PCR-SSCP分支杆菌菌种初步鉴定方法的建立及其应用
作者：吴雪琼 张俊仙 刘佳文 黄海南 王晋洪
单位：吴雪琼 张俊仙 刘佳文 黄海南(解放军309医院结核病研究室北京 100091)；王晋洪(山东省胸科医院检验科)
关键词：聚合酶链反应；单链构象多态性；菌种鉴定；分支杆菌
中国现代医学杂志000713 目的：建立一种简便、快速、灵敏和特异的分支杆菌菌种鉴定方法。方 法：通过聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)-单链构象多态性(Single-strnde d Conformation Polymorphism,SSCP)方法分析分支杆菌16S rRNA，根据其电泳图谱与标准 株的相似性进行菌种初步鉴定。结果：29种分支杆菌标准株中，除结核分支杆菌、牛结核分 支杆菌和卡介苗之间及堪萨斯分支杆菌和胃分支杆菌之间SSCP电泳图谱相似外，其余各种分 支杆之间电泳图谱均有显著差异。70株BACTEC TB460初步鉴定为结核分支杆菌复合群的临床 分离 株中，55株显示与结核分支杆菌SSCP电泳图谱相似，15例(21.4%)显示出与结核分支杆菌完 全不同的电泳图谱；10株经传统方法鉴定为结核分支杆菌的分离株中，仅1株显示出与结核 分支杆菌不同的电泳图谱。结论：PCR-SSCP有可能成为一种快速、有效的分支杆菌菌种初步 鉴定方法。
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分类号 R378.91
DIFFERENTIATION OF MYCOBACTERIAL SPECIES BY PCR-SSCP
Wu Xueqiong, Zhang Junxian, Liu Jiawen, et al.
(Tuberculosis Research Laboratory, the 309th Hospital, Beijing 100091)
[Abstract] Objective: To develop a simple, rapid, sensitive , and specific method for differenciation of mycobacterial species. Methods: Mycobact erial 16S rRNSA sequences were analyzed by PCR-SSCP, then mycobacterial species were differentia ted by their characteristic electrophoresis patterns. Results: O f 29 mycobacteri al standard strains, M. tuberculosis, M. bovis and M. bovis BCG had similar SSCP profiles, M. kansassi and M. gastri also exhibited the same SSCP profiles, the other mycobacterial standard strains displayed different SSCP profiles. Of 70 cl inical isolate identified as M. tuberculosis complex by BACTEC 460, 55 had the s ame SSCP profiles as M. tuberculosis, 15 exhibited different SSCP profiles from M. tuberculosis. Of 10 clinical isolate identified as M. tuberculosis by traditi onal method, only one exhibited different SSCP profiles from M. tuberculosis. [ WTHZ〗Co nclusions: PCR-SSCP technique might become a simple, rapid and reliable method for identification of mycobacterial species.
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Key words: Polymerse Chain Reaction; Single-stranded Conformatio n Polynorphism; Differentiation; Mycobacteria
本文利 用16S rRNA123～275位核苷酸(按大肠杆菌16S rRNA的编码位置)是原核生物高度变异的区域 ，通过PCR-SSCP方法分析，由于不同种细菌DNA单链的空间构象不同，电泳后片段的迁移率 也就同，而呈现出不同的图谱，从而建立了一种新的简便、快速、灵敏和特异的菌种初步鉴 定方法，并用此方法分析了80株结核分支杆菌复合群临床分离株。
1 材料与方法
1.1 菌种、菌株来源和菌种的初步鉴定
29种分支杆菌标准株(包括结核分支杆菌、牛结核分支杆菌、卡介苗、鸟分支杆菌、胞内分 支杆菌、瘰疬分支杆菌、堪萨斯分支杆菌、胃分支杆菌、偶然分支杆菌、副偶然分支杆菌、不产色分支杆 菌、微黄分支杆菌、苏尔加分支杆菌、次要分支杆菌、戈登分支杆菌、 土分支杆菌、耻垢分支杆菌、草分支杆菌、溃疡分支杆菌、龟分支杆菌龟亚种、龟分支杆菌 脓肿亚种、母牛分支杆菌、蟾蜍分支杆菌、猿猴分支杆菌、爱知分支杆菌、马尔摩分支杆菌 、金色分支杆菌、新金色分支杆菌和迪氏分支杆菌)来源于中国药品生物制品鉴定所；80株 结核分支杆菌临床分离株来源于山东省胸科医院和河南省胸科医院。按全国结核病细菌学检 验 标准化规程进行分支杆菌标准株培养，70例临床标本应用BACTEC TB 460进行分支杆菌分离 培 养和结核分支杆菌复合群与非分支杆菌的初步鉴定；10例临床标本应用传统的方法进行分离 培养和菌种鉴定。
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1.2 细菌DNA的制备
采用本室自制的标本前处理试剂盒提取DNA，置-20℃保存备用。
1.3 PCR扩增
PCR扩增试剂盒为本室自制产品。在25ul反应体系中，4×dNTP的最终浓度各为0.2mmol/L， 引物Ⅰ、Ⅱ的终浓度各为0.4umol/L，纯化的DNA模板10～100ng，Taq DNA聚合酶1U。置DNA 热循环仪扩增后，在2%琼脂糖凝胶中电泳检测扩增产物。根据结核分支杆菌165 rRNA基因序 列(EMBL accession No.X52917)设计、合成的这对引物可扩增该基因21～292bp位碱基，产 生272bp片段。
1.4 SSCP分析
PCR扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，溴化乙锭染色或银染色后观察结果并照相 。
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2 结果
2.1 PCR扩增
29种分支杆菌和80株结核分支杆菌复合群临床分离株经PCR扩增后均产生272bp片段。
2.2 SSCP分析
29种分支杆菌DNA扩增片段经SSCP分析后，除结核分支杆菌、牛结核分支杆菌和BCG之间及堪 萨斯分支杆菌和胃分支杆菌之间显示相同的电泳图谱外，其余分支杆菌相互间显示出不同的 电泳图谱。部分结果见图1。
1 草分支杆菌；2 溃疡分支杆菌；3 堪萨斯分支杆菌；4 结核分支杆菌；5 胃分支杆菌；6 鸟分支杆菌；7 戈登分支杆菌；8 土分支杆菌；9 耻垢分支杆菌；10 微黄分 支杆菌；11 母牛分支杆菌；12 结核分支杆菌；13 蟾蜍分支杆菌；14 戈登分支杆菌；15 不产色分支杆菌；16 胞内分支杆菌
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图1 部分分支杆菌标准株SSCP电泳图谱
70株BACTEC TB460初步鉴定为结核分支杆菌复合群的临床分离株DNA扩增片段经SSCP分析后 ，55株显示出与结核分支杆菌标准株相同的电泳图谱，15株显示出完全不同的图谱；10株经 传统方法鉴定为结核分支杆菌的分离株中，仅1株显示出与结核分支杆菌不同的电泳图谱。 部分结果见图2。
7 结核分支杆菌；下列为BACTEC鉴定出的结核分支杆菌复合群分离株：
1 分离株No.184；2 分离株No.182；3 分离株No.545；4 分离株No.153；5 分离株No.540； 6 分离株No.216；8 分离株No.547；9 分离株No.171；10 分离株No.152
, 百拇医药 图2 部分结核分支杆菌复合群分离株SSCP电泳图谱
3 讨论
细菌16S rRNA序列是高度保守的，根据Rogall等[1]和Kempsell等[2]报 道结核分支杆菌复合群(包括结核分支杆菌、牛结核分支杆菌、卡介苗、非洲分支杆菌和田 鼠分支杆菌)16S rRNA在123～276位碱基是完全相同的，而与其它22种分支杆菌(如鸟分支杆 菌、副结核分支杆菌、堪萨斯分支杆菌、胃分支杆菌、瘰疬分支杆菌、猿猴分支杆菌、不产 色分支杆菌、土分支杆菌、蟾蜍分支杆菌、戈登分支杆菌、苏尔加分支杆菌、马尔摩分支杆 菌、胞内分支杆菌、海分支杆菌、库氏分支杆菌、微黄分支杆菌、龟分支杆菌龟亚种、耻垢 分支杆菌、偶然分支杆菌、泥炭藓分支杆菌、科莫斯分支杆菌和草分支杆菌)相比存在1～数 个碱基的差异，堪萨斯分支杆菌和胃分支杆菌16S rRNA123～276位碱基无差别。
PCR-SSCP分析技术现已成为最广泛应用的一种根据单链DNA构象差别快速、灵敏地检测基因 变异的方法，1996年Victor等[1]曾试图通过PCR-SSCP分析dnaJ基因来进行分支杆 菌菌种鉴定，未能取得成功。而从本文结果可看出，通过PCR-SSCP技术分析分支杆菌16S rR NA，除结核分支杆菌、牛结核分支杆菌和BCG的SSCP电泳图谱相似，堪萨斯分支杆菌和胃分 支 杆菌的电泳图谱相似外，其它各种分支杆菌之间SSCP图谱各不相同，很容易鉴别。80株经BA CTAEC或传统方法鉴定为结核分支杆菌的分离株中，64株(80%)与结核分支杆菌标准株具有相 同的SSCP图说。因此，本文建立的这种新的SSCP分子菌种鉴定技术是可行的。
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BACTEC快速菌种鉴定法是利用P-硝基-α-乙酰氨基-β-羟基苯丙酮(P-Nitro-α-Actylamino -β-hydroxypropi-phenone,简称NAP)对结核分支杆菌复合群生长有抑制作用，而对非结核 分支杆菌生长无抑制作用，在BACTACE系统内 加入NAP继续培养2～6d后，根据生长指数初步鉴别结核分支杆菌复合群和其它非结核分支杆 菌。目前BACTEC菌种初步鉴定法与传统鉴定法比较特异性95%～100%，据赵亭[2]等 报告对BACTEC TB460区分出来的非结核分支杆菌进一步菌种鉴定，发现有7.7%的菌株为结核 分支杆菌；尚未见在BACTEC TB460区分出来的结核分支杆菌复合群中发现非结核分支杆菌的 报道。本文将待鉴定菌株的16S rRNA扩增片段与标准株一起进行SSCP分析，根据其图谱的相 似性进行菌种的初步鉴定，从70株BACTEC TB460初步鉴定为结核分支杆菌复合群的分离株的 分析可以看出，只有78.6%的分离株显示与结核分支杆菌SCP图谱相似，而其它21.4%的 分离 株显示的SSCP图谱却与其它分支杆菌相似(如堪萨斯分支杆菌等)，我们将对其进一步研究， 以判明是混合感染所致，还是NAP对某些非结核分支杆菌生长也有一定的抑制作用。
参 考 文 献
1，Victor TC,Jordaan AM,et al.Strain-specific varation in the dnaJ gene o f mycobateria.J Med Microbiol,1996;44:332～339
2，赵 亭，潘 欣.应用BACTEC 460TB系统区分出的非结核分支杆菌进一步菌种鉴 定意义的探讨.中国防痨杂志，1998；20：29～31, 百拇医药
单位：吴雪琼 张俊仙 刘佳文 黄海南(解放军309医院结核病研究室北京 100091)；王晋洪(山东省胸科医院检验科)
关键词：聚合酶链反应；单链构象多态性；菌种鉴定；分支杆菌
中国现代医学杂志000713 目的：建立一种简便、快速、灵敏和特异的分支杆菌菌种鉴定方法。方 法：通过聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)-单链构象多态性(Single-strnde d Conformation Polymorphism,SSCP)方法分析分支杆菌16S rRNA，根据其电泳图谱与标准 株的相似性进行菌种初步鉴定。结果：29种分支杆菌标准株中，除结核分支杆菌、牛结核分 支杆菌和卡介苗之间及堪萨斯分支杆菌和胃分支杆菌之间SSCP电泳图谱相似外，其余各种分 支杆之间电泳图谱均有显著差异。70株BACTEC TB460初步鉴定为结核分支杆菌复合群的临床 分离 株中，55株显示与结核分支杆菌SSCP电泳图谱相似，15例(21.4%)显示出与结核分支杆菌完 全不同的电泳图谱；10株经传统方法鉴定为结核分支杆菌的分离株中，仅1株显示出与结核 分支杆菌不同的电泳图谱。结论：PCR-SSCP有可能成为一种快速、有效的分支杆菌菌种初步 鉴定方法。
, 百拇医药
分类号 R378.91
DIFFERENTIATION OF MYCOBACTERIAL SPECIES BY PCR-SSCP
Wu Xueqiong, Zhang Junxian, Liu Jiawen, et al.
(Tuberculosis Research Laboratory, the 309th Hospital, Beijing 100091)
[Abstract] Objective: To develop a simple, rapid, sensitive , and specific method for differenciation of mycobacterial species. Methods: Mycobact erial 16S rRNSA sequences were analyzed by PCR-SSCP, then mycobacterial species were differentia ted by their characteristic electrophoresis patterns. Results: O f 29 mycobacteri al standard strains, M. tuberculosis, M. bovis and M. bovis BCG had similar SSCP profiles, M. kansassi and M. gastri also exhibited the same SSCP profiles, the other mycobacterial standard strains displayed different SSCP profiles. Of 70 cl inical isolate identified as M. tuberculosis complex by BACTEC 460, 55 had the s ame SSCP profiles as M. tuberculosis, 15 exhibited different SSCP profiles from M. tuberculosis. Of 10 clinical isolate identified as M. tuberculosis by traditi onal method, only one exhibited different SSCP profiles from M. tuberculosis. [ WTHZ〗Co nclusions: PCR-SSCP technique might become a simple, rapid and reliable method for identification of mycobacterial species.
, 百拇医药
Key words: Polymerse Chain Reaction; Single-stranded Conformatio n Polynorphism; Differentiation; Mycobacteria
本文利 用16S rRNA123～275位核苷酸(按大肠杆菌16S rRNA的编码位置)是原核生物高度变异的区域 ，通过PCR-SSCP方法分析，由于不同种细菌DNA单链的空间构象不同，电泳后片段的迁移率 也就同，而呈现出不同的图谱，从而建立了一种新的简便、快速、灵敏和特异的菌种初步鉴 定方法，并用此方法分析了80株结核分支杆菌复合群临床分离株。
1 材料与方法
1.1 菌种、菌株来源和菌种的初步鉴定
29种分支杆菌标准株(包括结核分支杆菌、牛结核分支杆菌、卡介苗、鸟分支杆菌、胞内分 支杆菌、瘰疬分支杆菌、堪萨斯分支杆菌、胃分支杆菌、偶然分支杆菌、副偶然分支杆菌、不产色分支杆 菌、微黄分支杆菌、苏尔加分支杆菌、次要分支杆菌、戈登分支杆菌、 土分支杆菌、耻垢分支杆菌、草分支杆菌、溃疡分支杆菌、龟分支杆菌龟亚种、龟分支杆菌 脓肿亚种、母牛分支杆菌、蟾蜍分支杆菌、猿猴分支杆菌、爱知分支杆菌、马尔摩分支杆菌 、金色分支杆菌、新金色分支杆菌和迪氏分支杆菌)来源于中国药品生物制品鉴定所；80株 结核分支杆菌临床分离株来源于山东省胸科医院和河南省胸科医院。按全国结核病细菌学检 验 标准化规程进行分支杆菌标准株培养，70例临床标本应用BACTEC TB 460进行分支杆菌分离 培 养和结核分支杆菌复合群与非分支杆菌的初步鉴定；10例临床标本应用传统的方法进行分离 培养和菌种鉴定。
, 百拇医药
1.2 细菌DNA的制备
采用本室自制的标本前处理试剂盒提取DNA，置-20℃保存备用。
1.3 PCR扩增
PCR扩增试剂盒为本室自制产品。在25ul反应体系中，4×dNTP的最终浓度各为0.2mmol/L， 引物Ⅰ、Ⅱ的终浓度各为0.4umol/L，纯化的DNA模板10～100ng，Taq DNA聚合酶1U。置DNA 热循环仪扩增后，在2%琼脂糖凝胶中电泳检测扩增产物。根据结核分支杆菌165 rRNA基因序 列(EMBL accession No.X52917)设计、合成的这对引物可扩增该基因21～292bp位碱基，产 生272bp片段。
1.4 SSCP分析
PCR扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，溴化乙锭染色或银染色后观察结果并照相 。
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2 结果
2.1 PCR扩增
29种分支杆菌和80株结核分支杆菌复合群临床分离株经PCR扩增后均产生272bp片段。
2.2 SSCP分析
29种分支杆菌DNA扩增片段经SSCP分析后，除结核分支杆菌、牛结核分支杆菌和BCG之间及堪 萨斯分支杆菌和胃分支杆菌之间显示相同的电泳图谱外，其余分支杆菌相互间显示出不同的 电泳图谱。部分结果见图1。
1 草分支杆菌；2 溃疡分支杆菌；3 堪萨斯分支杆菌；4 结核分支杆菌；5 胃分支杆菌；6 鸟分支杆菌；7 戈登分支杆菌；8 土分支杆菌；9 耻垢分支杆菌；10 微黄分 支杆菌；11 母牛分支杆菌；12 结核分支杆菌；13 蟾蜍分支杆菌；14 戈登分支杆菌；15 不产色分支杆菌；16 胞内分支杆菌
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图1 部分分支杆菌标准株SSCP电泳图谱
70株BACTEC TB460初步鉴定为结核分支杆菌复合群的临床分离株DNA扩增片段经SSCP分析后 ，55株显示出与结核分支杆菌标准株相同的电泳图谱，15株显示出完全不同的图谱；10株经 传统方法鉴定为结核分支杆菌的分离株中，仅1株显示出与结核分支杆菌不同的电泳图谱。 部分结果见图2。
7 结核分支杆菌；下列为BACTEC鉴定出的结核分支杆菌复合群分离株：
1 分离株No.184；2 分离株No.182；3 分离株No.545；4 分离株No.153；5 分离株No.540； 6 分离株No.216；8 分离株No.547；9 分离株No.171；10 分离株No.152
, 百拇医药 图2 部分结核分支杆菌复合群分离株SSCP电泳图谱
3 讨论
细菌16S rRNA序列是高度保守的，根据Rogall等[1]和Kempsell等[2]报 道结核分支杆菌复合群(包括结核分支杆菌、牛结核分支杆菌、卡介苗、非洲分支杆菌和田 鼠分支杆菌)16S rRNA在123～276位碱基是完全相同的，而与其它22种分支杆菌(如鸟分支杆 菌、副结核分支杆菌、堪萨斯分支杆菌、胃分支杆菌、瘰疬分支杆菌、猿猴分支杆菌、不产 色分支杆菌、土分支杆菌、蟾蜍分支杆菌、戈登分支杆菌、苏尔加分支杆菌、马尔摩分支杆 菌、胞内分支杆菌、海分支杆菌、库氏分支杆菌、微黄分支杆菌、龟分支杆菌龟亚种、耻垢 分支杆菌、偶然分支杆菌、泥炭藓分支杆菌、科莫斯分支杆菌和草分支杆菌)相比存在1～数 个碱基的差异，堪萨斯分支杆菌和胃分支杆菌16S rRNA123～276位碱基无差别。
PCR-SSCP分析技术现已成为最广泛应用的一种根据单链DNA构象差别快速、灵敏地检测基因 变异的方法，1996年Victor等[1]曾试图通过PCR-SSCP分析dnaJ基因来进行分支杆 菌菌种鉴定，未能取得成功。而从本文结果可看出，通过PCR-SSCP技术分析分支杆菌16S rR NA，除结核分支杆菌、牛结核分支杆菌和BCG的SSCP电泳图谱相似，堪萨斯分支杆菌和胃分 支 杆菌的电泳图谱相似外，其它各种分支杆菌之间SSCP图谱各不相同，很容易鉴别。80株经BA CTAEC或传统方法鉴定为结核分支杆菌的分离株中，64株(80%)与结核分支杆菌标准株具有相 同的SSCP图说。因此，本文建立的这种新的SSCP分子菌种鉴定技术是可行的。
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BACTEC快速菌种鉴定法是利用P-硝基-α-乙酰氨基-β-羟基苯丙酮(P-Nitro-α-Actylamino -β-hydroxypropi-phenone,简称NAP)对结核分支杆菌复合群生长有抑制作用，而对非结核 分支杆菌生长无抑制作用，在BACTACE系统内 加入NAP继续培养2～6d后，根据生长指数初步鉴别结核分支杆菌复合群和其它非结核分支杆 菌。目前BACTEC菌种初步鉴定法与传统鉴定法比较特异性95%～100%，据赵亭[2]等 报告对BACTEC TB460区分出来的非结核分支杆菌进一步菌种鉴定，发现有7.7%的菌株为结核 分支杆菌；尚未见在BACTEC TB460区分出来的结核分支杆菌复合群中发现非结核分支杆菌的 报道。本文将待鉴定菌株的16S rRNA扩增片段与标准株一起进行SSCP分析，根据其图谱的相 似性进行菌种的初步鉴定，从70株BACTEC TB460初步鉴定为结核分支杆菌复合群的分离株的 分析可以看出，只有78.6%的分离株显示与结核分支杆菌SCP图谱相似，而其它21.4%的 分离 株显示的SSCP图谱却与其它分支杆菌相似(如堪萨斯分支杆菌等)，我们将对其进一步研究， 以判明是混合感染所致，还是NAP对某些非结核分支杆菌生长也有一定的抑制作用。
参 考 文 献
1，Victor TC,Jordaan AM,et al.Strain-specific varation in the dnaJ gene o f mycobateria.J Med Microbiol,1996;44:332～339
2，赵 亭，潘 欣.应用BACTEC 460TB系统区分出的非结核分支杆菌进一步菌种鉴 定意义的探讨.中国防痨杂志，1998；20：29～31, 百拇医药