汉滩病毒S基因免疫小鼠的细胞免疫应答的初步观察
作者：张梦华 王航雁 杨为松 黄长形 李光玉 汪毅 白雪帆
单位：张梦华(卫生部艾滋病预防与控制中心，北京 100050)；王航雁(中国人民解放军301医院，北京 100853)；杨为松 黄长形 李光玉 汪毅 白雪帆(中国人民解放军第四军医大学唐都医院， 陕西 西安 710038)
关键词：汉滩病毒；基因免疫；S片段编码区基因；细胞毒性T淋巴细胞
病毒学报000306 摘要：将汉滩病毒S片段编码区基因插入到含CMV启动子/增强子(promoter/enhancer)的真核表达载体pVR1012中，构建成真核表达质粒pVRS22。质粒DNA经纯化后，注射经布比卡因预处理的Balb/c小鼠的股四头肌，多次免疫后，免疫小鼠淋巴细胞增殖功能的检测结果显示：免疫鼠的脾细胞能够对体外抗原刺激产生增殖反应；CTL活性检测结果表明：靶细胞51Cr的释放是效应细胞依赖性的，并且与病毒感染组的淋巴细胞的细胞毒活性相似。结果显示，用重组质粒pVRS22免疫小鼠，能够诱导小鼠产生特异性淋巴细胞增殖反应和细胞毒性T淋巴细胞活性(CTL)。
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中图分类号：R373.3+2 文献标识码：A
文章编号：1000-8721(2000)03-0219-04
Plasmid DNA Expressing Hantaan Virus S Gene Induces Cellular Immunity Responses in Mice
ZHANG Meng-hua
(National Center for AIDS Prevention and Control, Ministry of Health， Beijing 100050, China)
WANG Hang-yan
(301th Hospital of PLA, Beijing 100853, China)
, 百拇医药
YANG Wei-song，HUANG Chang-xing，LI Guang-yu，WANG Yi，BAI Xue-fan
(Tangdu Hospital of the 4 th Military University of PLA, Xi'an 710038, China)
Abstract: Hantaan virus S segment coding region gene was inserted into the eukaryotic expression vector pVR1012 under the control of cytomegalovirus (CMV) promoter/enhancer. The recombinant plasmid DNA, designated as pVRS22 were purified with PEG. Then Balb/c mice were immunized with purified pVRS22 by intramuscular injection at intervals of three weeks for 9 weeks. The lymphoproliferative responses of spleen cells from pVRS22 plasmid injected mice clearly showed that these cells were able to proliferate in the presence of Hantaan virus. The CTL activities of spleen cells from pVRS22 DNA-vaccinated mice were tested with different effector to target ratios. The results demonstrated that the release of chromium from target cells was an effector cell depended phenomenon and were similar to the CTL activities of mice infected with Hantaan virus. Our results showed that specific cell mediated immunity responses were elicited in the pVRS22 vaccinated mice. The lymphoproliferative responses and CTL activity of spleen cells from pVRS22 plasmid vaccinated mice were significant and successful.
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Key words: Hantaan virus; gene immunization; S segment coding region gene; cytotoxicT lymphocyte (CTL) ; recombinant plasmid
肾综合征出血热(HFRS)是一类由汉坦病毒[1]引起的以发热、出血和急性肾功能损伤为特征的急性传染病。目前HFRS在全球的流行有发展扩大的趋势，并不断有新的血清型和新的宿主动物被发现，因此，HFRS疫苗对于控制HFRS病毒感染和疾病的发生具有重要意义。汉滩病毒核蛋白由S基因编码，由于核蛋白能够诱导保护性细胞免疫应答[2]，因此在保护机体免受汉滩病毒感染、清除病毒等方面具有与糖蛋白(诱导中和抗体)同样重要的意义，所以核蛋白作为汉滩病毒疫苗的重要组成部分，受到广泛重视。
90年代初，DNA免疫研究获得成功[3]，为传统的疫苗研究开辟了新的领域。DNA免疫是以DNA质粒直接接种于体内，目的基因经表达、翻译成蛋白质，进而诱导机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫的过程。DNA免疫具有操作简单、费用低廉、免疫效果全面等特点，因此正成为当今疫苗研究的热点。特别是DNA免疫在流感病毒、HIV、HBV[4-6]等病原研究方面的成功资料，也为汉滩病毒DNA疫苗的研究提供了经验。本文应用含汉滩病毒S片段编码区基因的重组真核表达质粒pVRS22免疫小鼠，对免疫小鼠的细胞免疫应答(脾细胞的淋巴细胞增殖功能和CTL活性)进行了初步研究。
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材料与方法
1 质粒和宿主菌 质粒pBVS22为汉滩病毒核蛋白原核表达质粒，含汉滩病毒S片段编码区基因，由本室黄长形博士惠赠[7]。质粒pVR1012由美国Vical公司惠赠，为含有CMV启动子/增强子的真核表达载体。宿主菌TG1由本室保存。
2 酶与试剂 限制性内切酶、T4DNA连接酶购自Promega公司、Boehringer Mannheim公司及华美生物工程公司。MEM培养基为美国Gibco产品。小牛血清为杭州四季青产品。L-谷氨酰胺为美国Sigma产品。3H-胸腺嘧啶核苷(3H-thymidine，简称3H-TdR)购自中国原子能科学研究院同位素研究所。Na251CrO4(酪酸钠)为美国杜邦公司产品。
3 动物 Balb/c(H-2d)纯系小白鼠，雌性，6～8周，由第四军医大学实验动物中心提供。
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4 pVRS22质粒DNA的制备、纯化和免疫小鼠 pVRS22质粒的构建及大量制备均按《分子克隆》[8]进行，经PEG纯化，作为免疫用DNA。动物免疫按文献[9]进行。实验组小鼠被分成3组，每组5只，先在小鼠股四头肌注射100μl含0.25%的布比卡因(bupivacaine)和0.1%的对羟基苯甲酸甲酯(methylparaban)做预处理，24h后，按100μg剂量接种pVRS22质粒及空白载体pVR1012，每隔3周加强免疫1次，共免疫3次，每次免疫均按上述同样程序进行。每次免疫前，采小鼠尾静脉血，留血清用于汉滩病毒抗体的检测(见另文)。阳性对照以汉滩病毒A9株腹腔免疫小鼠，每只10-6稀释的汉滩病毒A9株感染乳鼠的鼠脑悬液0.02ml，3周后加强注射1次。阳性对照组、阴性对照组(为不进行任何免疫的正常小鼠)和空载体组均为5只。小鼠经最后一次免疫后10天，取脾淋巴细胞，测定特异性T淋巴细胞增殖及细胞毒T淋巴细胞杀伤功能(CTL)。
5 免疫小鼠特异性淋巴细胞增殖功能的检测 应用3H-TdR掺入法对免疫小鼠的淋巴细胞增殖功能进行检测。按文献[10]进行。无菌分离每只免疫动物的脾淋巴细胞，经无菌尼龙毛柱分离T淋巴细胞。用10%FCS的MEM培养基将细胞浓度调至107/ml，以100μl/孔加入96孔板内，并同时加入30μl 10-6稀释的紫外灭活的汉滩病毒感染的乳鼠鼠脑悬液作为抗原体外刺激，每份样品做3复孔，37℃5%CO2培养72h后，每孔加入3H-TdR 2μl(1μci/2μl)，继续孵育12h，收集样品于滤膜上，烘干，浸于闪烁液中，于Backman β液闪仪计数，增殖水平直接用cpm表示，增殖指数以SI＝
来表示。各组以每份标本平均值±标准差(SD)进行统计学处理，以每组最终的平均值±SD作为结果。
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6 免疫小鼠细胞毒T淋巴细胞杀伤功能检测(CTL试验) 采用4h 51Cr释放试验检测，参照文献[11]如下：将分离的1×107淋巴细胞与5×105个病毒感染的同系小鼠的巨噬细胞，37℃ 5%CO2培养5天，使淋巴细胞活化，此即为效应细胞。
以0.5PFU/细胞的汉滩病毒A9株感染同系Balb/c小鼠的腹腔渗出细胞(PECs)，培养5天，IFA染色，80%～100%的PEC细胞含有病毒抗原时，用胰酶消化，用MEM调细胞浓度为4×106/ml，取0.5ml细胞，加入100μci Na251CrO4，37℃孵育2h进行标记，此即为51Cr标记的靶细胞。将靶细胞悬液加入96孔培养板中，每孔100μl，设3复孔，以不同比例加入效应细胞，每孔加入100μl，最大释放组加入100μl 1% Triton X-100，自然释放组加入100μl培养基。37℃5%CO2培养4h。每孔取100μl上清，γ计数仪测cpm值。结果以CTL杀伤率表示，各组以每份标本平均值±SD进行统计学处理，以每组最终的平均值作为结果。
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结 果
1 pVRS22重组质粒的构建
真核表达载体pVR1012经PstⅠ酶切，Klenow酶补平，SalⅠ酶切，回收大片段，即为载体片段。pBVS22经EcoRⅠ酶切，Klenow酶补平，SalⅠ酶切，回收小片段，两个回收片段经平-粘连接，获重组质粒pVRS22(图1)。酶切鉴定分析见图2。
2 免疫小鼠淋巴细胞增殖功能检测结果
pVRS22实验组、空载体pVR1012组、A9株感染组的脾细胞体外用紫外灭活的汉滩病毒A9株进行刺激。正常小鼠的脾细胞用未经感染的同系小白鼠脾细胞进行刺激。体外刺激后48h、72h、96h分别测定其脾细胞的3H-TdR掺入水平(cpm)，结果以每组小鼠平均cpm值±SD来表示(图3)，另计算其刺激指数，刺激指数＝实验组cpm值/正常对照cpm值。体外刺激后不同时限的刺激指数见图4。
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3 特异性细胞毒T淋巴细胞功能检测结果 从图5可以看出：随着E：T比值的增大，效应细胞对靶细胞的杀伤力也增大。汉滩病毒A9株感染鼠在E：T为100时其杀伤率为77.5%±3.4%，而pVRS22质粒免疫鼠为62.1%±2.31%，空白载体pVR1012组几乎无杀伤活性。从中可以看出，pVRS22质粒免疫鼠具有较好的杀伤活性。
图1 pVRS22质粒构建图
Figure 1 Construction of the pVRS22 expression plasmid
图2 pVRS22重组质粒限制性内切酶酶切分析
Figure 2 The restriction analysis of pVRS22 recombinant plasmid
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1.pBR322/MsPI marker，2.BamHⅠ，3.PstⅠ/SalⅠ，4.HindⅢ，5.PvuⅡ，6.λDNA/HindⅢ marker.
图3 淋巴细胞增殖功能检测
Figure 3 Detection of lymphoproliferation response
图4 淋巴细胞增殖功能检测
Figure 4 Detection of lymphoproliferation response
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图5 不同E：T比值测定的实验鼠CTL特异杀伤结果
Figure 5 The specific CTL activity of experimental mice detected by defferent E：T ratio
讨 论
CD8+T细胞作为细胞毒性T淋巴细胞，在识别位于保守部位的内源性病毒蛋白的抗原表位的同时，与有核细胞(包括专业APC)表面的MHCⅠ类分子结合，激活后增殖分化为特异性的细胞毒T淋巴细胞，以溶解杀伤病毒感染细胞，清除体内病毒。汉滩病毒的核蛋白作为内源性细胞内抗原，其抗原性极强，用核蛋白免疫动物，被免疫动物对病毒攻击有很好的保护作用[2，11]。Asada[11]、詹发先[12]等先后研究发现，不同血清型肾综合征出血热病毒免疫后产生的CTL之间存在有交叉免疫反应，同型不同株之间有较多的CTL识别位点，两型毒株间也有共同的CTL识别位点，核蛋白的这些特性，为研究核蛋白的免疫保护作用提供了重要理论依据。
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我们将编码核蛋白(NP)抗原的基因-S片段编码区克隆至一真核表达载体pVR1012中，构建了NP DNA重组表达质粒pVRS22，以此DNA疫苗多次免疫小鼠后，分别测定了免疫小鼠的淋巴细胞的增殖功能及杀伤活性，结果获得了有意义的细胞免疫应答水平。
免疫小鼠淋巴细胞增殖功能测定的结果显示，其增殖水平接近汉滩病毒A9株病毒感染小鼠，在一定的时限内，增殖水平与细胞培养时间成正比。而空白载体pVR1012免疫鼠的淋巴细胞并不对体外抗原的再刺激发生增殖。这一结果提示：pVRS22 DNA质粒免疫小鼠的淋巴细胞具有较好的增殖活性。
对免疫组淋巴细胞杀伤功能的检测得出了同样有意义的结果，在免疫组15只免疫小鼠中，除1只小鼠未测到明显的杀伤活性外，其余14只小鼠均可测得不同程度的杀伤活性，其效-靶比例的平均杀伤百分率略低于汉滩病毒A9株感染组小鼠，而且靶细胞51Cr的释放具有效应细胞依赖现象，随着效应细胞绝对数的增加，其杀伤率也增加。而pVR1012空载体免疫组几乎未测出有杀伤活性。这一结果表明我们所构建的NP DNA疫苗多次免疫小鼠后，核蛋白不仅在体内得到表达，而且诱导产生了由CD8+T细胞介导的CTL活性。
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我们首次应用DNA免疫技术成功地诱导小鼠产生了针对汉滩病毒核蛋白的CD8+T细胞介导的细胞免疫。进一步评价免疫效果的被动保护试验等方面的研究正在进行之中，有望为今后汉滩病毒其它抗原的基因免疫研究提供更多的依据，也希望能为今后肾综合征出血热疫苗的研究提供一条新的途径。
作者简介：张梦华(1960-)，女，山西太原人，博士，现在中国预防医学科学院艾滋病预防与控制中心做博士后研究，研究方向为HIV-1感染者及艾滋病患者药物治疗前后药物抗药性的产生。
参考文献：
[1] Lee H W, Lee P W, Johnson K M, et al. Isolation of the etiologic agent of Korean Hemorrhagic Fever [J] . J Infect Dis, 1978, 137 (3) : 298-308.
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[2] Yoshimatsu K, Yco Y C, Yoshida R, et al. Protective immunity of hantaan virus nucleocapsid and envelope protein studied using baculovirus expressed proteins [J] . Arch Virol, 1993, 130: 365-376.
[3] Wolff J A, Malone R W, Williams P, et al. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo [J] . Science, 1990, 247: 1465-1468.
[4] Ulmer J B, Donnelly J J, Parker S E, et al. Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein [J] . Science, 1993, 259: 1745-1749.
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[5] Wang B, Ugn K E, Srikntn V, et al. Gene inoculation generates immune responses against human immunodeficiency virus type 1 [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90: 4156-4160.
[6] Davis H L, Michel M L, Mancini M, et al. Direct gene transfer in skeletal muscle: plasmid DNA-based immunization against the hepatitis B virus surface antigen [J] . Vaccine, 1994, 12: 1503-1509.
[7] 黄长形，李盈盈，杨为松，等.肾综合征出血热病毒核蛋白在大肠杆菌中的表达及其产物的初步应用[J].中华传染病杂志，1996，4(1)：28-31.
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[8] J.萨姆布鲁克 J，弗里奇E F，曼尼阿蒂斯 T.分子克隆[M].第2版. 北京：科学出版社，1992.
[9] DecK R R, Dewittt C M, Donnelly J J, et al. Charaterization of humoral immune responses induced by an influenza hemagglutinin DNA vaccine [J] . Vaccine, 15 (1) : 71-78.
[10] 金伯泉，李恩善，等.医学基础免疫学实验指导[M].1993，12：80.
[11] Asada H, Tamura M, Kondo K, et al. Cell mediated immunity to virus causing haemorrhagic fever with renal syndrome: generation of cytotoxic T lymphocytes [J] . J Gen Virol, 1988, 69: 2179-2188.
[12] 詹发先，宋干，杭长寿，等.流行性出血热感染鼠的细胞毒T细胞功能中性红比色[J].病毒学报，1992，8(3)：234-238.
[13] Paul W E. Pleiotropy and Redundancy: T cell-derived lymphokines in the immune response [J] . Cell, 1989, 57: 521-524.
收稿日期：1999-06-28；修回日期：1999-11-10, 百拇医药
单位：张梦华(卫生部艾滋病预防与控制中心，北京 100050)；王航雁(中国人民解放军301医院，北京 100853)；杨为松 黄长形 李光玉 汪毅 白雪帆(中国人民解放军第四军医大学唐都医院， 陕西 西安 710038)
关键词：汉滩病毒；基因免疫；S片段编码区基因；细胞毒性T淋巴细胞
病毒学报000306 摘要：将汉滩病毒S片段编码区基因插入到含CMV启动子/增强子(promoter/enhancer)的真核表达载体pVR1012中，构建成真核表达质粒pVRS22。质粒DNA经纯化后，注射经布比卡因预处理的Balb/c小鼠的股四头肌，多次免疫后，免疫小鼠淋巴细胞增殖功能的检测结果显示：免疫鼠的脾细胞能够对体外抗原刺激产生增殖反应；CTL活性检测结果表明：靶细胞51Cr的释放是效应细胞依赖性的，并且与病毒感染组的淋巴细胞的细胞毒活性相似。结果显示，用重组质粒pVRS22免疫小鼠，能够诱导小鼠产生特异性淋巴细胞增殖反应和细胞毒性T淋巴细胞活性(CTL)。
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中图分类号：R373.3+2 文献标识码：A
文章编号：1000-8721(2000)03-0219-04
Plasmid DNA Expressing Hantaan Virus S Gene Induces Cellular Immunity Responses in Mice
ZHANG Meng-hua
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WANG Hang-yan
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YANG Wei-song，HUANG Chang-xing，LI Guang-yu，WANG Yi，BAI Xue-fan
(Tangdu Hospital of the 4 th Military University of PLA, Xi'an 710038, China)
Abstract: Hantaan virus S segment coding region gene was inserted into the eukaryotic expression vector pVR1012 under the control of cytomegalovirus (CMV) promoter/enhancer. The recombinant plasmid DNA, designated as pVRS22 were purified with PEG. Then Balb/c mice were immunized with purified pVRS22 by intramuscular injection at intervals of three weeks for 9 weeks. The lymphoproliferative responses of spleen cells from pVRS22 plasmid injected mice clearly showed that these cells were able to proliferate in the presence of Hantaan virus. The CTL activities of spleen cells from pVRS22 DNA-vaccinated mice were tested with different effector to target ratios. The results demonstrated that the release of chromium from target cells was an effector cell depended phenomenon and were similar to the CTL activities of mice infected with Hantaan virus. Our results showed that specific cell mediated immunity responses were elicited in the pVRS22 vaccinated mice. The lymphoproliferative responses and CTL activity of spleen cells from pVRS22 plasmid vaccinated mice were significant and successful.
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Key words: Hantaan virus; gene immunization; S segment coding region gene; cytotoxicT lymphocyte (CTL) ; recombinant plasmid
肾综合征出血热(HFRS)是一类由汉坦病毒[1]引起的以发热、出血和急性肾功能损伤为特征的急性传染病。目前HFRS在全球的流行有发展扩大的趋势，并不断有新的血清型和新的宿主动物被发现，因此，HFRS疫苗对于控制HFRS病毒感染和疾病的发生具有重要意义。汉滩病毒核蛋白由S基因编码，由于核蛋白能够诱导保护性细胞免疫应答[2]，因此在保护机体免受汉滩病毒感染、清除病毒等方面具有与糖蛋白(诱导中和抗体)同样重要的意义，所以核蛋白作为汉滩病毒疫苗的重要组成部分，受到广泛重视。
90年代初，DNA免疫研究获得成功[3]，为传统的疫苗研究开辟了新的领域。DNA免疫是以DNA质粒直接接种于体内，目的基因经表达、翻译成蛋白质，进而诱导机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫的过程。DNA免疫具有操作简单、费用低廉、免疫效果全面等特点，因此正成为当今疫苗研究的热点。特别是DNA免疫在流感病毒、HIV、HBV[4-6]等病原研究方面的成功资料，也为汉滩病毒DNA疫苗的研究提供了经验。本文应用含汉滩病毒S片段编码区基因的重组真核表达质粒pVRS22免疫小鼠，对免疫小鼠的细胞免疫应答(脾细胞的淋巴细胞增殖功能和CTL活性)进行了初步研究。
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材料与方法
1 质粒和宿主菌 质粒pBVS22为汉滩病毒核蛋白原核表达质粒，含汉滩病毒S片段编码区基因，由本室黄长形博士惠赠[7]。质粒pVR1012由美国Vical公司惠赠，为含有CMV启动子/增强子的真核表达载体。宿主菌TG1由本室保存。
2 酶与试剂 限制性内切酶、T4DNA连接酶购自Promega公司、Boehringer Mannheim公司及华美生物工程公司。MEM培养基为美国Gibco产品。小牛血清为杭州四季青产品。L-谷氨酰胺为美国Sigma产品。3H-胸腺嘧啶核苷(3H-thymidine，简称3H-TdR)购自中国原子能科学研究院同位素研究所。Na251CrO4(酪酸钠)为美国杜邦公司产品。
3 动物 Balb/c(H-2d)纯系小白鼠，雌性，6～8周，由第四军医大学实验动物中心提供。
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4 pVRS22质粒DNA的制备、纯化和免疫小鼠 pVRS22质粒的构建及大量制备均按《分子克隆》[8]进行，经PEG纯化，作为免疫用DNA。动物免疫按文献[9]进行。实验组小鼠被分成3组，每组5只，先在小鼠股四头肌注射100μl含0.25%的布比卡因(bupivacaine)和0.1%的对羟基苯甲酸甲酯(methylparaban)做预处理，24h后，按100μg剂量接种pVRS22质粒及空白载体pVR1012，每隔3周加强免疫1次，共免疫3次，每次免疫均按上述同样程序进行。每次免疫前，采小鼠尾静脉血，留血清用于汉滩病毒抗体的检测(见另文)。阳性对照以汉滩病毒A9株腹腔免疫小鼠，每只10-6稀释的汉滩病毒A9株感染乳鼠的鼠脑悬液0.02ml，3周后加强注射1次。阳性对照组、阴性对照组(为不进行任何免疫的正常小鼠)和空载体组均为5只。小鼠经最后一次免疫后10天，取脾淋巴细胞，测定特异性T淋巴细胞增殖及细胞毒T淋巴细胞杀伤功能(CTL)。
5 免疫小鼠特异性淋巴细胞增殖功能的检测 应用3H-TdR掺入法对免疫小鼠的淋巴细胞增殖功能进行检测。按文献[10]进行。无菌分离每只免疫动物的脾淋巴细胞，经无菌尼龙毛柱分离T淋巴细胞。用10%FCS的MEM培养基将细胞浓度调至107/ml，以100μl/孔加入96孔板内，并同时加入30μl 10-6稀释的紫外灭活的汉滩病毒感染的乳鼠鼠脑悬液作为抗原体外刺激，每份样品做3复孔，37℃5%CO2培养72h后，每孔加入3H-TdR 2μl(1μci/2μl)，继续孵育12h，收集样品于滤膜上，烘干，浸于闪烁液中，于Backman β液闪仪计数，增殖水平直接用cpm表示，增殖指数以SI＝
来表示。各组以每份标本平均值±标准差(SD)进行统计学处理，以每组最终的平均值±SD作为结果。, http://www.100md.com
6 免疫小鼠细胞毒T淋巴细胞杀伤功能检测(CTL试验) 采用4h 51Cr释放试验检测，参照文献[11]如下：将分离的1×107淋巴细胞与5×105个病毒感染的同系小鼠的巨噬细胞，37℃ 5%CO2培养5天，使淋巴细胞活化，此即为效应细胞。
以0.5PFU/细胞的汉滩病毒A9株感染同系Balb/c小鼠的腹腔渗出细胞(PECs)，培养5天，IFA染色，80%～100%的PEC细胞含有病毒抗原时，用胰酶消化，用MEM调细胞浓度为4×106/ml，取0.5ml细胞，加入100μci Na251CrO4，37℃孵育2h进行标记，此即为51Cr标记的靶细胞。将靶细胞悬液加入96孔培养板中，每孔100μl，设3复孔，以不同比例加入效应细胞，每孔加入100μl，最大释放组加入100μl 1% Triton X-100，自然释放组加入100μl培养基。37℃5%CO2培养4h。每孔取100μl上清，γ计数仪测cpm值。结果以CTL杀伤率表示，各组以每份标本平均值±SD进行统计学处理，以每组最终的平均值作为结果。
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结 果
1 pVRS22重组质粒的构建
真核表达载体pVR1012经PstⅠ酶切，Klenow酶补平，SalⅠ酶切，回收大片段，即为载体片段。pBVS22经EcoRⅠ酶切，Klenow酶补平，SalⅠ酶切，回收小片段，两个回收片段经平-粘连接，获重组质粒pVRS22(图1)。酶切鉴定分析见图2。
2 免疫小鼠淋巴细胞增殖功能检测结果
pVRS22实验组、空载体pVR1012组、A9株感染组的脾细胞体外用紫外灭活的汉滩病毒A9株进行刺激。正常小鼠的脾细胞用未经感染的同系小白鼠脾细胞进行刺激。体外刺激后48h、72h、96h分别测定其脾细胞的3H-TdR掺入水平(cpm)，结果以每组小鼠平均cpm值±SD来表示(图3)，另计算其刺激指数，刺激指数＝实验组cpm值/正常对照cpm值。体外刺激后不同时限的刺激指数见图4。
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3 特异性细胞毒T淋巴细胞功能检测结果 从图5可以看出：随着E：T比值的增大，效应细胞对靶细胞的杀伤力也增大。汉滩病毒A9株感染鼠在E：T为100时其杀伤率为77.5%±3.4%，而pVRS22质粒免疫鼠为62.1%±2.31%，空白载体pVR1012组几乎无杀伤活性。从中可以看出，pVRS22质粒免疫鼠具有较好的杀伤活性。
图1 pVRS22质粒构建图
Figure 1 Construction of the pVRS22 expression plasmid
图2 pVRS22重组质粒限制性内切酶酶切分析
Figure 2 The restriction analysis of pVRS22 recombinant plasmid
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1.pBR322/MsPI marker，2.BamHⅠ，3.PstⅠ/SalⅠ，4.HindⅢ，5.PvuⅡ，6.λDNA/HindⅢ marker.
图3 淋巴细胞增殖功能检测
Figure 3 Detection of lymphoproliferation response
图4 淋巴细胞增殖功能检测
Figure 4 Detection of lymphoproliferation response
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图5 不同E：T比值测定的实验鼠CTL特异杀伤结果
Figure 5 The specific CTL activity of experimental mice detected by defferent E：T ratio
讨 论
CD8+T细胞作为细胞毒性T淋巴细胞，在识别位于保守部位的内源性病毒蛋白的抗原表位的同时，与有核细胞(包括专业APC)表面的MHCⅠ类分子结合，激活后增殖分化为特异性的细胞毒T淋巴细胞，以溶解杀伤病毒感染细胞，清除体内病毒。汉滩病毒的核蛋白作为内源性细胞内抗原，其抗原性极强，用核蛋白免疫动物，被免疫动物对病毒攻击有很好的保护作用[2，11]。Asada[11]、詹发先[12]等先后研究发现，不同血清型肾综合征出血热病毒免疫后产生的CTL之间存在有交叉免疫反应，同型不同株之间有较多的CTL识别位点，两型毒株间也有共同的CTL识别位点，核蛋白的这些特性，为研究核蛋白的免疫保护作用提供了重要理论依据。
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我们将编码核蛋白(NP)抗原的基因-S片段编码区克隆至一真核表达载体pVR1012中，构建了NP DNA重组表达质粒pVRS22，以此DNA疫苗多次免疫小鼠后，分别测定了免疫小鼠的淋巴细胞的增殖功能及杀伤活性，结果获得了有意义的细胞免疫应答水平。
免疫小鼠淋巴细胞增殖功能测定的结果显示，其增殖水平接近汉滩病毒A9株病毒感染小鼠，在一定的时限内，增殖水平与细胞培养时间成正比。而空白载体pVR1012免疫鼠的淋巴细胞并不对体外抗原的再刺激发生增殖。这一结果提示：pVRS22 DNA质粒免疫小鼠的淋巴细胞具有较好的增殖活性。
对免疫组淋巴细胞杀伤功能的检测得出了同样有意义的结果，在免疫组15只免疫小鼠中，除1只小鼠未测到明显的杀伤活性外，其余14只小鼠均可测得不同程度的杀伤活性，其效-靶比例的平均杀伤百分率略低于汉滩病毒A9株感染组小鼠，而且靶细胞51Cr的释放具有效应细胞依赖现象，随着效应细胞绝对数的增加，其杀伤率也增加。而pVR1012空载体免疫组几乎未测出有杀伤活性。这一结果表明我们所构建的NP DNA疫苗多次免疫小鼠后，核蛋白不仅在体内得到表达，而且诱导产生了由CD8+T细胞介导的CTL活性。
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我们首次应用DNA免疫技术成功地诱导小鼠产生了针对汉滩病毒核蛋白的CD8+T细胞介导的细胞免疫。进一步评价免疫效果的被动保护试验等方面的研究正在进行之中，有望为今后汉滩病毒其它抗原的基因免疫研究提供更多的依据，也希望能为今后肾综合征出血热疫苗的研究提供一条新的途径。
作者简介：张梦华(1960-)，女，山西太原人，博士，现在中国预防医学科学院艾滋病预防与控制中心做博士后研究，研究方向为HIV-1感染者及艾滋病患者药物治疗前后药物抗药性的产生。
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收稿日期：1999-06-28；修回日期：1999-11-10, 百拇医药