HGV广东株和香港株NS5区部分基因的克隆及序列分析
作者：马会慧 杨绍基 李 刚 陈雪娟 廖家杰 姚集鲁
单位：马会慧 杨绍基 李 刚 陈雪娟 姚集鲁(中山医科大学传染病学教研室，广州 510630)；廖家杰(香港大学玛丽医院胃肠肝病科，香港)
关键词：庚型肝炎病毒；聚合酶链反应，DNA序列测定，分子克隆
中国病毒学990108 摘 要 采用HGV NS5特异的2对引物，对两个香港株和一个广东株HGV-RNA进行逆转录套式PCR扩增，PCR产物克隆入pUC19，重组质粒转化DH5α和JM109菌株。PCR和酶切法鉴定阳性克隆，双脱氧链末端终止法测定核苷酸序列并进行同源性分析。结果发现核苷酸变异呈散在分布，三株间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为93.3%～94%及97%～99.2%，与已报道的中国株(CN)相比，则同源性分别为90%～91.2%和94%～96.3%，与美国株(PNF2161及R10291)相比，为87.1%～89.5%和95.2%～97%，而与西非株(GBV-C)相比，则达91.4%～93.8%和97%～97.9%。提示HGV NS5区核苷酸和氨基酸序列相对保守，不同HGV株存在一定的地区差异。
, 百拇医药
庚型肝炎病毒(HGV)是两年前发现的一种新型肝炎病毒，其基因组包括5′-非编码区(5′-NTR)，3′-非编码区(3′-NTR)，结构蛋白C、E1、E2区，有的株C区缺如，非结构蛋白NS1、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A/5B区[1]。国内外对5′-NTR、E2区、NS3区等的研究报道较多，但对NS5区的报道甚少。为了解中国不同地区之间HGV NS5区基因以及与国外分离株的同源性状况，本研究对HGV NS5区部分基因进行了PCR克隆及序列分析，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 血清标本
两份血清来自香港献血员(A132、A711)，一份血清来自广东的一名慢性乙型肝炎病人
(3027)。
1.2 主要试剂
, http://www.100md.com
RNasin、AMV逆转录酶、Taq DNA聚合酶(购自丰华公司)、pUC19、IPTG、,X-gal(天象人生物工程公司)、低熔点琼脂糖、T4DNA连接酶、BamHI、SmaI、EcoRI、Klenow酶、琼脂酶(宝灵曼公司)。
引物由北京赛百胜生物工程公司合成，序列及位置如下：
33 5′GTT
GCGATGGAGCGCTACAC3′(6672～6697)
34 5′CTG
CGTATCATGTATGGTTCT3′(7267～7292)
35 5′TCGATTGCTGTAGCTGAGCC3′(6573～6592)
, http://www.100md.com
36 5′GGTAAGTTCATTGCCCACCA3′(7327～7346)
33、34为一对内引物，35、56为一对外引物。单划线部分为BamHI位点，双粗划线部分为EcoRI酶切位点。外引物扩增片段为774bp，内引物扩增片段为618bp。
1.3 PCR产物的获取
采用热变性酶裂解法制备RNA模板[2]。取待检标本50μL，加入裂解液5μL(主要含蛋白酶
K)，55℃ 32min, 98℃ 15min, 12000g/min离心5min。取裂解上清5μL，进行逆转录，反应体积10μL，含引物36、75ng， AMV 11u， 2.5mmol/L dNTP 1.5μL，Rnasin 16u， 42℃ 60min。第一次PCR反应体积为20μL，含逆转录液10μL，引物35为50ng，Taq DNA聚合酶2u。95℃ 40s，55℃ 40s，72℃ 1min 20s，35个循环。第二次PCR反应体积为20μL，内含第一次PCR反应液5μL，引物33为75ng，引物34为75ng，Taq DNA聚合酶2u，95℃ 30s、60℃ 30s，72℃ 40s，30个循环。取10μL在含溴化乙锭的2%的琼脂糖凝胶中电泳，与标准分子量作对照，紫外灯下观察结果。
, 百拇医药
1.4 PCR产物的分子克隆
A132、A711的PCR产物用Klenow酶补平，1%低熔点琼脂糖电泳，切下目的条带处的凝胶，琼脂酶消化，乙醇沉淀，回收DNA。用BamHI消化，与用SmaI和BamHI消化的pUC19连接。连接反应总体积20μL，内含回收DNA 10μL，pUC19 6μL，10×连接Buffer 2μL，T4DNA连接酶2u，14℃过夜。加入80μL DH5α受体菌中。而3027株则用BamHI和EcoRI消化，克隆入pUC19的BamHI和EcoRI位点，转化JM109受体菌。受体菌制备及转化条件按文献[3]的方法。碱变性法提取质粒，PCR及单双酶切鉴定阳性克隆。
1.5 DNA序列测定
重组的阳性克隆，pUC19模板采用双脱氧链末端终止法，以DNA全自动测序仪(ABI373)测定核苷酸序列，同一片段经正反两个方向重复测定。
, 百拇医药
2 结果
2.1 阳性克隆的鉴定
A132、A711的HGV NS5区的618bp的片段插入pUC19的SmaI和BamHI之间，3027的NS5区的425bp的片段插入在pUC19的EcoRI和BamHI之间。重组质粒pUGN132、pUGN711以及pUGN3027经BamHI单酶切后与空载体pUC19比较电泳时泳动较慢。pUGN132、pUGN711经BamHI和SacI酶切，则切出一条带，与插入片段相符，用特异引物33、34作PCR扩增，获得618bp产物。pUGN3027经EcoRI和BamHI酶切，则切出一条425bp条带，与插入片段相符。用上述克隆进行序列测定。
2.2 HGV的A132、A711、3027 NS5区部分片段的核苷酸序列及与其他分离株的比较 见图1、图2及表1。
, http://www.100md.com
图1 HGV A132(香港株)NS5 cDNA序列与A711(香港株)、3027(广东株)及已报道的CN[4]、PNF2161[1]、R10291[1]和GBV-C[5]分离株相应序列的比较。小写为引物序列。圆点表示与HGV A132株序列相同。
Fig.1 Comparison of NS5 cDNA sequence of HGV A132 (Hong Kong strain)with the corresponding sequences from 3027 (Guangdong strain),A711 (Hong Kong) and the reported isolates (CN, PNF2161,R10291,GBV-C). Small letters stand for the sequence of primers. Dots indicate identity with sequence of HGV A132.
, 百拇医药
图2 HGV A132 NS5区推导的氨基酸序列与A711、3027株及CN、PNF2161、R10291、GBV-C相应序列的比较
Fig.2 Comparison of deduced amino acid sequence of HGV A132 NS5 with the corresponding sequences from 3027, A711 strains and CN, PNF2161,R10291,GBV-C isolates
表1 HGVA132、A711、3027株与其他分离株之间的NS5区部分基因同源性比较
Table 1 Homology analysis of HGV NS5 sequence from different strains nt/aa*
A132
, 百拇医药
A711
3027
PNF
R10291
GBV-C
A711
93.3/97.9
-
-
3027
94/99.2
93.8/97
-
, 百拇医药
PNF
87.5/96.8
87.5/96.8
88.3/97
-
-
-
R10291
88/95.8
87.1/95.2
89.5/96.2
92.3/98.4
, 百拇医药 -
-
GBV-C
91.4/97.9
93.8/97.9
93.3/97
87.9/97.9
88.9/95.2
-
CN
91.2/95.8
90/96.3
90/94
, 百拇医药
93.3/96.3
90.9/95.8
90.7/96.8
*nt=nucleotide, aa=amino acid
3 讨论
HGV与HCV相比，其基因组变异小，不存在高变区，同一基因组不同区段变异程度不同[6]，也存在地区差异[7]。5′-非编码区及3′-非编码区高度保守，结构蛋白区变异较大，非结构蛋白区存在保守基序，其中的NS5区报道很少。本研究对两个香港地方株和一个广东株的NS5区部分基因进行了PCR克隆及序列测定分析。三株序列间相比，该段核苷酸的变异小，同源性大于93%，而氨基酸同源性高达97%以上；三株序列各与CN株相比，核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性分别为90%～91.2%和94%～96.3%；而与美国株相比同源性略低，分别为87.1%～89.5%和95.2%～97%；有趣的是，与GBV-C相比，核苷酸的同源性为91.4%～93.8%，氨基酸的同源性则达97%～97.9%。结果提示HGV NS5区的该段基因序列存在一定的地区差异，支持HGV基因变异可能存在地域因素的观点。但总体而言，HGV NS5区的该段基因序列相对保守，7株间相比，核苷酸和氨基酸的同源性分别达87.1%～94%和94%～99.2%。核苷酸变异主要呈散在分布，但以6698～6837bp、7080-7092bp和7157～7251bp(以PNF2161计位)较为集中。
, 百拇医药
本研究中3027株所测序列仅有402bp，比设想的片段小167bp，是因为在该段核苷酸的5′端第182bp处存在一个EcoRI酶切位点，当以EcoRI和BamHI酶切时，则仅有425bp连接入pUC19的EcoRI和BamHI之间，这是设计引物应注意的问题。已报道的4株HGV中，CN和GBV-C株在该处存在一个EcoRI酶切位点，而PNF2161和R10291则无，这也与我们所测序列与CN和GBV-C株的同源性高相符。
* 本课题由国家自然科学基金(编号39600130)和广东省医学科学研究基金部分资助
参考文献
[1] Linnen J, Wages J, Zhang-Keck ZY et al. Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus: a transfusion-transmissible agents. Science, 1996, 271:505～508
, http://www.100md.com
[2] 高志良，姚集鲁.热变性HCV RNA模板直接法扩增.中山医科大学学报，1994，15(3)：68
[3] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatios T et al. Molecular cloning. a laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.1989
[4] 周育森，陈薇，赵秋敏等.中国人庚型肝炎病毒全基因cDNA克隆及序列测定.军事科学院院刊，1996，20(4)249～254
[5] Leary TP, Muerhoff AS, JN simons JN et al. Sequence and genomic organization of GBV-C: a novel member of the Flaviridae associated with human non A-E hepatitis. Journal of Medical Virology, 1995,48:60～67
, http://www.100md.com
[6] Erker JC, Simons JN, Muerhoff AS et al. Molecular cloning and characterization of a GB virus C isolate from a patient with non-A-E hepatitis. Journal of General Virology, 1996,77:2713～2720
[7] Kao JH, Chen PJ, Hsiang SC et al. Phylogenetic analysis of GB virus C: comparision of isolates from Africa, North America, and Taiwan. Journal of Infectious diseases, 1996,174:410～413
收稿日期1998-03-05修回日期：1998-05-15, http://www.100md.com
单位：马会慧 杨绍基 李 刚 陈雪娟 姚集鲁(中山医科大学传染病学教研室，广州 510630)；廖家杰(香港大学玛丽医院胃肠肝病科，香港)
关键词：庚型肝炎病毒；聚合酶链反应，DNA序列测定，分子克隆
中国病毒学990108 摘 要 采用HGV NS5特异的2对引物，对两个香港株和一个广东株HGV-RNA进行逆转录套式PCR扩增，PCR产物克隆入pUC19，重组质粒转化DH5α和JM109菌株。PCR和酶切法鉴定阳性克隆，双脱氧链末端终止法测定核苷酸序列并进行同源性分析。结果发现核苷酸变异呈散在分布，三株间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为93.3%～94%及97%～99.2%，与已报道的中国株(CN)相比，则同源性分别为90%～91.2%和94%～96.3%，与美国株(PNF2161及R10291)相比，为87.1%～89.5%和95.2%～97%，而与西非株(GBV-C)相比，则达91.4%～93.8%和97%～97.9%。提示HGV NS5区核苷酸和氨基酸序列相对保守，不同HGV株存在一定的地区差异。
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庚型肝炎病毒(HGV)是两年前发现的一种新型肝炎病毒，其基因组包括5′-非编码区(5′-NTR)，3′-非编码区(3′-NTR)，结构蛋白C、E1、E2区，有的株C区缺如，非结构蛋白NS1、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A/5B区[1]。国内外对5′-NTR、E2区、NS3区等的研究报道较多，但对NS5区的报道甚少。为了解中国不同地区之间HGV NS5区基因以及与国外分离株的同源性状况，本研究对HGV NS5区部分基因进行了PCR克隆及序列分析，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 血清标本
两份血清来自香港献血员(A132、A711)，一份血清来自广东的一名慢性乙型肝炎病人
(3027)。
1.2 主要试剂
, http://www.100md.com
RNasin、AMV逆转录酶、Taq DNA聚合酶(购自丰华公司)、pUC19、IPTG、,X-gal(天象人生物工程公司)、低熔点琼脂糖、T4DNA连接酶、BamHI、SmaI、EcoRI、Klenow酶、琼脂酶(宝灵曼公司)。
引物由北京赛百胜生物工程公司合成，序列及位置如下：
33 5′GTT
GCGATGGAGCGCTACAC3′(6672～6697)34 5′CTG
CGTATCATGTATGGTTCT3′(7267～7292)35 5′TCGATTGCTGTAGCTGAGCC3′(6573～6592)
, http://www.100md.com
36 5′GGTAAGTTCATTGCCCACCA3′(7327～7346)
33、34为一对内引物，35、56为一对外引物。单划线部分为BamHI位点，双粗划线部分为EcoRI酶切位点。外引物扩增片段为774bp，内引物扩增片段为618bp。
1.3 PCR产物的获取
采用热变性酶裂解法制备RNA模板[2]。取待检标本50μL，加入裂解液5μL(主要含蛋白酶
K)，55℃ 32min, 98℃ 15min, 12000g/min离心5min。取裂解上清5μL，进行逆转录，反应体积10μL，含引物36、75ng， AMV 11u， 2.5mmol/L dNTP 1.5μL，Rnasin 16u， 42℃ 60min。第一次PCR反应体积为20μL，含逆转录液10μL，引物35为50ng，Taq DNA聚合酶2u。95℃ 40s，55℃ 40s，72℃ 1min 20s，35个循环。第二次PCR反应体积为20μL，内含第一次PCR反应液5μL，引物33为75ng，引物34为75ng，Taq DNA聚合酶2u，95℃ 30s、60℃ 30s，72℃ 40s，30个循环。取10μL在含溴化乙锭的2%的琼脂糖凝胶中电泳，与标准分子量作对照，紫外灯下观察结果。
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1.4 PCR产物的分子克隆
A132、A711的PCR产物用Klenow酶补平，1%低熔点琼脂糖电泳，切下目的条带处的凝胶，琼脂酶消化，乙醇沉淀，回收DNA。用BamHI消化，与用SmaI和BamHI消化的pUC19连接。连接反应总体积20μL，内含回收DNA 10μL，pUC19 6μL，10×连接Buffer 2μL，T4DNA连接酶2u，14℃过夜。加入80μL DH5α受体菌中。而3027株则用BamHI和EcoRI消化，克隆入pUC19的BamHI和EcoRI位点，转化JM109受体菌。受体菌制备及转化条件按文献[3]的方法。碱变性法提取质粒，PCR及单双酶切鉴定阳性克隆。
1.5 DNA序列测定
重组的阳性克隆，pUC19模板采用双脱氧链末端终止法，以DNA全自动测序仪(ABI373)测定核苷酸序列，同一片段经正反两个方向重复测定。
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2 结果
2.1 阳性克隆的鉴定
A132、A711的HGV NS5区的618bp的片段插入pUC19的SmaI和BamHI之间，3027的NS5区的425bp的片段插入在pUC19的EcoRI和BamHI之间。重组质粒pUGN132、pUGN711以及pUGN3027经BamHI单酶切后与空载体pUC19比较电泳时泳动较慢。pUGN132、pUGN711经BamHI和SacI酶切，则切出一条带，与插入片段相符，用特异引物33、34作PCR扩增，获得618bp产物。pUGN3027经EcoRI和BamHI酶切，则切出一条425bp条带，与插入片段相符。用上述克隆进行序列测定。
2.2 HGV的A132、A711、3027 NS5区部分片段的核苷酸序列及与其他分离株的比较 见图1、图2及表1。
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图1 HGV A132(香港株)NS5 cDNA序列与A711(香港株)、3027(广东株)及已报道的CN[4]、PNF2161[1]、R10291[1]和GBV-C[5]分离株相应序列的比较。小写为引物序列。圆点表示与HGV A132株序列相同。
Fig.1 Comparison of NS5 cDNA sequence of HGV A132 (Hong Kong strain)with the corresponding sequences from 3027 (Guangdong strain),A711 (Hong Kong) and the reported isolates (CN, PNF2161,R10291,GBV-C). Small letters stand for the sequence of primers. Dots indicate identity with sequence of HGV A132.
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图2 HGV A132 NS5区推导的氨基酸序列与A711、3027株及CN、PNF2161、R10291、GBV-C相应序列的比较
Fig.2 Comparison of deduced amino acid sequence of HGV A132 NS5 with the corresponding sequences from 3027, A711 strains and CN, PNF2161,R10291,GBV-C isolates
表1 HGVA132、A711、3027株与其他分离株之间的NS5区部分基因同源性比较
Table 1 Homology analysis of HGV NS5 sequence from different strains nt/aa*
A132
, 百拇医药
A711
3027
PNF
R10291
GBV-C
A711
93.3/97.9
-
-
3027
94/99.2
93.8/97
-
, 百拇医药
PNF
87.5/96.8
87.5/96.8
88.3/97
-
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R10291
88/95.8
87.1/95.2
89.5/96.2
92.3/98.4
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GBV-C
91.4/97.9
93.8/97.9
93.3/97
87.9/97.9
88.9/95.2
-
CN
91.2/95.8
90/96.3
90/94
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93.3/96.3
90.9/95.8
90.7/96.8
*nt=nucleotide, aa=amino acid
3 讨论
HGV与HCV相比，其基因组变异小，不存在高变区，同一基因组不同区段变异程度不同[6]，也存在地区差异[7]。5′-非编码区及3′-非编码区高度保守，结构蛋白区变异较大，非结构蛋白区存在保守基序，其中的NS5区报道很少。本研究对两个香港地方株和一个广东株的NS5区部分基因进行了PCR克隆及序列测定分析。三株序列间相比，该段核苷酸的变异小，同源性大于93%，而氨基酸同源性高达97%以上；三株序列各与CN株相比，核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性分别为90%～91.2%和94%～96.3%；而与美国株相比同源性略低，分别为87.1%～89.5%和95.2%～97%；有趣的是，与GBV-C相比，核苷酸的同源性为91.4%～93.8%，氨基酸的同源性则达97%～97.9%。结果提示HGV NS5区的该段基因序列存在一定的地区差异，支持HGV基因变异可能存在地域因素的观点。但总体而言，HGV NS5区的该段基因序列相对保守，7株间相比，核苷酸和氨基酸的同源性分别达87.1%～94%和94%～99.2%。核苷酸变异主要呈散在分布，但以6698～6837bp、7080-7092bp和7157～7251bp(以PNF2161计位)较为集中。
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本研究中3027株所测序列仅有402bp，比设想的片段小167bp，是因为在该段核苷酸的5′端第182bp处存在一个EcoRI酶切位点，当以EcoRI和BamHI酶切时，则仅有425bp连接入pUC19的EcoRI和BamHI之间，这是设计引物应注意的问题。已报道的4株HGV中，CN和GBV-C株在该处存在一个EcoRI酶切位点，而PNF2161和R10291则无，这也与我们所测序列与CN和GBV-C株的同源性高相符。
* 本课题由国家自然科学基金(编号39600130)和广东省医学科学研究基金部分资助
参考文献
[1] Linnen J, Wages J, Zhang-Keck ZY et al. Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus: a transfusion-transmissible agents. Science, 1996, 271:505～508
, http://www.100md.com
[2] 高志良，姚集鲁.热变性HCV RNA模板直接法扩增.中山医科大学学报，1994，15(3)：68
[3] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatios T et al. Molecular cloning. a laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.1989
[4] 周育森，陈薇，赵秋敏等.中国人庚型肝炎病毒全基因cDNA克隆及序列测定.军事科学院院刊，1996，20(4)249～254
[5] Leary TP, Muerhoff AS, JN simons JN et al. Sequence and genomic organization of GBV-C: a novel member of the Flaviridae associated with human non A-E hepatitis. Journal of Medical Virology, 1995,48:60～67
, http://www.100md.com
[6] Erker JC, Simons JN, Muerhoff AS et al. Molecular cloning and characterization of a GB virus C isolate from a patient with non-A-E hepatitis. Journal of General Virology, 1996,77:2713～2720
[7] Kao JH, Chen PJ, Hsiang SC et al. Phylogenetic analysis of GB virus C: comparision of isolates from Africa, North America, and Taiwan. Journal of Infectious diseases, 1996,174:410～413
收稿日期1998-03-05修回日期：1998-05-15, http://www.100md.com