序列，但体外和体内的一系列生物学实验均证明它们的确能模拟EPO；诱发受体形成二聚体、传导信号、触发生长和分化以及体内刺激网织红细胞的生成[9]。与此同时，有人测定了EPO模拟肽与EPOR复合物的三维结构，发现复合物的四级结构是由2条多肽和2个受体形成的T型对称结构，完全不同于生长激素受体复合物的不对称结构。这些研究提示：噬菌体随机肽库不仅可用来筛选具有生物学活性的多肽，而且可以用于设计具有蛋白激素类物质活性的小分子量模拟肽。
从肽库中寻找拮抗型多肽，也有许多成功的例子。血小板上的凝血酶受体在凝血酶的作用下暴露1条束缚性配体，与受体的激动剂结合。为了得到受体的拮抗性多肽，直接用血小板钓库，用凝血酶受体的1种促效性多肽洗脱。经筛选，获得能与血小板上凝血酶受体发生免疫沉淀反应的多肽。测序后发现这些多肽小配体均存在同共的特点：1个精氨酸残基后接1个脯氨酸。其中1条多肽能对促效性多肽引起的血小板聚集起拮抗作用，并能抑制凝血酶触发的5-羟色胺的释放和酪氨酸磷酸化。抗聚集的活性比以往报道的凝血酶受体拮抗性多肽高10倍[10]。此外还获得了在体外鼠和人TNF-α的细胞毒性实验中具有抑制作用的多肽[11]，抑制乙酰胆碱受体与其抗体结合的六肽、抑制成纤维细胞生长因子bFGF诱导的基底血管内皮细胞增生的六肽、中性粒细胞弹性蛋白酶HNE的抑制多肽以及在不知道分子结构的情况下也可以通过噬菌体肽库技术获得糜蛋白酶的拮抗性多肽[12]等。其中，有的多肽还能模拟天然抗原在小鼠体内产生相同的免疫应答[13]。特别是利用重组可溶性IL-1受体钓库所得的短肽与IL-1r亲和力约为2 nmol/L，接近天然IL-1ra(1.6±0.9 nmol/L)，是迄今为止第一个高亲和力的具有拮抗作用的受体结合肽。按筛库得到的基序设计合成的多肽能抑制IL-1诱导的种种生物学效应，如抑制IL-1诱导表皮纤维母细胞产生IL-8，抑制IL-1诱导IL-6分泌等。为了获得能抑制肿瘤细胞侵害和转移的多肽，KOIVUNEN等用约束型肽库筛选与多种肿瘤细胞的靶分子整全素α5β1结合的多肽，发现均含有RGD序列，在体外可抑制肿瘤细胞的转移[14]。另外，在治疗系统性红斑狼疮方面，用抗双链DNA抗体筛库钓取多肽小抗原，获得了在小鼠体内可避免抗DNA抗体在肾脏的沉积的可溶性多肽，为临床治疗提供了一个新的方法。ovr%*0q, 百拇医药
5 抗原表位分析免疫苗设计ovr%*0q, 百拇医药
微生物蛋白抗原表位的分析对于疫苗的合理设计是非常必要的。1987年兴起的Pepscan技术是化学合成许多肽段通过实验反复验证筛选出靶分子的结构探针，进而分析蛋白的抗原性及微生物蛋白的表位。但是，依此方法仅能获得抗原的线性表位，构象型表位则无法获知。噬菌体肽库技术则解决了这一问题，它可以同时分析蛋白抗原线性表位和构角型表位。噬菌体随机肽库含有的大量不同序列结构多肽可作为任何靶抗原表位的模拟肽。用靶抗原的单抗筛库得到的特异性多肽正是成功地模拟了靶抗原表位的模拟肽，它们反映了抗原结合位点的特定构象。虽然有的多肽与抗原的一级结构不是完全一样，但它们也能与抗原一同竞争结合抗体，表明抗体对抗原的结合位点与多肽是一样的，多肽模拟的是抗原通过折叠在三级结构水平上形成的结合位点，即筛选到的这种表位是构象型表位。运用肽库的最大优点是不需要靶蛋白的任何结构，利用其抗体或受体捕获噬菌体肽库中的小配体，这为疫苗的设计提供了极大方便。利用肽库确定了沙眼衣原体主要外壳蛋白的表位[15]、HBsAg的表位[8]、HCV的核心抗原表位[16]，HIV gp120蛋白和HCV核心蛋白的表位[17]、链激酶的人B细胞表位[18]等。特别是，丝状噬菌体在多种动物系统中都具有良好的免疫原性，可作为载体，与抗原模拟肽结合成为完全抗原。实验证明：呈现外源多肽的噬菌体可引起小鼠类似于天然抗原引起的免疫应答，产生的抗体能与天然抗原反应[19]。可见，噬菌体随机肽库比化学合成的肽库有许多优点：由生物体转录翻译产生的多肽具有生物学活性，无需纯化，并达到70%～94%的纯度要求；不需要将多肽与载体连接，因为从噬菌体肽库得到的多肽已经是一个融合型分子；在筛选中无需纯化，因为噬菌体多肽直接与靶分子发生富集；多肽可通过噬菌体扩增而增加；试验费用低。此外，如果需要游离型多肽，可以在外源随机DNA片断末端增加编码Asp-Pro的序列，在酸性环境下利用盐酸胍切割而获得。
6 疾病检测*iz}k&, 百拇医药
感染性疾病患者的血清含有针对抗原的各种抗体。只有在天然抗原是微生物或者是已被克隆表达的情况下才容易获得纯抗原来鉴定特异性的抗体。有些疾病的诊断，例如自身免疫性疾病，也需要自身抗原来鉴定体内自身抗体的存在。如果未知天然抗原或者抗原不容易获得，那么可以利用噬菌体随机肽库技术获得疾病特异性噬菌体位(phagotop)，应用于临床疾病的检测：与患者血清发生特异性反应而与正常血清不发生反应。例如，用HBV疫苗免疫的人血清筛选肽库，并用多个患者的血清样本和正常血清作进一步鉴定，得到HBsAg抗原性模拟肽。这样可以不需要天然抗原的信息直接用这些多肽鉴定疾病相关抗体。PREZZI直接用感染了人肝炎C病毒患者的一组血清样本筛选出能与这些血清反应而不与正常血清反应的特异性噬菌体克隆。此外，这些噬菌体呈现的多肽可作为抗原中和抗几种HCV蛋白的兔抗体。用2株抗人乙肝表面抗原(HBsAg)的单抗筛选十五肽库，获得的多肽不仅可与抗人乙肝表面抗原(HBsAg)单抗结合，而且可与乙肝患者的血清特异性结合。在天然抗原的序列中找到了与其相似的多肽序列，进一步表明所筛到的抗原型表位可作为临床的检测试剂[8]。此外，还获得了可用于临床疾病检测的支原体肺炎模拟性抗原表位15肽[19]。当然，这种方法也使用于其他疾病患者血清的检测。*iz}k&, 百拇医药
7 结语*iz}k&, 百拇医药
噬菌体随机肽库日益受到人们的重视，噬菌体随机肽库技术也日趋成熟，并根据应用目的不同而构建了各种不同的肽库，在分子生物学研究中广泛应用，成为研究分子识别的有利工具。当然，作为一种新技术，也有它应用的局限性，例如所得的多肽是融合型的，在研究MHCⅠ类分子结合的多肽模型中不太适合，因为游离的羧基及氨基端对于多肽是否能与MHCⅠ类分子结合起重要作用[20]；虽然可以确定蛋白分子的结合位点，但了解分子折叠的立体构象还需借助衍射结晶学方法。*iz}k&, 百拇医药
[作者简介] 李 华(1971-)，女，四川成都市人，实验师，硕士，主要从事分子免疫学研究。*iz}k&, 百拇医药
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[收稿日期] 1999-04-16；[修回日期] 1999-09-06(李华 朱锡华)