EB病毒DNA聚合酶基因的表达与纯化及其在鼻咽癌病人诊断中的应用
作者：唐慰萍 黄滨 李伯军 周为民 皮国华 谷淑燕
单位：唐慰萍(广东医学院病理教研室 湛江 524023)；黄滨 李伯军 周为民 皮国华 谷淑燕(中国预防医学科学院病毒学研究所 北京 100052)
关键词：EB病毒；DNA聚合酶；诊断；鼻咽癌
病毒学报000314 摘要 以Epstein-Barr病毒(EBV)DNA聚合酶为抗原，建立了简便、快速、敏感和特异的鼻咽癌诊断方法。构建原核表达载体pRSET-DNA聚合酶及其亚克隆pRSET-A1和pRSET-A2，在BL21(DE3)中表达的产物，经Western-blot检测其抗原性并用于检测鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)病人血清中的抗体。在NPC病人血清中存在抗EB病毒DNA聚合酶的IgG抗体，并证明DNA聚合酶的抗原性主要集中于后2/3片段(A2)上。Western-bolt检测A2/IgG抗体的敏感性和特异性分别为80%和100%。对46份NPC病人血清和46份非NPC头颈癌症病人血清，用ELISA检测A2/IgA，敏感度为89%，特异度为93%。初步建立了ELISA检测NPC病人血清中A2/IgG抗体的方法，获得较高的敏感性和特异性。
, 百拇医药
中图分类号：R373；R739.63 文献标识码：A
文章编号：1000-8721(2000)03-0258-04
Study on the Expression and Purification of Epstein-Barr Virus DNA
Polymerase and Its Application to Diagnosis of Nasopharyngeal Carcinoma
HUANG Bin，LI Bo-jun，ZHOU Wei-min，PI Guo-hua，TANG Wei-ping，GU Shu-yan
(Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052, China)
, 百拇医药
Abstract: In order to establish a simple, rapid, sensitive and specific assay for diagnosis of nasopharyngeal carcinoma (NPC), we prepard Epstein-Barr virus (EBV) DNA polymerase antigen by genetic engineering. DNA polymerase was expressed in BL21(DE3) using pRSET vector. The expressed product was characterized by SDS-PAGE and Western-blot. The IgG antibody angainst DNA polymerase of EBV in sera of NPC patients can be testified by expressed DNA polymerase through Western-blot and ELISA. The DNA polymerase is divided into the front 1/3 and the last 2/3 A2 parts, on A2 the antigenicity of DNA ploymerase locates. The sensitivity and specificity of Western-blot for detecting A2/IgG antibody was 80% and 100% respectively. The ELISA test established to detect A2/IgG antibody in sera of 46 NPC patients and 46 non-NPC patients also showed high sensitivity (89%) and specificity (93%).
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Key words: Epstein-Barr virus; DNA polymerase; diagnosis; nasopharyngeal carcinoma
EB病毒与鼻咽癌(NPC)关系密切[1]。通过检测EB病毒抗体以早期诊断NPC是提高NPC病人存活率的重要手段[2]。用基因工程手段表达和纯化的蛋白和多肽为抗原，建立简便、快速、灵敏、特异的诊断方法，是目前NPC诊断的主要发展方向。例如DNA聚合酶，是由EB病毒BamHI A片段左向的第五个阅读框编码(BALF5)，基因大小为3kb，编码蛋白的分子量约110kD，是EB病毒DNA复制的关键性酶。DNA聚合酶的诊断意义已被Liu[3]等以酶中和反应证明，高滴度的EB病毒DNA聚合酶IgG抗体，早在Ⅰ期NPC病人血清中被检测到。我们采用基因重组技术在大肠杆菌表达DNA聚合酶全基因及部份基因，用纯化的表达产物作为抗原检测NPC病人血清中抗体，建立了敏感、特异的诊断方法。
, 百拇医药
材料与方法
1 质粒和菌株 质粒pRTS-21含有DNA聚合酶全基因，由王轶龙惠赠。pRSET-b、pRSET-a原核表达载体由我所肝炎室惠赠，为T7启动子控制下的融合蛋白原核表达载体。在融合蛋白的N末端含有6个连续的组氨酸标签。菌株BL21(DE3)为该载体的表达宿主菌。
2 NPC病人、头颈部非NPC病人和正常人的血清 均由广东医学院病理教研室提供。
3 其它试剂 限制性内切酶和T4连接酶均购自New England Biolabs公司。Taq酶购自六合通公司。DNA回收试剂盒QIAXⅡ购自QIAGEN公司。
4 DNA聚合酶基因的PCR扩增 根据DNA聚合酶基因序列设计PCR扩增的上下游引物。上游引物：5＇CGGAATTCATGTCTGGGGGACTCTTCTATAAC3＇；下游引物为：5＇CCCAAGCTTTTAGAATGGTGGCCGCGCTGTTAA3＇。以pRTS21质粒为模板做PCR扩增DNA聚合酶基因。PCR扩增过程：94℃变性2min，然后94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，30个循环，最后一个循环94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 5min。PCR产物以酚：氯仿抽提，乙醇沉淀，晾干后用去离子水溶解。
, 百拇医药
5 IFA方法检测VCA/IgA、EA/IgA 具体操作方法见参考文献[4]。
6 Western-blot方法 具体操作方法见参考文献[5]
7 重组蛋白的表达与纯化 将含有重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)接种于Amp+的LB培养基中，37℃振荡至OD600达1的时候，加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续培养5h，4℃ 5 000r/min离心15min收获细菌。超声裂解细菌，用4mol/L尿素洗涤包涵体，8mol/L尿素溶解包涵体。以Ni2+亲和层析，按Pharmacia Chelating Sepharose Fast Flow使用手册所述方法纯化蛋白。
8 ELISA 以纯化后的蛋白按50ng/孔包被ELISA板，4℃过夜，用洗涤液(PBS 0.1mol/L pH7.4，0.05%Tween20)洗涤2次，封闭液为含10%牛血清的PBS，37℃湿盒孵育2h，洗涤3次，每孔加1∶100稀释的血清100μl，37℃湿盒卵育1h，洗涤3次，每孔加入100μl 1∶1000稀释的抗人IgG酶标抗体，37℃湿盒孵育1h，洗涤3次，TMB底物显色，4mol/L H2SO4终止反应，于酶标仪上测定其450nm处的吸光值，结果测定以OD值＝(OD值-空白孔OD值)/(阴性孔值-空白孔值)≥1.5为阳性。
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结 果
1 DNA聚合酶基因的扩增及重组表达载体的构建
扩增后的DNA聚合酶的PCR产物与不加模板DNA的阴性对照进行琼脂糖电泳。聚合酶PCR产物在3kb左右有一条扩增条带。片段大小与DNA聚合酶基因相符(图1)。将DNA聚合酶全基因PCR扩增产物以Eco RⅠ与HindⅢ酶切后，插入pRSET-b上相应的酶切位点，转化大肠杆菌JM109，挑选重点克隆经酶切鉴定(图2)。构建成的pRSET-DNA聚合酶(pRSET-A)以EcoRⅠ SalⅠ酶切后纯化回收1kb片段的前1/3，插入pBV220载体构建pBV-A1(DNA聚合酶前1/3部分)过渡载体，再以EcoRⅠ和HindⅢ酶切pBV-A1，回收1kb的前1/3片段，插入pRSET-b载体构建成pRSET-A1表达载体。以XhoⅠ和HindⅢ酶切pRSET-A，纯化回收2kb的DNA聚合酶的后2/3片段，插入pRSET-a载体，构建pRSET-A2(DNA聚合酶后2/3部分)表达载体。
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图1 PCR扩增DNA聚合酶基因1%
琼脂糖凝胶电泳结果
Figure 1 1% agarose gel electrophoresis of DNA polymerase gene amplified by PCR
1.PCR product；2.Negative control；3.λDNA/HindⅢ marker.
2 pRSET-DNA聚合酶，表达及特异性
将重组质粒转化BL-21(DE3)细菌，挑选单克隆，接种5ml含Amp的LB培养液，猛烈振荡至OD600为1，此时加入IPTG(1mmol/L)诱导4h，将诱导前与诱导后4h的菌样空载体对照进行SDS-PAGE。pRSET-A在诱导后于110kD左右出现一条表达带，分子量与DNA聚合酶相近(图3)；pRSET-A1在30kD处出现一条新的表达带，分子量与pRSET-A1(DNA聚合酶前1/3部分)相近；pRSET-A2在70kD处出现一条新的表达带，分子量与pRSET-A2(DNA聚合酶2/3部分)相近(图4)。将IPTG诱导后的含pRSET-A和A2经SDS-PAGE和Western-blot分析，结果表明，pRSET-A与NPC病人血清孵育出现一条明显条带，A1无明显阳性条带出现。说明DNA聚合酶的抗原特异性，并且后2/3部分具有足够强的反应特异性。
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图2 pRSET-A重组质粒构建及酶切图谱
Figure 2 Restriction map of recombinant plasmid pRSET-DNA polymerase
1.λDNA/HindⅢ marker； 2.pRSET； 3.HindⅢ； 4.EcoRⅠ； 5.HindⅢ+EcoRⅠ； 6.BamHⅠ+HindⅢ； 7.BamHⅠ； 8.SmaⅠ； 9.PstⅠ； 10.SalⅠ； 11.XhoⅠ.
图3 A2的重组质粒表达产物检测及纯化
Figure 3 Identification and purification of the expressed product of pRSET-A2 recombinant plasmid
, http://www.100md.com
1.pRSET induced； 2.pRSET-A2 uninduced； 3.pRSET-A2 induced； 4.Supernatant of lysis； 5.Supernatant of 4mol/L urea； 6.Supernatant of 8mol/L urea； 7. The purified protein.
3 A2的纯化
pRSET-A2的表达产物经不同浓度的尿素洗涤后，溶于8mol/L尿素。经蛋白扫描纯度可达80.4%，经Ni2+亲和层析纯化后蛋白扫描，纯度可达96.1%(图4)。
4 检测NPC病人和非NPC头颈部癌症病人血清中的抗体
纯化后的A2蛋白20μg，经SDS-PAGE后转印到硝酸纤维膜上，裁成20个小条，分别与1∶100稀释的NPC病人血清与非NPC头颈部癌症病人血清孵育，检测A2/IgG抗体。结果10份NPC血清中有8份血清出现明显的阳性条带，10份对照血清无一例阳性。特异性为100%。
, 百拇医药
图4 DNA聚合酶的Western blot分析
Figure 4 Western blot analysis of recombinant protein
expressed by pRSET-A2
a.The result of NPC serum； b.The result of control serum.
1，3. The expression of pRSET-A2；2，4.The expression of pRSET control.
5 ELISA检测NPC病人血清中的A2/IgG
46份NPC病人与46份非NPC头颈部癌症病人血清，用ELISA检测A2/IgG，并与检测VCA/IgA和EA/IgA作比较，结果ELISA检测A2/IgG的敏感度为89%，特异度为93%(表1)。
, 百拇医药
表1 ELISA检测A2/IgG的结果
Table 1 A2/IgG detection by ELISA Source of
sera
Case no.
ELISA
A2/IgG
IFA
+(%)
-
VCA/IgA
EA/IgA
, http://www.100md.com +
-
+(%)
-
NPC
46
41(89)
5
46
0
35(76)
11
Non-NPC
, 百拇医药 46
3
43
32
14
1
45
Cutoff value＝0.094×2.1＝0.198；+. OD450≥0.198.讨 论
本研究的目的是将EB病毒的DNA聚合酶基因克隆到pRSET-A原核表达载体上，并在BL21(DE3)细菌中获得表达。通过分别与NPC病人血清与正常人血清的Western-blot IgG抗体分析，证明了表达产物的特异性，同时也表明在NPC病人血清中存在着针对EB病毒DNA聚合酶的IgG抗体。由于DNA聚合酶的片段长达3kb，而大肠杆菌表达片段的适合大小为1kb以内，因此DNA聚合酶全基因在大肠杆菌中的表达量较低(5%)，因此构建了pRSET-A1和pRSET-A2载体，分别表达DNA聚合酶的前1/3片段和后2/3片段。经蛋白扫描检测表达量分别为75%与33%。经Western-blot分析，DNA聚合酶抗原特异性主要存在于其后2/3片段。将纯化后的A2抗原检测10份NPC病人与非NPC头颈部癌症病人血清中的IgG抗体，其中8份NPC血清呈阳性，对2例漏检的血清增加膜的抗原量(100μg)或降低血清稀释度(1∶20)，均可呈阳性反映，表明A2/IgG检测在NPC诊断中具有良好的应用前景。用纯化的A2抗原初步建立ELISA方法，检测了46份NPC和46份非NPC头颈部癌症病人血清中的IgG抗体，敏感性达89%，特异性达93%。综合敏感性与特异性ELISA检测A2/IgG优于传统的IFA VCA/IgA抗体检测，在46例非NPC病人血清中32例阳性，ELISA检测A2/IgG有可能成为代替传统的IFA检测的较好方法。
, 百拇医药
作者简介：黄滨(1971-)，男，医学硕士，研究方向：微生物学。
参考文献：
[1]Kieff E. Epstein-Barr virus： increasing evidence of a link to carcinoma [J]. New Eng J Med, 1995, 33: 724-726.
[2]Henle L, Henle W. Epstein-Barr virus specific IgA serum antibodies as an outstanding feature of nasopharyngeal carcinoma [J]. Inter J Lancet, 1976, 17:1-17.
[3]Liu M Y, Chou W H, Nutter L. Antibody against Epstein-Barr virus DNA polymerase activity in sera of patients with nasopharyngeal carcinoma [J]. J Med Virol, 1989, 28:101-105.
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[4]黄桢祥，洪涛，刘崇柏.医学病毒学基础及实验技术[M].北京：科学出版社，1990，216-218.
[5]Hsu T Y, Pai C Y, Sheih S M. Use of antigen expressed in bacteria for detection of EBV specific thymidine kinase antibodies in sera from patients with nasopharyngeal carcinoma [J]. J Med Virol, 1992, 38:214-219.
收稿日期：2000-02-28；修回日期：2000-04-16, 百拇医药
单位：唐慰萍(广东医学院病理教研室 湛江 524023)；黄滨 李伯军 周为民 皮国华 谷淑燕(中国预防医学科学院病毒学研究所 北京 100052)
关键词：EB病毒；DNA聚合酶；诊断；鼻咽癌
病毒学报000314 摘要 以Epstein-Barr病毒(EBV)DNA聚合酶为抗原，建立了简便、快速、敏感和特异的鼻咽癌诊断方法。构建原核表达载体pRSET-DNA聚合酶及其亚克隆pRSET-A1和pRSET-A2，在BL21(DE3)中表达的产物，经Western-blot检测其抗原性并用于检测鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)病人血清中的抗体。在NPC病人血清中存在抗EB病毒DNA聚合酶的IgG抗体，并证明DNA聚合酶的抗原性主要集中于后2/3片段(A2)上。Western-bolt检测A2/IgG抗体的敏感性和特异性分别为80%和100%。对46份NPC病人血清和46份非NPC头颈癌症病人血清，用ELISA检测A2/IgA，敏感度为89%，特异度为93%。初步建立了ELISA检测NPC病人血清中A2/IgG抗体的方法，获得较高的敏感性和特异性。
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中图分类号：R373；R739.63 文献标识码：A
文章编号：1000-8721(2000)03-0258-04
Study on the Expression and Purification of Epstein-Barr Virus DNA
Polymerase and Its Application to Diagnosis of Nasopharyngeal Carcinoma
HUANG Bin，LI Bo-jun，ZHOU Wei-min，PI Guo-hua，TANG Wei-ping，GU Shu-yan
(Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052, China)
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Abstract: In order to establish a simple, rapid, sensitive and specific assay for diagnosis of nasopharyngeal carcinoma (NPC), we prepard Epstein-Barr virus (EBV) DNA polymerase antigen by genetic engineering. DNA polymerase was expressed in BL21(DE3) using pRSET vector. The expressed product was characterized by SDS-PAGE and Western-blot. The IgG antibody angainst DNA polymerase of EBV in sera of NPC patients can be testified by expressed DNA polymerase through Western-blot and ELISA. The DNA polymerase is divided into the front 1/3 and the last 2/3 A2 parts, on A2 the antigenicity of DNA ploymerase locates. The sensitivity and specificity of Western-blot for detecting A2/IgG antibody was 80% and 100% respectively. The ELISA test established to detect A2/IgG antibody in sera of 46 NPC patients and 46 non-NPC patients also showed high sensitivity (89%) and specificity (93%).
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Key words: Epstein-Barr virus; DNA polymerase; diagnosis; nasopharyngeal carcinoma
EB病毒与鼻咽癌(NPC)关系密切[1]。通过检测EB病毒抗体以早期诊断NPC是提高NPC病人存活率的重要手段[2]。用基因工程手段表达和纯化的蛋白和多肽为抗原，建立简便、快速、灵敏、特异的诊断方法，是目前NPC诊断的主要发展方向。例如DNA聚合酶，是由EB病毒BamHI A片段左向的第五个阅读框编码(BALF5)，基因大小为3kb，编码蛋白的分子量约110kD，是EB病毒DNA复制的关键性酶。DNA聚合酶的诊断意义已被Liu[3]等以酶中和反应证明，高滴度的EB病毒DNA聚合酶IgG抗体，早在Ⅰ期NPC病人血清中被检测到。我们采用基因重组技术在大肠杆菌表达DNA聚合酶全基因及部份基因，用纯化的表达产物作为抗原检测NPC病人血清中抗体，建立了敏感、特异的诊断方法。
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材料与方法
1 质粒和菌株 质粒pRTS-21含有DNA聚合酶全基因，由王轶龙惠赠。pRSET-b、pRSET-a原核表达载体由我所肝炎室惠赠，为T7启动子控制下的融合蛋白原核表达载体。在融合蛋白的N末端含有6个连续的组氨酸标签。菌株BL21(DE3)为该载体的表达宿主菌。
2 NPC病人、头颈部非NPC病人和正常人的血清 均由广东医学院病理教研室提供。
3 其它试剂 限制性内切酶和T4连接酶均购自New England Biolabs公司。Taq酶购自六合通公司。DNA回收试剂盒QIAXⅡ购自QIAGEN公司。
4 DNA聚合酶基因的PCR扩增 根据DNA聚合酶基因序列设计PCR扩增的上下游引物。上游引物：5＇CGGAATTCATGTCTGGGGGACTCTTCTATAAC3＇；下游引物为：5＇CCCAAGCTTTTAGAATGGTGGCCGCGCTGTTAA3＇。以pRTS21质粒为模板做PCR扩增DNA聚合酶基因。PCR扩增过程：94℃变性2min，然后94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，30个循环，最后一个循环94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 5min。PCR产物以酚：氯仿抽提，乙醇沉淀，晾干后用去离子水溶解。
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5 IFA方法检测VCA/IgA、EA/IgA 具体操作方法见参考文献[4]。
6 Western-blot方法 具体操作方法见参考文献[5]
7 重组蛋白的表达与纯化 将含有重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)接种于Amp+的LB培养基中，37℃振荡至OD600达1的时候，加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续培养5h，4℃ 5 000r/min离心15min收获细菌。超声裂解细菌，用4mol/L尿素洗涤包涵体，8mol/L尿素溶解包涵体。以Ni2+亲和层析，按Pharmacia Chelating Sepharose Fast Flow使用手册所述方法纯化蛋白。
8 ELISA 以纯化后的蛋白按50ng/孔包被ELISA板，4℃过夜，用洗涤液(PBS 0.1mol/L pH7.4，0.05%Tween20)洗涤2次，封闭液为含10%牛血清的PBS，37℃湿盒孵育2h，洗涤3次，每孔加1∶100稀释的血清100μl，37℃湿盒卵育1h，洗涤3次，每孔加入100μl 1∶1000稀释的抗人IgG酶标抗体，37℃湿盒孵育1h，洗涤3次，TMB底物显色，4mol/L H2SO4终止反应，于酶标仪上测定其450nm处的吸光值，结果测定以OD值＝(OD值-空白孔OD值)/(阴性孔值-空白孔值)≥1.5为阳性。
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结 果
1 DNA聚合酶基因的扩增及重组表达载体的构建
扩增后的DNA聚合酶的PCR产物与不加模板DNA的阴性对照进行琼脂糖电泳。聚合酶PCR产物在3kb左右有一条扩增条带。片段大小与DNA聚合酶基因相符(图1)。将DNA聚合酶全基因PCR扩增产物以Eco RⅠ与HindⅢ酶切后，插入pRSET-b上相应的酶切位点，转化大肠杆菌JM109，挑选重点克隆经酶切鉴定(图2)。构建成的pRSET-DNA聚合酶(pRSET-A)以EcoRⅠ SalⅠ酶切后纯化回收1kb片段的前1/3，插入pBV220载体构建pBV-A1(DNA聚合酶前1/3部分)过渡载体，再以EcoRⅠ和HindⅢ酶切pBV-A1，回收1kb的前1/3片段，插入pRSET-b载体构建成pRSET-A1表达载体。以XhoⅠ和HindⅢ酶切pRSET-A，纯化回收2kb的DNA聚合酶的后2/3片段，插入pRSET-a载体，构建pRSET-A2(DNA聚合酶后2/3部分)表达载体。
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图1 PCR扩增DNA聚合酶基因1%
琼脂糖凝胶电泳结果
Figure 1 1% agarose gel electrophoresis of DNA polymerase gene amplified by PCR
1.PCR product；2.Negative control；3.λDNA/HindⅢ marker.
2 pRSET-DNA聚合酶，表达及特异性
将重组质粒转化BL-21(DE3)细菌，挑选单克隆，接种5ml含Amp的LB培养液，猛烈振荡至OD600为1，此时加入IPTG(1mmol/L)诱导4h，将诱导前与诱导后4h的菌样空载体对照进行SDS-PAGE。pRSET-A在诱导后于110kD左右出现一条表达带，分子量与DNA聚合酶相近(图3)；pRSET-A1在30kD处出现一条新的表达带，分子量与pRSET-A1(DNA聚合酶前1/3部分)相近；pRSET-A2在70kD处出现一条新的表达带，分子量与pRSET-A2(DNA聚合酶2/3部分)相近(图4)。将IPTG诱导后的含pRSET-A和A2经SDS-PAGE和Western-blot分析，结果表明，pRSET-A与NPC病人血清孵育出现一条明显条带，A1无明显阳性条带出现。说明DNA聚合酶的抗原特异性，并且后2/3部分具有足够强的反应特异性。
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图2 pRSET-A重组质粒构建及酶切图谱
Figure 2 Restriction map of recombinant plasmid pRSET-DNA polymerase
1.λDNA/HindⅢ marker； 2.pRSET； 3.HindⅢ； 4.EcoRⅠ； 5.HindⅢ+EcoRⅠ； 6.BamHⅠ+HindⅢ； 7.BamHⅠ； 8.SmaⅠ； 9.PstⅠ； 10.SalⅠ； 11.XhoⅠ.
图3 A2的重组质粒表达产物检测及纯化
Figure 3 Identification and purification of the expressed product of pRSET-A2 recombinant plasmid
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1.pRSET induced； 2.pRSET-A2 uninduced； 3.pRSET-A2 induced； 4.Supernatant of lysis； 5.Supernatant of 4mol/L urea； 6.Supernatant of 8mol/L urea； 7. The purified protein.
3 A2的纯化
pRSET-A2的表达产物经不同浓度的尿素洗涤后，溶于8mol/L尿素。经蛋白扫描纯度可达80.4%，经Ni2+亲和层析纯化后蛋白扫描，纯度可达96.1%(图4)。
4 检测NPC病人和非NPC头颈部癌症病人血清中的抗体
纯化后的A2蛋白20μg，经SDS-PAGE后转印到硝酸纤维膜上，裁成20个小条，分别与1∶100稀释的NPC病人血清与非NPC头颈部癌症病人血清孵育，检测A2/IgG抗体。结果10份NPC血清中有8份血清出现明显的阳性条带，10份对照血清无一例阳性。特异性为100%。
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图4 DNA聚合酶的Western blot分析
Figure 4 Western blot analysis of recombinant protein
expressed by pRSET-A2
a.The result of NPC serum； b.The result of control serum.
1，3. The expression of pRSET-A2；2，4.The expression of pRSET control.
5 ELISA检测NPC病人血清中的A2/IgG
46份NPC病人与46份非NPC头颈部癌症病人血清，用ELISA检测A2/IgG，并与检测VCA/IgA和EA/IgA作比较，结果ELISA检测A2/IgG的敏感度为89%，特异度为93%(表1)。
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表1 ELISA检测A2/IgG的结果
Table 1 A2/IgG detection by ELISA Source of
sera
Case no.
ELISA
A2/IgG
IFA
+(%)
-
VCA/IgA
EA/IgA
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-
+(%)
-
NPC
46
41(89)
5
46
0
35(76)
11
Non-NPC
, 百拇医药 46
3
43
32
14
1
45
Cutoff value＝0.094×2.1＝0.198；+. OD450≥0.198.讨 论
本研究的目的是将EB病毒的DNA聚合酶基因克隆到pRSET-A原核表达载体上，并在BL21(DE3)细菌中获得表达。通过分别与NPC病人血清与正常人血清的Western-blot IgG抗体分析，证明了表达产物的特异性，同时也表明在NPC病人血清中存在着针对EB病毒DNA聚合酶的IgG抗体。由于DNA聚合酶的片段长达3kb，而大肠杆菌表达片段的适合大小为1kb以内，因此DNA聚合酶全基因在大肠杆菌中的表达量较低(5%)，因此构建了pRSET-A1和pRSET-A2载体，分别表达DNA聚合酶的前1/3片段和后2/3片段。经蛋白扫描检测表达量分别为75%与33%。经Western-blot分析，DNA聚合酶抗原特异性主要存在于其后2/3片段。将纯化后的A2抗原检测10份NPC病人与非NPC头颈部癌症病人血清中的IgG抗体，其中8份NPC血清呈阳性，对2例漏检的血清增加膜的抗原量(100μg)或降低血清稀释度(1∶20)，均可呈阳性反映，表明A2/IgG检测在NPC诊断中具有良好的应用前景。用纯化的A2抗原初步建立ELISA方法，检测了46份NPC和46份非NPC头颈部癌症病人血清中的IgG抗体，敏感性达89%，特异性达93%。综合敏感性与特异性ELISA检测A2/IgG优于传统的IFA VCA/IgA抗体检测，在46例非NPC病人血清中32例阳性，ELISA检测A2/IgG有可能成为代替传统的IFA检测的较好方法。
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作者简介：黄滨(1971-)，男，医学硕士，研究方向：微生物学。
参考文献：
[1]Kieff E. Epstein-Barr virus： increasing evidence of a link to carcinoma [J]. New Eng J Med, 1995, 33: 724-726.
[2]Henle L, Henle W. Epstein-Barr virus specific IgA serum antibodies as an outstanding feature of nasopharyngeal carcinoma [J]. Inter J Lancet, 1976, 17:1-17.
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收稿日期：2000-02-28；修回日期：2000-04-16, 百拇医药