植物病毒长距离转运的分子机理
作者：凌建群 周雪平 李德葆
单位：浙江大学生物技术研究所，杭州 310029)
关键词：
病毒学报000322 中图分类号：S432.4+1 文献标识码：A
文章编号：1000-8721(2000)03-0285-05
植物病毒侵入寄主细胞后，其局部侵染和系统侵染的形成涉及病毒在植物体内二种不同的转运模式：经过叶肉细胞胞间连丝来实现的胞间转运(cel-to-cell movement)和经过植物维管系统的韧皮部筛管来实现的长距离转运(long-distance transport)[1]。近十年来对胞间转运的大量研究，尤其是对TMV在烟草叶肉细胞间转运机理的出色研究，使人们逐步明晰了病毒胞间转运的一些基本步骤及转运机理，建立起了植物病毒胞间转运机理研究的基本模式[2-5]。与此同时，因病毒的长距离转运是其实现系统侵染的关键过程，人们对病毒长距离转运机理的研究也积累了相当多的工作，该方面的研究日益成为植物病毒学研究的一个重要内容。本文拟对病毒长距离转运过程中所涉及的病毒因子、 病毒-寄主的互作及病毒进出韧皮部筛分子的可能方式作一概述。
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1 参与病毒长距离转运的病毒因子及其作用
在长距离转运过程中，要求病毒能顺利通过维管束鞘细胞、韧皮部薄壁细胞、伴胞细胞和筛分子[1，6]。而维管束内连接这些细胞的胞间连丝在结构上不同于叶肉细胞的胞间连丝，连接筛分子和伴胞细胞的胞间连丝在伴胞细胞的胞壁上有强烈分支，筛分子一侧的胞壁上形成一个孔，这种胞间连丝的SEL(size exclusion limit)提高的方式可能与叶肉细胞胞间连丝不一样，又由于筛分子缺乏蛋白质合成能力和病毒复制能力，病毒进出筛分子的过程需不同于MP的一些病毒因子和寄主因子的参加[6]。绝大多数病毒在相应寄主上的长距离转运是由CP调控的(表1)，这方面的证据大部分来自于对CP的缺失突变体或CP置换重组病毒的侵染性试验[1，6-23]。病毒长距离转运是否需CP依寄主的不同和病毒遗传背景的不同而异，如CMV在烟草上的长距离转运不需CP[24]，而在豌豆和黄瓜上需CP辅助[11]，单组分双生病毒如玉米线条病毒(MSV)在玉米上，番茄曲叶病毒(TLCV)在番茄上的长距离转运需CP[19，20]；而双组分双生病毒如番茄金邑花叶病毒(TGMV)在本氏烟上、菜豆金色花叶病毒(BGMV)在菜豆上的长距离转运不需CP[7]。寄主植物生长的环境条件对病毒长距离转运也有一定影响，如在25℃生长条件下，红三叶草坏死花叶病毒(RCNMV)在本氏烟中的长距离转运需CP，而在15℃生长条件下则不需CP参与[17]。对花椰菜花叶病毒(CaMV)在芜菁、拟南芥、烟草(N.bigelovit)上的长距离转运研究则表明，生长条件、植株的发育状态及日照长度均可影响CaMV的长距离转运的表现[25-27]。因此仅由病毒基因突变体研究而来的结果往往会在不同的寄主生理条件下有不同的结果。
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病毒的非结构蛋白如复制酶、HC-Pro等也在辅助相应病毒的长距离转运中起作用[1，28]。值得指出的是，烟草蚀纹病毒(TEV)的HC-Pro在病毒侵染植物过程中起多方面的作用，它可参与蛋白的成熟过程、基因组的复制、蚜虫介导的传播及病毒在植物体的长距离转运等[28，29]。研究表明，HC-Pro核心区域中半胱氨酸基序进行替换后，对病毒胞间转运功能无影响，但可完全抑制TEV的长距离转运过程，该病毒突变体的长距离转运在表达HC-Pro基因的植株内可以得到部分恢复。组化试验表明突变体可以进入叶片次脉周围及其内部的大部分细胞，但是否能进入筛分子还不清楚，这表明HC-Pro可能是在病毒进入维管束鞘细胞后的维管束内共质体转运过程中起作用。此外，HC-Pro还具有与病毒RNA(vRNA)结合的功能。对HC-Pro基因突变后获得的病毒突变体在嫁接植株上的侵染性研究表明，在TEV的长距离转运过程中，HC-Pro在vRNA合成或病毒装配位点上与vRNA或病毒粒子结合，辅助vRNA或粒子经过韧皮部细胞间的胞间连丝，并在使vRNA或粒子进出筛分子的过程中起作用，但更直接的证据还有待于深入的研究。也有学者认为，HC-Pro可能通过抑制寄主体内限制病毒复制和长距离转运的防卫反应而起作用，但缺乏明确证据[28]。菜豆普通花叶坏死病毒(BCMNV)的HC-Pro与TEV的HC-Pro的功能是不同的，BCMNV的HC-Pro只在辅助病毒进行胞间转运的过程中起作用，它可提高莴巨叶肉细胞胞间连丝的SEL[5]。根据BCMNVHC-Pro通过提高胞间连丝的SEL促进病毒胞间转运的这个功能，可以推测TEV的HC-Pro也许是通过与连接筛分子伴胞细胞的胞间连丝互作，从而在辅助TEV的长距离转运中起作用。由于TEV的长距离转运也需CP的参与，可以设想HC-Pro与CP协同作用以辅助TEV的长距离转运。另外，病毒非结构蛋白也可在辅助病毒进行长距离转运中起作用，如雀麦花叶病毒(BMV)在大麦上转运需2a蛋白的参与[30]，黄瓜花叶病毒(CMV)的1a蛋白、2b蛋白在辅助病毒长距离转运中起作用[31，32]，大麦条纹花叶病毒(BSMV)在燕麦上转运需2a蛋白的参与，2a蛋白与寄主因子互作与否决定BSMV在燕麦上是长距离转运还是胞间转运[33]。CMV的2b基因是迄今为止报道的唯一一个专司辅助病毒进行长距离转运功能的基因，CMVQ株系亚基因组RNA4A编码2b蛋白，2b基因是一个重叠基因，2b基因5′端与RNA2编码的2a蛋白基因3′端的207个碱基重叠，位于RNA2的第2 410～2 712位核苷酸区。2b基因缺失后，CMV不能在黄瓜和烟草上形成系统侵染。
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表1 与病毒长距离转运有关的病毒因子
Table 1 Viral factors involved in long distance transport of viruses Virus
Host plant
Viral factors
Reference
豇豆褪绿花叶病毒(cowpea chlorotic mosaic virus，CCMV)
豇豆
CP和3a蛋白
[14]
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芜菁皱缩病毒(turnip crinkle virus，TCV)
本氏烟
CP
[15]
油菜
CP
豌豆花叶病毒(cowpea mosaic virus，CpMV)
豇豆
CP
[16]
黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus，CMV)
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烟草
1a，3a蛋白
[22]
豇豆和黄瓜
CP
黄瓜花叶病毒Q株素(Q-CMV)
心叶烟
2b蛋白
[32]
番茄不孕病毒(tomato aspermy virus，TAV)
黄瓜
需CMV的CP
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红三叶草坏死花叶病毒(red clover necrotic mosaic virus，RCNMV)
烟草
CP，MP
[17]
甜菜坏死黄脉病毒(beet necrotic yellow vein virus，BNYVV)
菠菜
CP
[34]
Beta marocaspa
RNA3 ORFA
玉米条纹病毒(maize streak virus，MSV)
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玉米
CP
[20]
番茄曲叶病毒(tomato leaf curl virus，TLCV)
番茄
CP
[19]
马铃薯X病毒(potato virus X，PVX)
克里夫兰烟
CP
雀麦花叶病毒(brome mosaic virus，BMV)
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大麦
αa蛋白
[30]
烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)
烟草
CP
[8]
建兰环斑病毒(cymbidium ringspot virus，CRSV)
克里夫兰烟
CP
[37]
烟草蚀纹病毒(tobacco etch virus，TEV)
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烟草
CP和HC-Pro
[10]
芜菁黄花叶病毒(turnip yellow mosaic virus，TYMV)
大白菜、芜菁
CP
[6]
水稻黄斑驳病毒(rice yellow mottle virus，RYMV)
水稻
CP
[13]
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菜豆普通花叶坏死病毒(bean common mosaic necrotic virus，BCMNV)
烟草
CP
[5]
烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus，TRV)
烟草
CP
[2]
大麦条纹花叶病毒(barley stripe mosaic virus，BSMV)
燕麦
, 百拇医药 2a蛋白
[33]
大麦条纹花叶病毒ND18株系(BSMV ND18)
本氏烟
RNAγ5′前导序列
[35]
花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus，CaMV)
芜菁等十字
花科植物
基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ
[27]
, 百拇医药 RNA的一级结构或二级结构也可决定病毒的长距离转运。甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)是一个含5条正链RNA的病毒，RNA1和RNA2是该病毒的“看家基因”(house-keeping gene)，与病毒的复制,胞间转运及病毒粒子的装配有关。RNA3、4、5在不同的田间分离物是不一致的，RNA5仅在日本和欧洲的BNYVV株系上有过存在的报导[34]，而RNA3是病毒在Beta macrocarpa中进行系统转运所必需，对RNA3的cDNA进行点突变和缺失突变后，与RNA1、2、4共接种Beta macrocarpa，发现RNA3的1033～1257核苷酸组成的核心区域是辅助病毒进行长距离转运所必需的。该核心区域两侧序列的缺失，对BNYVV的长距离转运效率只有轻微的影响，将编码的ORF进行突变阻断翻译也不影响BNYVV在相应寄主上的长距离转运。这些结果可以表明，是RNA3的序列而不是其翻译产物可以以寄主特异方式辅助BNYVV在Beta marcrocarpa上的长距离转运过程中起作用。类似结果在BSMV的长距离转运研究中也有报道，BSMVND18株系的γa蛋白ORF前的一段引导序列有一个小的ORF，它可通过对γa的ORF翻译效率的影响来调节BSMV的长距离转运过程[35]。CaMV对十字花科作物的系统侵染的寄主专化性很强，并涉及到许多基因，利用不同株系的融合基因构成重组病毒后的侵染试验证明，基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ等都参与病毒的长距离转运过程[36]。
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有关病毒的运动蛋白在病毒长距离转运过程中所起的作用知之甚少，这主要归因于分析长距离转运过程的困难，但还是有少量证据表明MP在病毒长距离转运中起特殊作用[2]。含齿兰环斑病毒(CRSV)MP的重组TMV在烟草上不能进行长距离转运，如果把CRSV MP COOH端11个氨基酸编码序列缺失，与TMV基因组重组后对其胞间转运影响很小，并可在烟草上进行长距离转运，这表明MP可能在胞间转运和长距离转运中起特殊作用[37，38]。RCNMV MP经替换突变后，其系统侵染的寄主特异性丧失。35kD的MP可能与RCNMV的RNA结合并辅助转运。至于MP能否提高维管束内细胞间胞间连丝的SEL还不清楚，但TMVMP不能提高这些胞间连丝的SEL[2]。CMV长距离转运研究表明，其3a蛋白可定位在筛分子与伴胞细胞间的胞间连丝中，3a蛋白与CP共同作用使之通过该胞间连丝进入筛分子。
2 参与病毒长距离转运的寄主因子
, 百拇医药 寄主因子的参与在病毒长距离转运过程中起一定作用，由于成熟的筛管是植物有机养分由源至库转运的通道，所有叶肉细胞光合作用产物都必须经共质体系统从合成部位的细胞转移到维管系统的筛管中，其中有数以百计的分子量在6kD～100kD的蛋白。此外，伴胞细胞合成的一些蛋白，也只能经由连接伴胞细胞和筛分子的胞间连丝进入筛分子，显然这些大分子物质的分子量有的远远超过胞间连丝的SEL，而注射试验表明，这种胞间连丝的SEL至多只能提高至20kD，因此这些内源性蛋白很可能在调节韧皮部转运功能方面起重要作用[7]。很可能病毒与这些寄主蛋白互作，利用寄主蛋白提高胞间连丝的SEL，从而使病毒通过胞间连丝。由于一些病毒以核酸形式在筛分子中转运，因此韧皮部蛋白在保护vRNA中起作用。豇豆褪绿花叶病毒(CCMV)在大豆PI346304品种中的长距离转运在鞘细胞/韧皮部细胞间受阻[39]，而TEV可侵入烟草品种V20接种叶片的韧皮部细胞，但该品种可抑制TEV的系统侵染[40]。这二个试验表明，病毒长距离转运受阻是由二个不连锁的隐性位点控制，这二个基因很可能编码一些可在单一位点与病毒编码因子互作的寄主因子，从而控制长距离转运过程。另外，这些基因可能调节寄主防卫反应，从而限制病毒在韧皮部的出入。CCMV在大豆不同品种上的侵染性试验也表明CCMV的系统侵染的形成受一显性基因的控制[40]，明确这些基因性质有助于更全面地理解病毒在寄主植物的长距离转运过程中病毒——寄主互作的分子机理。
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3 病毒长距离转运过程中病毒因子与寄主因子的互作
有关寄主专化性的大量研究表明，在病毒的长距离转运中，病毒因子与寄主因子的互作是重要的。植物对某些病毒具有免疫性可能是因为这些病毒不能与植物内源性的这些可起调控作用的大分子发生有效互作[2，7]。TMV在烟草中可形成系统侵染，而CRSV则只能在接种的叶片上扩散，不能转运至植物体其它部分，用CRSV的CP置换TMV的CP后构成的重组TMV，在烟草上的长距离转运受阻，但胞间转运正常。这个现象表明，TMV的CP可能与寄主因子发生特异性互作，这种互作可能发生在维管细胞的胞间连丝中，从而使TMV能顺利进出韧皮部，用CRSV MP替换TMV MP后组成的重组TMV在烟草上的接种试验也观察到同样的现象。病毒转运受阻的现象可能是因胞间转运功能减弱的间接后果，也许是长距离转运中需特异的复合体CP-MP-vRNA与寄主因子之间发生互作[21]。RCNMV在本氏烟上系统侵染的形成比较特殊，当植株在25℃生长条件下，RCNMV的长距离转运需CP参与，而15℃时则不需。这表明CP与寄主因子互作是复杂的[17]。番茄不孕病毒(TAV)在黄瓜上不能形成系统侵染，CMV则可以，当TAV与CMV共接种到黄瓜叶片上，则发现TAV也可形成系统侵染。突变分析表明是CMV的CP辅助TAV的转运[22]，这表明病毒因子与寄主因子亲和性互作决定病毒长距离转运。对CCMV和BMV的研究表明，它们的3a蛋白决定了寄主专化性，当把二者的3a基因互换重组后在各自寄主上进行侵染性试验，重组病毒尽管可以复制和进行胞间转运，但不能在各自寄主上形成系统侵染，因此病毒因子与寄主因子互作对寄主专化性形成和长距离转运的进行都是关键的[41]。PVY病毒CP的分子生物学研究表明，CP的核心区域为病毒装配和胞间转运所必需，而N端和C端则为长距离转运所必需，这表明病毒因子与不同的寄主因子的互作决定了病毒不同的生物学功能[42]。BMV CP也与寄主专化性有关，N端7个氨基酸的缺失，BMV就不能在其寄主Chenopedium hybridum上形成系统侵染，但在雀麦上还可形成。这个试验表明，BMVCP和寄主因子在病毒长距离转运过程中都是必要的[43]。由于病毒长距离转运的二个限制环节可能在进和出筛分子的部位，因此很可能病毒因子与寄主因子的互作发生在筛分子/伴胞细胞的胞间连丝内。由于大量的植物内源性蛋白需经过位于伴胞细胞和筛分子间的胞间连丝进行运输，因此，病毒利用这些寄主蛋白促进它的转运也可能是一个重要的方面。这些寄主蛋白的参与有利于形成稳定的竞争性转运复合体，并使之有效分布到胞间连丝部位或经连丝微管实现转运。此外，位于筛管内的韧皮部蛋白可能具保护内源性mRNA的作用，因此这些蛋白在维持vRNA的稳定性方面会起一定作用。对这些可与CP或其它病毒因子发生互作并辅助病毒的长距离转运的寄主因子及其基因的分离和克隆，将有利于明确了解病毒在维管系统中转运的分子机理。
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4 病毒进出维管系统的方式
许多实验结果表明，病毒能否顺利地进出维管系统是病毒建立系统侵染的关键。病毒进入筛分子和从筛分子转移出至周围薄壁细胞是其长距离转运的二个过程，任何一个过程的阻碍均不能使病毒实现系统侵染。叶肉细胞、维管束鞘细胞、韧皮部薄壁细胞、伴胞细胞及筛分子组成了病毒进出筛管的途径，而这些细胞间的胞间连丝使得叶肉细胞及维管束内细胞间共质体系统互相连通。尽管已有报道CP可以提高维管束内细胞间胞间连丝的SEL，并且可以介导vRNA的胞间转运[42]，然而，TMV CP突变体能以胞间转运方式从叶肉细胞转运至韧皮部细胞，因此CP很可能只是在长距离转运过程中病毒通过鞘细胞/韧皮部薄壁细胞的胞间连丝转运后起作用。此外，虽然绝大多数以TMV方式进行胞间转运的病毒，其长距离转运也需CP参与，然而部分双生病毒和hordeivirus的长距离转运却是不需CP参与[7]。在病毒长距离转运中，其它病毒因子如HC-Pro等及寄主因子在辅助病毒进入韧皮部的过程中可能与CP协同或单独起作用。
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在某些属的病毒，它们具有诱导侵入细胞形成新的胞质微管的能力，以使病毒突破胞壁障碍，从而允许病毒实现胞间转运，这些病毒包括comoviruses， caulimoviruses，nepoviruses和geminiviruses部分病毒，tospoviruses。这种诱导细胞形成临时微管的能力可以使粒子以该种胞间转运的方式进入筛分子[7]。
病毒进入筛分子的另一种可能方式是CP和RNA分别独立进入筛分子，然后在筛分子中重新包装形成新的病毒粒子。由于筛分子内成分的快速转变，这个过程需要的病毒粒子装配位点可能在筛分子胞壁上胞间连丝内质网膜的外表面，一旦成熟的病毒粒子形成，它就可立即释放至在筛管内转运的汁液流中[7]。
也有人认为病毒粒子可能是被直接释放到筛管分子中。在病毒侵染过程中，由于筛分子和相应伴胞细胞及其它韧皮部细胞衰败和死亡，结果使病毒进入筛分子。尽管在该过程中可诱导一些寄主反应，使这些细胞与正常的植物共质体进行隔离，但总有机会使得这些病毒逃离这些区域进入到其它正常的筛分子中。
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对于虫媒病毒如geminiviruses和luteoviruses，通过昆虫摄食可以把病毒粒子直接注入韧皮部的筛分子，当进入筛分子后，病毒必须能从筛分子中出来并进入伴胞细胞和韧皮部薄壁细胞进行复制，在这个过程中，病毒可能需要在筛分子中脱去衣壳，病毒核酸与内源性植物MP结合从而进入伴胞细胞[7]。对新形成的粒子如何进入筛分子从而可被昆虫摄取的机制还有待明确。
病毒进入韧皮部筛分子后，在汁液流中病毒粒子及其核酸都已检测到，病毒在筛管中转运的存在方式可能是多样的，如粒子形式、核酸形式、vRNA-蛋白复合体形式等，现在还不能肯定病毒只是以一种存在方式进行转运。对病毒在筛管汁液流中存在方式的研究可能有助于明确病毒长距离转运的机制。病毒的侵染形式通过筛管汁液流的转运而扩散至植物体各部，病毒最终的位置依赖于初始侵入的叶片的位置，通常植物体下部叶片的病毒可转运至根部，而上部叶片的病毒常转运至茎尖。根据植物养分源库转换的理论，病毒的分布和侵染常在库组织，这点在CaMV和用GFP标记的马铃薯X病毒(PVX)的研究中已得到很好的证明[2，44]。病毒从筛分子中出来很可能象进入筛分子那样依赖于病毒的类型、存在的位置和寄主组织的发育状态。病毒可从筛分子中出来的一个地方是成熟筛分子与正在分化形成的新的筛分子的交接点，在这里，无论是病毒粒子还是vRNA均可通过正在形成的筛孔，使得病毒在这种未成熟的筛分子中可以复制。就DNA病毒而言，它的复制还需有细胞核的存在，而RNA病毒在这种细胞中的复制由于筛管分子分化成熟过程中，其胞内核糖体功能还能维持，因此可以正常进行[7]。此外，MP的产生也许可辅助病毒经过胞间转运侵入邻近细胞，当这样的侵入点形成后，该点就可成为新的侵染物向筛分子进入的来源，并最终形成一循环。
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对水稻黄斑驳病毒(RYMV)系统侵染的研究结果表明，该病毒可经过木质部导管胞壁上的纹孔进入导管进行转运[45]。RYMV接种水稻叶片6天后，通过Western杂交、Northern杂交及电镜观察，均发现在叶表皮细胞、叶肉细胞及维管束薄壁细胞中有该病毒分布，进一步用胞壁纤维素组成成分β-1，4-葡聚糖和抗RYMV的抗体进行免疫细胞学检测，发现二者可共定位于导管管壁的纹孔膜上。这有力地证明了导管的纹孔是RYMV的运输通道，用Ca2+破坏纹孔膜后，可促进病毒经导管进行转运的效率。这项工作的结果表明，病毒在植物体内转运的途径可能多种多样。
5 结语
由于组成维管系统的细胞的复杂性及维管束内共质体结构与功能的特殊性，使得植物病毒长距离转运研究相对比病毒在叶肉细胞间胞间转运研究要困难，病毒进入维管束鞘细胞及在维管束内的细胞间转运至最后进入筛分子，然后经筛管转运，最终由筛分子中转运出来并形成新的侵染点，整个过程涉及到的病毒与寄主互作的方式可能是多种多样的。尽管如此，因病毒结构的相对简单和较小的基因组，对涉及病毒长距离转运的病毒因子已经有了初步的了解。进一步的工作需要对连接筛分子与伴胞细胞的胞间连丝的结构、组成和功能，特别是转运大分子物质的功能作出深入的研究。同时也需对可与CP或其它非结构蛋白、病毒的非编码序列，甚至是核酸-蛋白复合体发生互作的寄主因子进行分离与鉴定。这不仅有助于增进对病毒长距离转运的分子机理的理解，也有利于明确病毒寄主专化性的分子本质。对植物病毒长距离转运过程的了解，可为将来利用基因工程手段来阻断病毒的转运过程以最终实现抗病的目的提供帮助，CmPP16[46]等基因功能的分析有力地证明，对植物病毒长距离转运机理的研究也可为植物内源性物质的转运及其在植物体内分配的调控机理的研究提供借鉴。基金项目：国家自然科学基金(39800004)
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作者简介：凌建群(1968-)男，浙江富阳人，讲师，研究方向为植物分子生物学。
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收稿日期：1998-12-29；修回日期：1999-05-20, http://www.100md.com
单位：浙江大学生物技术研究所，杭州 310029)
关键词：
病毒学报000322 中图分类号：S432.4+1 文献标识码：A
文章编号：1000-8721(2000)03-0285-05
植物病毒侵入寄主细胞后，其局部侵染和系统侵染的形成涉及病毒在植物体内二种不同的转运模式：经过叶肉细胞胞间连丝来实现的胞间转运(cel-to-cell movement)和经过植物维管系统的韧皮部筛管来实现的长距离转运(long-distance transport)[1]。近十年来对胞间转运的大量研究，尤其是对TMV在烟草叶肉细胞间转运机理的出色研究，使人们逐步明晰了病毒胞间转运的一些基本步骤及转运机理，建立起了植物病毒胞间转运机理研究的基本模式[2-5]。与此同时，因病毒的长距离转运是其实现系统侵染的关键过程，人们对病毒长距离转运机理的研究也积累了相当多的工作，该方面的研究日益成为植物病毒学研究的一个重要内容。本文拟对病毒长距离转运过程中所涉及的病毒因子、 病毒-寄主的互作及病毒进出韧皮部筛分子的可能方式作一概述。
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1 参与病毒长距离转运的病毒因子及其作用
在长距离转运过程中，要求病毒能顺利通过维管束鞘细胞、韧皮部薄壁细胞、伴胞细胞和筛分子[1，6]。而维管束内连接这些细胞的胞间连丝在结构上不同于叶肉细胞的胞间连丝，连接筛分子和伴胞细胞的胞间连丝在伴胞细胞的胞壁上有强烈分支，筛分子一侧的胞壁上形成一个孔，这种胞间连丝的SEL(size exclusion limit)提高的方式可能与叶肉细胞胞间连丝不一样，又由于筛分子缺乏蛋白质合成能力和病毒复制能力，病毒进出筛分子的过程需不同于MP的一些病毒因子和寄主因子的参加[6]。绝大多数病毒在相应寄主上的长距离转运是由CP调控的(表1)，这方面的证据大部分来自于对CP的缺失突变体或CP置换重组病毒的侵染性试验[1，6-23]。病毒长距离转运是否需CP依寄主的不同和病毒遗传背景的不同而异，如CMV在烟草上的长距离转运不需CP[24]，而在豌豆和黄瓜上需CP辅助[11]，单组分双生病毒如玉米线条病毒(MSV)在玉米上，番茄曲叶病毒(TLCV)在番茄上的长距离转运需CP[19，20]；而双组分双生病毒如番茄金邑花叶病毒(TGMV)在本氏烟上、菜豆金色花叶病毒(BGMV)在菜豆上的长距离转运不需CP[7]。寄主植物生长的环境条件对病毒长距离转运也有一定影响，如在25℃生长条件下，红三叶草坏死花叶病毒(RCNMV)在本氏烟中的长距离转运需CP，而在15℃生长条件下则不需CP参与[17]。对花椰菜花叶病毒(CaMV)在芜菁、拟南芥、烟草(N.bigelovit)上的长距离转运研究则表明，生长条件、植株的发育状态及日照长度均可影响CaMV的长距离转运的表现[25-27]。因此仅由病毒基因突变体研究而来的结果往往会在不同的寄主生理条件下有不同的结果。
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病毒的非结构蛋白如复制酶、HC-Pro等也在辅助相应病毒的长距离转运中起作用[1，28]。值得指出的是，烟草蚀纹病毒(TEV)的HC-Pro在病毒侵染植物过程中起多方面的作用，它可参与蛋白的成熟过程、基因组的复制、蚜虫介导的传播及病毒在植物体的长距离转运等[28，29]。研究表明，HC-Pro核心区域中半胱氨酸基序进行替换后，对病毒胞间转运功能无影响，但可完全抑制TEV的长距离转运过程，该病毒突变体的长距离转运在表达HC-Pro基因的植株内可以得到部分恢复。组化试验表明突变体可以进入叶片次脉周围及其内部的大部分细胞，但是否能进入筛分子还不清楚，这表明HC-Pro可能是在病毒进入维管束鞘细胞后的维管束内共质体转运过程中起作用。此外，HC-Pro还具有与病毒RNA(vRNA)结合的功能。对HC-Pro基因突变后获得的病毒突变体在嫁接植株上的侵染性研究表明，在TEV的长距离转运过程中，HC-Pro在vRNA合成或病毒装配位点上与vRNA或病毒粒子结合，辅助vRNA或粒子经过韧皮部细胞间的胞间连丝，并在使vRNA或粒子进出筛分子的过程中起作用，但更直接的证据还有待于深入的研究。也有学者认为，HC-Pro可能通过抑制寄主体内限制病毒复制和长距离转运的防卫反应而起作用，但缺乏明确证据[28]。菜豆普通花叶坏死病毒(BCMNV)的HC-Pro与TEV的HC-Pro的功能是不同的，BCMNV的HC-Pro只在辅助病毒进行胞间转运的过程中起作用，它可提高莴巨叶肉细胞胞间连丝的SEL[5]。根据BCMNVHC-Pro通过提高胞间连丝的SEL促进病毒胞间转运的这个功能，可以推测TEV的HC-Pro也许是通过与连接筛分子伴胞细胞的胞间连丝互作，从而在辅助TEV的长距离转运中起作用。由于TEV的长距离转运也需CP的参与，可以设想HC-Pro与CP协同作用以辅助TEV的长距离转运。另外，病毒非结构蛋白也可在辅助病毒进行长距离转运中起作用，如雀麦花叶病毒(BMV)在大麦上转运需2a蛋白的参与[30]，黄瓜花叶病毒(CMV)的1a蛋白、2b蛋白在辅助病毒长距离转运中起作用[31，32]，大麦条纹花叶病毒(BSMV)在燕麦上转运需2a蛋白的参与，2a蛋白与寄主因子互作与否决定BSMV在燕麦上是长距离转运还是胞间转运[33]。CMV的2b基因是迄今为止报道的唯一一个专司辅助病毒进行长距离转运功能的基因，CMVQ株系亚基因组RNA4A编码2b蛋白，2b基因是一个重叠基因，2b基因5′端与RNA2编码的2a蛋白基因3′端的207个碱基重叠，位于RNA2的第2 410～2 712位核苷酸区。2b基因缺失后，CMV不能在黄瓜和烟草上形成系统侵染。
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表1 与病毒长距离转运有关的病毒因子
Table 1 Viral factors involved in long distance transport of viruses Virus
Host plant
Viral factors
Reference
豇豆褪绿花叶病毒(cowpea chlorotic mosaic virus，CCMV)
豇豆
CP和3a蛋白
[14]
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芜菁皱缩病毒(turnip crinkle virus，TCV)
本氏烟
CP
[15]
油菜
CP
豌豆花叶病毒(cowpea mosaic virus，CpMV)
豇豆
CP
[16]
黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus，CMV)
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烟草
1a，3a蛋白
[22]
豇豆和黄瓜
CP
黄瓜花叶病毒Q株素(Q-CMV)
心叶烟
2b蛋白
[32]
番茄不孕病毒(tomato aspermy virus，TAV)
黄瓜
需CMV的CP
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红三叶草坏死花叶病毒(red clover necrotic mosaic virus，RCNMV)
烟草
CP，MP
[17]
甜菜坏死黄脉病毒(beet necrotic yellow vein virus，BNYVV)
菠菜
CP
[34]
Beta marocaspa
RNA3 ORFA
玉米条纹病毒(maize streak virus，MSV)
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玉米
CP
[20]
番茄曲叶病毒(tomato leaf curl virus，TLCV)
番茄
CP
[19]
马铃薯X病毒(potato virus X，PVX)
克里夫兰烟
CP
雀麦花叶病毒(brome mosaic virus，BMV)
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大麦
αa蛋白
[30]
烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)
烟草
CP
[8]
建兰环斑病毒(cymbidium ringspot virus，CRSV)
克里夫兰烟
CP
[37]
烟草蚀纹病毒(tobacco etch virus，TEV)
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烟草
CP和HC-Pro
[10]
芜菁黄花叶病毒(turnip yellow mosaic virus，TYMV)
大白菜、芜菁
CP
[6]
水稻黄斑驳病毒(rice yellow mottle virus，RYMV)
水稻
CP
[13]
, 百拇医药
菜豆普通花叶坏死病毒(bean common mosaic necrotic virus，BCMNV)
烟草
CP
[5]
烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus，TRV)
烟草
CP
[2]
大麦条纹花叶病毒(barley stripe mosaic virus，BSMV)
燕麦
, 百拇医药 2a蛋白
[33]
大麦条纹花叶病毒ND18株系(BSMV ND18)
本氏烟
RNAγ5′前导序列
[35]
花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus，CaMV)
芜菁等十字
花科植物
基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ
[27]
, 百拇医药 RNA的一级结构或二级结构也可决定病毒的长距离转运。甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)是一个含5条正链RNA的病毒，RNA1和RNA2是该病毒的“看家基因”(house-keeping gene)，与病毒的复制,胞间转运及病毒粒子的装配有关。RNA3、4、5在不同的田间分离物是不一致的，RNA5仅在日本和欧洲的BNYVV株系上有过存在的报导[34]，而RNA3是病毒在Beta macrocarpa中进行系统转运所必需，对RNA3的cDNA进行点突变和缺失突变后，与RNA1、2、4共接种Beta macrocarpa，发现RNA3的1033～1257核苷酸组成的核心区域是辅助病毒进行长距离转运所必需的。该核心区域两侧序列的缺失，对BNYVV的长距离转运效率只有轻微的影响，将编码的ORF进行突变阻断翻译也不影响BNYVV在相应寄主上的长距离转运。这些结果可以表明，是RNA3的序列而不是其翻译产物可以以寄主特异方式辅助BNYVV在Beta marcrocarpa上的长距离转运过程中起作用。类似结果在BSMV的长距离转运研究中也有报道，BSMVND18株系的γa蛋白ORF前的一段引导序列有一个小的ORF，它可通过对γa的ORF翻译效率的影响来调节BSMV的长距离转运过程[35]。CaMV对十字花科作物的系统侵染的寄主专化性很强，并涉及到许多基因，利用不同株系的融合基因构成重组病毒后的侵染试验证明，基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ等都参与病毒的长距离转运过程[36]。
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有关病毒的运动蛋白在病毒长距离转运过程中所起的作用知之甚少，这主要归因于分析长距离转运过程的困难，但还是有少量证据表明MP在病毒长距离转运中起特殊作用[2]。含齿兰环斑病毒(CRSV)MP的重组TMV在烟草上不能进行长距离转运，如果把CRSV MP COOH端11个氨基酸编码序列缺失，与TMV基因组重组后对其胞间转运影响很小，并可在烟草上进行长距离转运，这表明MP可能在胞间转运和长距离转运中起特殊作用[37，38]。RCNMV MP经替换突变后，其系统侵染的寄主特异性丧失。35kD的MP可能与RCNMV的RNA结合并辅助转运。至于MP能否提高维管束内细胞间胞间连丝的SEL还不清楚，但TMVMP不能提高这些胞间连丝的SEL[2]。CMV长距离转运研究表明，其3a蛋白可定位在筛分子与伴胞细胞间的胞间连丝中，3a蛋白与CP共同作用使之通过该胞间连丝进入筛分子。
2 参与病毒长距离转运的寄主因子
, 百拇医药 寄主因子的参与在病毒长距离转运过程中起一定作用，由于成熟的筛管是植物有机养分由源至库转运的通道，所有叶肉细胞光合作用产物都必须经共质体系统从合成部位的细胞转移到维管系统的筛管中，其中有数以百计的分子量在6kD～100kD的蛋白。此外，伴胞细胞合成的一些蛋白，也只能经由连接伴胞细胞和筛分子的胞间连丝进入筛分子，显然这些大分子物质的分子量有的远远超过胞间连丝的SEL，而注射试验表明，这种胞间连丝的SEL至多只能提高至20kD，因此这些内源性蛋白很可能在调节韧皮部转运功能方面起重要作用[7]。很可能病毒与这些寄主蛋白互作，利用寄主蛋白提高胞间连丝的SEL，从而使病毒通过胞间连丝。由于一些病毒以核酸形式在筛分子中转运，因此韧皮部蛋白在保护vRNA中起作用。豇豆褪绿花叶病毒(CCMV)在大豆PI346304品种中的长距离转运在鞘细胞/韧皮部细胞间受阻[39]，而TEV可侵入烟草品种V20接种叶片的韧皮部细胞，但该品种可抑制TEV的系统侵染[40]。这二个试验表明，病毒长距离转运受阻是由二个不连锁的隐性位点控制，这二个基因很可能编码一些可在单一位点与病毒编码因子互作的寄主因子，从而控制长距离转运过程。另外，这些基因可能调节寄主防卫反应，从而限制病毒在韧皮部的出入。CCMV在大豆不同品种上的侵染性试验也表明CCMV的系统侵染的形成受一显性基因的控制[40]，明确这些基因性质有助于更全面地理解病毒在寄主植物的长距离转运过程中病毒——寄主互作的分子机理。
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3 病毒长距离转运过程中病毒因子与寄主因子的互作
有关寄主专化性的大量研究表明，在病毒的长距离转运中，病毒因子与寄主因子的互作是重要的。植物对某些病毒具有免疫性可能是因为这些病毒不能与植物内源性的这些可起调控作用的大分子发生有效互作[2，7]。TMV在烟草中可形成系统侵染，而CRSV则只能在接种的叶片上扩散，不能转运至植物体其它部分，用CRSV的CP置换TMV的CP后构成的重组TMV，在烟草上的长距离转运受阻，但胞间转运正常。这个现象表明，TMV的CP可能与寄主因子发生特异性互作，这种互作可能发生在维管细胞的胞间连丝中，从而使TMV能顺利进出韧皮部，用CRSV MP替换TMV MP后组成的重组TMV在烟草上的接种试验也观察到同样的现象。病毒转运受阻的现象可能是因胞间转运功能减弱的间接后果，也许是长距离转运中需特异的复合体CP-MP-vRNA与寄主因子之间发生互作[21]。RCNMV在本氏烟上系统侵染的形成比较特殊，当植株在25℃生长条件下，RCNMV的长距离转运需CP参与，而15℃时则不需。这表明CP与寄主因子互作是复杂的[17]。番茄不孕病毒(TAV)在黄瓜上不能形成系统侵染，CMV则可以，当TAV与CMV共接种到黄瓜叶片上，则发现TAV也可形成系统侵染。突变分析表明是CMV的CP辅助TAV的转运[22]，这表明病毒因子与寄主因子亲和性互作决定病毒长距离转运。对CCMV和BMV的研究表明，它们的3a蛋白决定了寄主专化性，当把二者的3a基因互换重组后在各自寄主上进行侵染性试验，重组病毒尽管可以复制和进行胞间转运，但不能在各自寄主上形成系统侵染，因此病毒因子与寄主因子互作对寄主专化性形成和长距离转运的进行都是关键的[41]。PVY病毒CP的分子生物学研究表明，CP的核心区域为病毒装配和胞间转运所必需，而N端和C端则为长距离转运所必需，这表明病毒因子与不同的寄主因子的互作决定了病毒不同的生物学功能[42]。BMV CP也与寄主专化性有关，N端7个氨基酸的缺失，BMV就不能在其寄主Chenopedium hybridum上形成系统侵染，但在雀麦上还可形成。这个试验表明，BMVCP和寄主因子在病毒长距离转运过程中都是必要的[43]。由于病毒长距离转运的二个限制环节可能在进和出筛分子的部位，因此很可能病毒因子与寄主因子的互作发生在筛分子/伴胞细胞的胞间连丝内。由于大量的植物内源性蛋白需经过位于伴胞细胞和筛分子间的胞间连丝进行运输，因此，病毒利用这些寄主蛋白促进它的转运也可能是一个重要的方面。这些寄主蛋白的参与有利于形成稳定的竞争性转运复合体，并使之有效分布到胞间连丝部位或经连丝微管实现转运。此外，位于筛管内的韧皮部蛋白可能具保护内源性mRNA的作用，因此这些蛋白在维持vRNA的稳定性方面会起一定作用。对这些可与CP或其它病毒因子发生互作并辅助病毒的长距离转运的寄主因子及其基因的分离和克隆，将有利于明确了解病毒在维管系统中转运的分子机理。
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4 病毒进出维管系统的方式
许多实验结果表明，病毒能否顺利地进出维管系统是病毒建立系统侵染的关键。病毒进入筛分子和从筛分子转移出至周围薄壁细胞是其长距离转运的二个过程，任何一个过程的阻碍均不能使病毒实现系统侵染。叶肉细胞、维管束鞘细胞、韧皮部薄壁细胞、伴胞细胞及筛分子组成了病毒进出筛管的途径，而这些细胞间的胞间连丝使得叶肉细胞及维管束内细胞间共质体系统互相连通。尽管已有报道CP可以提高维管束内细胞间胞间连丝的SEL，并且可以介导vRNA的胞间转运[42]，然而，TMV CP突变体能以胞间转运方式从叶肉细胞转运至韧皮部细胞，因此CP很可能只是在长距离转运过程中病毒通过鞘细胞/韧皮部薄壁细胞的胞间连丝转运后起作用。此外，虽然绝大多数以TMV方式进行胞间转运的病毒，其长距离转运也需CP参与，然而部分双生病毒和hordeivirus的长距离转运却是不需CP参与[7]。在病毒长距离转运中，其它病毒因子如HC-Pro等及寄主因子在辅助病毒进入韧皮部的过程中可能与CP协同或单独起作用。
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在某些属的病毒，它们具有诱导侵入细胞形成新的胞质微管的能力，以使病毒突破胞壁障碍，从而允许病毒实现胞间转运，这些病毒包括comoviruses， caulimoviruses，nepoviruses和geminiviruses部分病毒，tospoviruses。这种诱导细胞形成临时微管的能力可以使粒子以该种胞间转运的方式进入筛分子[7]。
病毒进入筛分子的另一种可能方式是CP和RNA分别独立进入筛分子，然后在筛分子中重新包装形成新的病毒粒子。由于筛分子内成分的快速转变，这个过程需要的病毒粒子装配位点可能在筛分子胞壁上胞间连丝内质网膜的外表面，一旦成熟的病毒粒子形成，它就可立即释放至在筛管内转运的汁液流中[7]。
也有人认为病毒粒子可能是被直接释放到筛管分子中。在病毒侵染过程中，由于筛分子和相应伴胞细胞及其它韧皮部细胞衰败和死亡，结果使病毒进入筛分子。尽管在该过程中可诱导一些寄主反应，使这些细胞与正常的植物共质体进行隔离，但总有机会使得这些病毒逃离这些区域进入到其它正常的筛分子中。
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对于虫媒病毒如geminiviruses和luteoviruses，通过昆虫摄食可以把病毒粒子直接注入韧皮部的筛分子，当进入筛分子后，病毒必须能从筛分子中出来并进入伴胞细胞和韧皮部薄壁细胞进行复制，在这个过程中，病毒可能需要在筛分子中脱去衣壳，病毒核酸与内源性植物MP结合从而进入伴胞细胞[7]。对新形成的粒子如何进入筛分子从而可被昆虫摄取的机制还有待明确。
病毒进入韧皮部筛分子后，在汁液流中病毒粒子及其核酸都已检测到，病毒在筛管中转运的存在方式可能是多样的，如粒子形式、核酸形式、vRNA-蛋白复合体形式等，现在还不能肯定病毒只是以一种存在方式进行转运。对病毒在筛管汁液流中存在方式的研究可能有助于明确病毒长距离转运的机制。病毒的侵染形式通过筛管汁液流的转运而扩散至植物体各部，病毒最终的位置依赖于初始侵入的叶片的位置，通常植物体下部叶片的病毒可转运至根部，而上部叶片的病毒常转运至茎尖。根据植物养分源库转换的理论，病毒的分布和侵染常在库组织，这点在CaMV和用GFP标记的马铃薯X病毒(PVX)的研究中已得到很好的证明[2，44]。病毒从筛分子中出来很可能象进入筛分子那样依赖于病毒的类型、存在的位置和寄主组织的发育状态。病毒可从筛分子中出来的一个地方是成熟筛分子与正在分化形成的新的筛分子的交接点，在这里，无论是病毒粒子还是vRNA均可通过正在形成的筛孔，使得病毒在这种未成熟的筛分子中可以复制。就DNA病毒而言，它的复制还需有细胞核的存在，而RNA病毒在这种细胞中的复制由于筛管分子分化成熟过程中，其胞内核糖体功能还能维持，因此可以正常进行[7]。此外，MP的产生也许可辅助病毒经过胞间转运侵入邻近细胞，当这样的侵入点形成后，该点就可成为新的侵染物向筛分子进入的来源，并最终形成一循环。
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对水稻黄斑驳病毒(RYMV)系统侵染的研究结果表明，该病毒可经过木质部导管胞壁上的纹孔进入导管进行转运[45]。RYMV接种水稻叶片6天后，通过Western杂交、Northern杂交及电镜观察，均发现在叶表皮细胞、叶肉细胞及维管束薄壁细胞中有该病毒分布，进一步用胞壁纤维素组成成分β-1，4-葡聚糖和抗RYMV的抗体进行免疫细胞学检测，发现二者可共定位于导管管壁的纹孔膜上。这有力地证明了导管的纹孔是RYMV的运输通道，用Ca2+破坏纹孔膜后，可促进病毒经导管进行转运的效率。这项工作的结果表明，病毒在植物体内转运的途径可能多种多样。
5 结语
由于组成维管系统的细胞的复杂性及维管束内共质体结构与功能的特殊性，使得植物病毒长距离转运研究相对比病毒在叶肉细胞间胞间转运研究要困难，病毒进入维管束鞘细胞及在维管束内的细胞间转运至最后进入筛分子，然后经筛管转运，最终由筛分子中转运出来并形成新的侵染点，整个过程涉及到的病毒与寄主互作的方式可能是多种多样的。尽管如此，因病毒结构的相对简单和较小的基因组，对涉及病毒长距离转运的病毒因子已经有了初步的了解。进一步的工作需要对连接筛分子与伴胞细胞的胞间连丝的结构、组成和功能，特别是转运大分子物质的功能作出深入的研究。同时也需对可与CP或其它非结构蛋白、病毒的非编码序列，甚至是核酸-蛋白复合体发生互作的寄主因子进行分离与鉴定。这不仅有助于增进对病毒长距离转运的分子机理的理解，也有利于明确病毒寄主专化性的分子本质。对植物病毒长距离转运过程的了解，可为将来利用基因工程手段来阻断病毒的转运过程以最终实现抗病的目的提供帮助，CmPP16[46]等基因功能的分析有力地证明，对植物病毒长距离转运机理的研究也可为植物内源性物质的转运及其在植物体内分配的调控机理的研究提供借鉴。基金项目：国家自然科学基金(39800004)
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作者简介：凌建群(1968-)男，浙江富阳人，讲师，研究方向为植物分子生物学。
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收稿日期：1998-12-29；修回日期：1999-05-20, http://www.100md.com