丙型肝炎病毒分子克隆和DNA序列分析
作者：谭德明 胡国龄 有马晖胜 汉波敏彦 田中唯史 张 铮
单位：410008 长沙，湖南医科大学附属第一医院传染病教研室(谭德明，胡国龄，张 铮)；日本鹿儿岛大学第二内科(有马晖胜)；日本kuraray中央研究所(汉波敏彦 田中唯史)
关键词：丙型肝炎病毒；重组，基因；克隆，分子；聚合酶链反应
中华医学杂志930604 摘要 通过聚合酶链反应(PCR)和基因重组技术，从湖南省丙型肝炎病毒感染者的血浆中克隆出了丙型肝炎病毒(HCV-Hun)的部分基因片段，共2307个核苷酸序列。其中包括5′末端非编码区(311bP)、核心区(340bP)，包膜区(397bP)、NS1区(634bP)、NS3区(245bP)，和NS5区(380bP)。HCV-Hun和HCV美国株(HCV-US)以及两个日本丙型肝炎病毒株(HCV-J和HCV-BK)进行比较，5′末端非编码区，核心区的变异较少，其核苷酸和氨基酸序列的同源性均在90%以上，而包膜区，NS1区和NS5区均有较大的变异。HCV-Hun和HCV-US比较，2307个核苷酸序列中，发生了变异的核苷酸有423个(18.3%)，而与两株日本丙型肝炎病毒比较，分别只有175(7.6%)和176(7.6%)个核苷酸发生了变异。这些结果表明，HCV-Hun的基因型类似于HCV-J和HCV-BK。
, 百拇医药
近年来，随着分子生物学技术的发展，已成功地从患非甲非乙型肝炎的猩猩和病人的标本中分离出了丙型肝炎病毒(HCV)的分子克隆，先后已完成了HCV-US〔1〕，HCV-J〔2〕和HCV-BK〔3〕的全部基因序列分析。在这些丙型肝炎病毒克隆之间存在较大的基因变异。我国丙型肝炎病毒感染的初步调查表明，在献血员有肝病患者中有相当数量的丙型肝炎病毒感染〔4～6〕。为了克隆中国型的丙型肝炎病毒并对其基因结构进行分析比较，作者用PCR和基因重组技术从HCV感染者的血浆中分离出了丙型肝炎病毒的部份基因克隆，现将结构报告如下。
材料和方法
一、血清标本
从湖南省某HCV感染高发区抗HCV阳性且血清HCV-RNA阳性的丙型肝炎病毒感染者中无菌采取全血，分离血浆，置-30℃保存备用。
, 百拇医药
二、血清RNA的提取和RT-PCR扩增HCV-cDNA
按照酸性异硫氰酸胍提取RNA的方法〔7〕提取血清RNA，经AMV逆转录酶(Toyobo，日本)作用合成HCV-cDNA。逆转录后的HCV-cDNA进一步经PCR进行扩增，即将100μl的PCR反应液加入到0.5ml离心管中，置DNA扩增仪(Perkin Elmer USA)中经94℃1分钟，55℃1.5分钟，70℃3分钟，共35次循环扩增HCV-cDNA。PCR产物经1%Seakem琼脂糖(FMC，USA)电泳，溴乙啶染色确认。
三、PCR产物的克隆
PCR产物经1%Seakem琼脂糖电泳分离，并用Prep A基因DNA纯化药盒(Bio-Rad，USA)进行纯化和回收。然后与“T”质粒载体连接，转染JM109大肠杆菌，转染后的大肠杆菌经IPTG/Xgal平皿选择菌落。从IPTG/Xgal平皿上挑起白色菌落置2ml LB/Amp培养基中，37℃振荡培养过夜，离心收集细菌，经碱变性溶解法提取质粒，并用限制性内切酶分插筛选带有插入片段重组质粒的JM109大肠杆菌(重组JM109)。
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四、重组质粒的纯化和DNA序列分析
重组JM109接种于10ml LB/Amp培养基中，37℃振荡培养过液，离心收集细菌，提取质粒后再用PEG 6000沉淀纯化。最后用萤光引物Taq-DNA多聚酶循环扩增DNA测序药盒和370A自动DNA测序仪(Applied Biosystems，USA)对重组质粒中的插入片段进行DNA测序。
结 果
采用RT-PCR和基因重组技术，从湖南省某丙型肝炎病毒感染高发区丙型肝炎病毒感染者的血浆中，克隆出了部分丙型肝炎病毒(HCV-Hun)的基因片段，包括5′末端非编码区、核心区、包膜区、NS1区、NS3区和NS5区的基因克隆，共2307个核苷酸序列(附图)。核苷酸序列中的G+C含量较高，占58.5%(1350/2307)。与已知的丙型肝炎病毒的核酸序列比较，HCV-Hun的克隆片段序列有较大的变异。变异以嘌呤碱基之间或嘧啶碱基之间的互变(transition)较为常见，其互变率大于50%(表1)。与HCV-US比较，2307个核苷酸中发生变异的核苷酸423个，占18.3%，与两株日本丙型肝炎病毒HCV-J和HCV-BK进行比较，变异均只有7.6%。丙型肝炎病毒的不同区域，其变异程度有明显的差别。在5′末端非码区HCV-Hun与HCV-US、HCV-J和HCV-BK比较，其核苷酸序列的同源性均在98.1%以上。但在包膜、NS1和NS5区域的克隆序列中，与HCV-US比较，其核苷酸序列的同源性均只有74.3%左右，存在着较大的差别。HCV-Hun各克隆的氨基酸序列的变异趋势也与其核苷酸变异的趋势相似(表2)。
, 百拇医药
表1 HCV-Hun基因克隆重(2307bP)的变异 丙型肝炎病毒株
变异的核苷酸总数
transition
核苷酸数(%)
transversion
核苷酸数(%)
HCV-J
175
131
(74.9)
44
(25.1)
, 百拇医药
HCV-BK
176
135
(76.7)
41
(73.3)
HCV-US
423
238
(56.3)
185
(43.7)
注：transition指嘌呤碱基之间或嘧啶碱基之间的互变 transversion指嘌呤碱基和嘧淀碱基之间的变化
, 百拇医药
附图 HCV的基因结构模式图及HCV-Hun克隆片段的所在部位.1，2，3，4，5，6，分别代表5′非编码区，核心区，包膜区，NS1区，NS3区和NS5区的克隆片段
表2 HCV-Hun各基因克隆变异的比较(%) 区域
HCV-J
HCV-BK
HCV-US
Nt
AA
Nt
AA
Nt
, 百拇医药
AA
5非编码区
4/311(1.3)
-
3/311(1.0)
-
6/311(1.9)
-
核心区
9/340(2.6)
1/311(0.9)
13/340(3.8)
, 百拇医药
2/113(1.8)
25/340(7.4)
3/112(2.3)
包膜区
45/397(11.3)
9/132(6.8)
43/397(10.8)
10/132(7.6)
99/397(25.7)
28/132(20.5)
NS1区
, 百拇医药
67/634(10.6)
19/212(9.0)
62/634(9.8)
17/212(8.0)
160/634(25.2)
35/212(16.5)
NS3区
15/245(5.3)
2/81(2.5)
21/245(7.8)
3/81(3.7)
, 百拇医药
42/245(17.1)
2/81(2.5)
NS5区
35/380(9.9)
11/123(8.9)
34/380(9.6)
14/123(11.4)
91/380(25.2)
23/123(18.7)
合计
175/2307(7.6)
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42/66(6.4)
176/2307(7.6)
46/661(6.7)
423/2307(18.3)
91/661(13.8)
注：表内数据为变异核苷酸数或氨基酸数/总核苷酸数或氨基酸数(%) Nt核苷酸 AA氨基酸
讨 论
丙型肝炎病毒是输血后非甲非乙型肝炎的主要病原之一。近年来，有关丙型肝炎病毒的分子生物学研究的资料显示，丙型肝炎病毒是一种正链RNA病毒，核苷酸序列全长约9400个碱基。除5′末端和3′末端的非编码区外，有一长的阅读框架，编码一个大的多聚蛋白。该多聚蛋白可分解为结构蛋白质，包括核心蛋白和包膜蛋白，以及5个非结构蛋白，即NS1至NS5。根据基因结构和蛋白质的性质，现认炒丙型肝炎病毒可能属于黄病毒或瘟病毒属〔1，2，3，8〕。
, 百拇医药
丙型肝炎病毒基因具有高度的变异性HCV-US和HCV-BK之间核苷酸和氨基酸的同源性分别为77%和86%，说明在不同地区可能存在不同的丙型肝炎病毒的亚型。Okamoto报告了4个不同的丙型肝炎病毒克隆。根据克隆之间的序列比较，发现了与HCV-US相似和差异较大的两种不同的丙型肝炎病毒克隆〔9〕。Enomoto通过核酸杂交技术也证明在日本存在着两个不同的HCV亚型〔10〕。我们所分离出的HCV-Hun部份基因克隆来源于湖南省的HCV感染者，没有接受外来血制品的历史。因此，HCV-Hun是中国型的丙型肝炎病毒之一，通过基因的分析比较，HCV-Hun的基因类似于日本分离的HCV，而不同于HCV-US。我国台湾分离出的丙型肝炎病毒克隆也是如此〔11〕。因此，很可能丙型肝炎病毒存在着亚洲和欧美两种不同的基因型。
尽管HCV的变异较大，但5′末端非编码区的序列相当保守。这一区域的核苷酸序列的同源性均在98～99%。而且其中的重复序列在所有已离的丙型肝炎病毒，包括HCV-Hun均无变化。因此，这一区域很可能对HCV的复制和翻译具有重要的调节作用。与5′末端非编码区相反，包膜区和NS1区的变异最为明显。有报告在包膜基因的3′末端和NS1的5′末端存在两个高度变异区。即使在同一地区不同的HCV感染个体分离出的病毒克隆在这两个高度变异区中，核苷酸的变异高达30～47%，氨基酸序列的变异达40～63%〔12～14〕。我们所克隆的包膜和NS1片段虽然没有包括这两个高度变异区，但与HCV-US比较，核苷酸的变异也分别为25.7%和25.2%。而氨基酸的变异分别为20.5%和16.5%。明显地高于5′末端非编码区和核心区的变异。HCV包膜和NS1区域的高度变异性可能使HCV在感染的过程中逃避机体免疫机制的清除而易转变为持续感染状态和疾病的慢性化。因此，进一步深入地研究HCV高变异区的基因变异，将对阐明HCV的发病机现和探讨防治措施具有重要的意义。
, 百拇医药
注：本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 choo QL,Richman KH,Han JH,et al.Genetic organization and diversityof the hepatits C virus.Proc Natl Acad Sci USA,1991,88:2451.
2 Kato N,Hijikata M,Ootsuyama Y,et al.Molecular cloning of the human hepatitis C virus genome from Japanse patients with nonA,nonB hepatitis.Proc Natl Acad Sci USA,1990,87:954.
3 Takamizawa A,Mori C,Fuke L,et al.Structure and organization of the hepatits C virus genome isolated from human carriers,J virol,1991,65:1105.
, 百拇医药
4 谭德明，胡国龄，张 铮，等.献血员血清中抗HCV的调查和用cDNA/PCR检测血清HCV-RNA.中华流行病学杂志，1991，特5：529.
5 谭德明，胡因龄，张 铮，等.丙型肝炎病毒感染的临床分析.中华内科杂志，1992，31：268.
6 Tao QM,wang H,et al.Seroepidemiology of HCV and HBV infection in northern china Gastroent Jap,1991,26[suppl3]:156.
7 Inchauspe G,Zebedee S,Lee DH,et al.Genomic structure of the human prototype strain H of hepatitio C virus:Comparision with American and Japanese isolates,Proc Natl Acad Sci USA,1991,88:10292.
, 百拇医药
8 Miller RH,Purcell RH.Hepatitis C virus shares amino acid sequence similarity with pestivirrses and flaviviruses as well as members of two plant virussupergroups.Proc Natl Acad Sci USA,1990,87:2057.
9 Okamoto H,okada S,Sugiyama Y,et al.The 5-terminal sequence of hepatitis C virus genome.Japan J Exp Med,1990,60:167.
10 enomoto N,Takada A,Nakao T,et al.There are two major types of hepatitis C virus in Japan.Biochem Biophys Res Commun,1990,170:1021.
, 百拇医药
11 Chen PJ,Lin MH,Tu SJ,et al.Isolation of a complementary DNA fragment of hepatitis C virus in Taiwan revealed significant sequence variations compared with other isolated.Hepatology,1991,14:73.
12 Hijikata M,kato N,Ootsuyama Y,et al.Hypervariable regions in the putative glycoproteins of hepatitis C virus Biochem Biophys Res Commun,1991,175:220.
13 Weiner AJ,Brauer MJ,Rosenblatt J,et al.variable and hypervariable domains are found in the regions of HCV corresponding to the flavivinus envelope and NS proteins and the pestivirus envelope glycoproteins.Virology,1991,180:842.
14 Kato N,Ootsuyama Y,Tanaka T,et al.Marked sequence diversityin the putative envelope proteins of hepatitis C viruses.Virus Res,1992,22:107.
(收稿：1992-09-07 修回：1993-03-21), http://www.100md.com
单位：410008 长沙，湖南医科大学附属第一医院传染病教研室(谭德明，胡国龄，张 铮)；日本鹿儿岛大学第二内科(有马晖胜)；日本kuraray中央研究所(汉波敏彦 田中唯史)
关键词：丙型肝炎病毒；重组，基因；克隆，分子；聚合酶链反应
中华医学杂志930604 摘要 通过聚合酶链反应(PCR)和基因重组技术，从湖南省丙型肝炎病毒感染者的血浆中克隆出了丙型肝炎病毒(HCV-Hun)的部分基因片段，共2307个核苷酸序列。其中包括5′末端非编码区(311bP)、核心区(340bP)，包膜区(397bP)、NS1区(634bP)、NS3区(245bP)，和NS5区(380bP)。HCV-Hun和HCV美国株(HCV-US)以及两个日本丙型肝炎病毒株(HCV-J和HCV-BK)进行比较，5′末端非编码区，核心区的变异较少，其核苷酸和氨基酸序列的同源性均在90%以上，而包膜区，NS1区和NS5区均有较大的变异。HCV-Hun和HCV-US比较，2307个核苷酸序列中，发生了变异的核苷酸有423个(18.3%)，而与两株日本丙型肝炎病毒比较，分别只有175(7.6%)和176(7.6%)个核苷酸发生了变异。这些结果表明，HCV-Hun的基因型类似于HCV-J和HCV-BK。
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近年来，随着分子生物学技术的发展，已成功地从患非甲非乙型肝炎的猩猩和病人的标本中分离出了丙型肝炎病毒(HCV)的分子克隆，先后已完成了HCV-US〔1〕，HCV-J〔2〕和HCV-BK〔3〕的全部基因序列分析。在这些丙型肝炎病毒克隆之间存在较大的基因变异。我国丙型肝炎病毒感染的初步调查表明，在献血员有肝病患者中有相当数量的丙型肝炎病毒感染〔4～6〕。为了克隆中国型的丙型肝炎病毒并对其基因结构进行分析比较，作者用PCR和基因重组技术从HCV感染者的血浆中分离出了丙型肝炎病毒的部份基因克隆，现将结构报告如下。
材料和方法
一、血清标本
从湖南省某HCV感染高发区抗HCV阳性且血清HCV-RNA阳性的丙型肝炎病毒感染者中无菌采取全血，分离血浆，置-30℃保存备用。
, 百拇医药
二、血清RNA的提取和RT-PCR扩增HCV-cDNA
按照酸性异硫氰酸胍提取RNA的方法〔7〕提取血清RNA，经AMV逆转录酶(Toyobo，日本)作用合成HCV-cDNA。逆转录后的HCV-cDNA进一步经PCR进行扩增，即将100μl的PCR反应液加入到0.5ml离心管中，置DNA扩增仪(Perkin Elmer USA)中经94℃1分钟，55℃1.5分钟，70℃3分钟，共35次循环扩增HCV-cDNA。PCR产物经1%Seakem琼脂糖(FMC，USA)电泳，溴乙啶染色确认。
三、PCR产物的克隆
PCR产物经1%Seakem琼脂糖电泳分离，并用Prep A基因DNA纯化药盒(Bio-Rad，USA)进行纯化和回收。然后与“T”质粒载体连接，转染JM109大肠杆菌，转染后的大肠杆菌经IPTG/Xgal平皿选择菌落。从IPTG/Xgal平皿上挑起白色菌落置2ml LB/Amp培养基中，37℃振荡培养过夜，离心收集细菌，经碱变性溶解法提取质粒，并用限制性内切酶分插筛选带有插入片段重组质粒的JM109大肠杆菌(重组JM109)。
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四、重组质粒的纯化和DNA序列分析
重组JM109接种于10ml LB/Amp培养基中，37℃振荡培养过液，离心收集细菌，提取质粒后再用PEG 6000沉淀纯化。最后用萤光引物Taq-DNA多聚酶循环扩增DNA测序药盒和370A自动DNA测序仪(Applied Biosystems，USA)对重组质粒中的插入片段进行DNA测序。
结 果
采用RT-PCR和基因重组技术，从湖南省某丙型肝炎病毒感染高发区丙型肝炎病毒感染者的血浆中，克隆出了部分丙型肝炎病毒(HCV-Hun)的基因片段，包括5′末端非编码区、核心区、包膜区、NS1区、NS3区和NS5区的基因克隆，共2307个核苷酸序列(附图)。核苷酸序列中的G+C含量较高，占58.5%(1350/2307)。与已知的丙型肝炎病毒的核酸序列比较，HCV-Hun的克隆片段序列有较大的变异。变异以嘌呤碱基之间或嘧啶碱基之间的互变(transition)较为常见，其互变率大于50%(表1)。与HCV-US比较，2307个核苷酸中发生变异的核苷酸423个，占18.3%，与两株日本丙型肝炎病毒HCV-J和HCV-BK进行比较，变异均只有7.6%。丙型肝炎病毒的不同区域，其变异程度有明显的差别。在5′末端非码区HCV-Hun与HCV-US、HCV-J和HCV-BK比较，其核苷酸序列的同源性均在98.1%以上。但在包膜、NS1和NS5区域的克隆序列中，与HCV-US比较，其核苷酸序列的同源性均只有74.3%左右，存在着较大的差别。HCV-Hun各克隆的氨基酸序列的变异趋势也与其核苷酸变异的趋势相似(表2)。
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表1 HCV-Hun基因克隆重(2307bP)的变异 丙型肝炎病毒株
变异的核苷酸总数
transition
核苷酸数(%)
transversion
核苷酸数(%)
HCV-J
175
131
(74.9)
44
(25.1)
, 百拇医药
HCV-BK
176
135
(76.7)
41
(73.3)
HCV-US
423
238
(56.3)
185
(43.7)
注：transition指嘌呤碱基之间或嘧啶碱基之间的互变 transversion指嘌呤碱基和嘧淀碱基之间的变化
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附图 HCV的基因结构模式图及HCV-Hun克隆片段的所在部位.1，2，3，4，5，6，分别代表5′非编码区，核心区，包膜区，NS1区，NS3区和NS5区的克隆片段
表2 HCV-Hun各基因克隆变异的比较(%) 区域
HCV-J
HCV-BK
HCV-US
Nt
AA
Nt
AA
Nt
, 百拇医药
AA
5非编码区
4/311(1.3)
-
3/311(1.0)
-
6/311(1.9)
-
核心区
9/340(2.6)
1/311(0.9)
13/340(3.8)
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2/113(1.8)
25/340(7.4)
3/112(2.3)
包膜区
45/397(11.3)
9/132(6.8)
43/397(10.8)
10/132(7.6)
99/397(25.7)
28/132(20.5)
NS1区
, 百拇医药
67/634(10.6)
19/212(9.0)
62/634(9.8)
17/212(8.0)
160/634(25.2)
35/212(16.5)
NS3区
15/245(5.3)
2/81(2.5)
21/245(7.8)
3/81(3.7)
, 百拇医药
42/245(17.1)
2/81(2.5)
NS5区
35/380(9.9)
11/123(8.9)
34/380(9.6)
14/123(11.4)
91/380(25.2)
23/123(18.7)
合计
175/2307(7.6)
, http://www.100md.com
42/66(6.4)
176/2307(7.6)
46/661(6.7)
423/2307(18.3)
91/661(13.8)
注：表内数据为变异核苷酸数或氨基酸数/总核苷酸数或氨基酸数(%) Nt核苷酸 AA氨基酸
讨 论
丙型肝炎病毒是输血后非甲非乙型肝炎的主要病原之一。近年来，有关丙型肝炎病毒的分子生物学研究的资料显示，丙型肝炎病毒是一种正链RNA病毒，核苷酸序列全长约9400个碱基。除5′末端和3′末端的非编码区外，有一长的阅读框架，编码一个大的多聚蛋白。该多聚蛋白可分解为结构蛋白质，包括核心蛋白和包膜蛋白，以及5个非结构蛋白，即NS1至NS5。根据基因结构和蛋白质的性质，现认炒丙型肝炎病毒可能属于黄病毒或瘟病毒属〔1，2，3，8〕。
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丙型肝炎病毒基因具有高度的变异性HCV-US和HCV-BK之间核苷酸和氨基酸的同源性分别为77%和86%，说明在不同地区可能存在不同的丙型肝炎病毒的亚型。Okamoto报告了4个不同的丙型肝炎病毒克隆。根据克隆之间的序列比较，发现了与HCV-US相似和差异较大的两种不同的丙型肝炎病毒克隆〔9〕。Enomoto通过核酸杂交技术也证明在日本存在着两个不同的HCV亚型〔10〕。我们所分离出的HCV-Hun部份基因克隆来源于湖南省的HCV感染者，没有接受外来血制品的历史。因此，HCV-Hun是中国型的丙型肝炎病毒之一，通过基因的分析比较，HCV-Hun的基因类似于日本分离的HCV，而不同于HCV-US。我国台湾分离出的丙型肝炎病毒克隆也是如此〔11〕。因此，很可能丙型肝炎病毒存在着亚洲和欧美两种不同的基因型。
尽管HCV的变异较大，但5′末端非编码区的序列相当保守。这一区域的核苷酸序列的同源性均在98～99%。而且其中的重复序列在所有已离的丙型肝炎病毒，包括HCV-Hun均无变化。因此，这一区域很可能对HCV的复制和翻译具有重要的调节作用。与5′末端非编码区相反，包膜区和NS1区的变异最为明显。有报告在包膜基因的3′末端和NS1的5′末端存在两个高度变异区。即使在同一地区不同的HCV感染个体分离出的病毒克隆在这两个高度变异区中，核苷酸的变异高达30～47%，氨基酸序列的变异达40～63%〔12～14〕。我们所克隆的包膜和NS1片段虽然没有包括这两个高度变异区，但与HCV-US比较，核苷酸的变异也分别为25.7%和25.2%。而氨基酸的变异分别为20.5%和16.5%。明显地高于5′末端非编码区和核心区的变异。HCV包膜和NS1区域的高度变异性可能使HCV在感染的过程中逃避机体免疫机制的清除而易转变为持续感染状态和疾病的慢性化。因此，进一步深入地研究HCV高变异区的基因变异，将对阐明HCV的发病机现和探讨防治措施具有重要的意义。
, 百拇医药
注：本课题为国家自然科学基金资助项目
参考文献
1 choo QL,Richman KH,Han JH,et al.Genetic organization and diversityof the hepatits C virus.Proc Natl Acad Sci USA,1991,88:2451.
2 Kato N,Hijikata M,Ootsuyama Y,et al.Molecular cloning of the human hepatitis C virus genome from Japanse patients with nonA,nonB hepatitis.Proc Natl Acad Sci USA,1990,87:954.
3 Takamizawa A,Mori C,Fuke L,et al.Structure and organization of the hepatits C virus genome isolated from human carriers,J virol,1991,65:1105.
, 百拇医药
4 谭德明，胡国龄，张 铮，等.献血员血清中抗HCV的调查和用cDNA/PCR检测血清HCV-RNA.中华流行病学杂志，1991，特5：529.
5 谭德明，胡因龄，张 铮，等.丙型肝炎病毒感染的临床分析.中华内科杂志，1992，31：268.
6 Tao QM,wang H,et al.Seroepidemiology of HCV and HBV infection in northern china Gastroent Jap,1991,26[suppl3]:156.
7 Inchauspe G,Zebedee S,Lee DH,et al.Genomic structure of the human prototype strain H of hepatitio C virus:Comparision with American and Japanese isolates,Proc Natl Acad Sci USA,1991,88:10292.
, 百拇医药
8 Miller RH,Purcell RH.Hepatitis C virus shares amino acid sequence similarity with pestivirrses and flaviviruses as well as members of two plant virussupergroups.Proc Natl Acad Sci USA,1990,87:2057.
9 Okamoto H,okada S,Sugiyama Y,et al.The 5-terminal sequence of hepatitis C virus genome.Japan J Exp Med,1990,60:167.
10 enomoto N,Takada A,Nakao T,et al.There are two major types of hepatitis C virus in Japan.Biochem Biophys Res Commun,1990,170:1021.
, 百拇医药
11 Chen PJ,Lin MH,Tu SJ,et al.Isolation of a complementary DNA fragment of hepatitis C virus in Taiwan revealed significant sequence variations compared with other isolated.Hepatology,1991,14:73.
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(收稿：1992-09-07 修回：1993-03-21), http://www.100md.com