ELISA法检测人体广州管圆线虫血清抗体的研究
作者：梁韶晖 潘长旺 凌洪博 邢文鸾 黄慧聪
单位：温州医学院寄生虫学教研室 温州 325003
关键词：
实用寄生虫病杂志990108 1997年10-11月，温州市暴发流行以剧烈头痛、恶心、呕吐、低热等为主要症状的嗜酸性粒细胞增多性脑膜炎(简称“酸脑”)[1]。流行病学调查表明，其中有18例患者在发病前10-15天在温州某饭店聚餐，并生吃含有广州管圆线虫幼虫的福寿螺，另有7例也主诉有生吃福寿螺史。在排除其它病因后，临床高度怀疑此次“酸脑”系广州管圆线虫感染所致。但由于人体广州管圆线虫病系广州管圆线虫幼虫寄生于中枢神经系统(尤其是脑组织)而引起的组织损伤和炎症反应，因此临床较难从病人体内获取病原以确诊此病。该病的诊断除依靠临床表现外，尚须借助流行病学和免疫学诊断为依据。笔者等采用ELISA法检测广州管圆线虫病可疑患者血清抗体，结果表明此法具有较高的敏感性和特异性，可作为广州管圆线虫病的辅助诊断方法。现报告如下：
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1 材料和方法
1.1 材料 ①酶结合物 标记的羊抗人IgG。②底物 用3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)配制，临用时按每10ml底物溶液加3%H2O2 0.1ml。③固相载体 PVC凹孔薄膜。④试验血清 i.粪检虫卵阴性健康人血清；ii.疑似广州管圆线虫病患者血清；iii.经ELISA法检测猪囊虫抗体阳性、肺吸虫抗体阳性及旋毛线虫抗体阳性之血清。⑤抗原制备 取人工感染广州管圆线虫第三期幼虫8天的大白鼠解剖，于脑组织内分离得第四期幼虫。取感染40天的大白鼠采血后解剖，于肺动脉内分离得成虫。按文献[7]方法分别获得1%广州管圆线虫四期幼虫粗抗原和1%成虫粗抗原。
1.2 ELISA检测方法 于PVC载体内加入0.2ml 1∶8000包被液稀释的成虫粗抗原(或四期幼虫粗抗原)，37℃孵育2小时后置4℃湿盒内过夜。次日，甩去井内抗原溶液，洗涤液洗涤3次，在各井内加入1∶20稀释的试验血清，混匀37℃孵育10分钟，甩去血清，洗涤3次，加入1∶100稀释的酶结合物0.2ml混匀37℃孵育10分钟，甩去反应液，洗涤3次，加0.2ml TMB溶液反应10分钟后，再加2mol/L H2SO4终止反应，用DG3022型酶联检测仪(华东电子管厂)于450nm处测消光值(OD值)以(P/N2.0判为阳性。
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2 结果 ①成虫粗抗原ELISA法 10例健康人血清全部阴性，OD均值为0.10，OD值范围为0.06-0.13，25例疑似广州管圆线虫病患者血清21例为阳性，OD均值为3.35，范围为2.7-5.7。4例为阴性。猪囊虫抗体阳性和肺吸虫抗体阳性各5例，血清均为阴性。5例旋毛线虫抗体阳性血清中仅一例为阳性(OD值2.6)，其余4例均为阴性。②四期幼虫粗抗原ELISA法 检测10例健康人血清全部阴性，OD均值为0.09，OD值范围为0.04～0.13。25例疑似广州管圆线虫病患者血清，21例阳性，4例为阴性，与成虫抗原ELISA法检测结果一致。
3 讨论 在广州管圆线虫的各种免疫学检查方法中，以ELISA法效果最好[2]。我们用广州管圆线虫成虫粗抗原和四期幼虫粗抗原分别作ELISA法试验，结果无明显差异，可能是由于广州管圆线虫成虫与幼虫存在着较多的共同抗原成分。本试验结果同时结合患者的临床症状及各种流行病学调查，我们认为此21例“酸脑”系为广州管圆线虫病。
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广州管圆线虫病广泛存在于太平洋岛屿和东南亚国家，我国台湾也有较多病例发生，大陆也陆续有所报告[2-5]。温州此次暴发广州管圆线虫病实属罕见。所有患者皆因生吃含有广州管圆线虫幼虫的福寿螺而罹患该病。业已查明福寿螺已成为浙南地区广州管圆线虫的主要中间宿主[1]。福寿螺(Ampullaria gigas)又称大瓶螺，苹果蜗螺等，该螺适应性强，生长繁殖快，易饲养。我国大陆自1981年从台湾引进该螺并很快得以推广养殖。广州管圆线虫在我国的分布区域可能随福寿螺在各地的推广繁衍而得以扩散。当地居民如有生吃福寿螺则可能引发新的病例出现，因此，应引起有关部门高度重视。
致谢：承蒙四川省寄生虫病防治研究所王秀珍、黎世涛老师指导。
4 参考文献
1 潘长旺，等.温州广州管圆线虫宿主的调查研究.温州医学院学报.1998；28(1)∶8.
, 百拇医药
2 赵慰先主编.人体寄生虫学.第2版.北京：人民卫生出版社，1994；785，777.
3 朱师晦.中国大陆人体广州管圆线虫病首例初步报告.广州医学院学报 1984；12(3)∶40.
4 何竞智.广州管圆线虫在我国大陆人群病例的脑脊液中首次发现和证实.广州医学院学报 1984；12(3)∶1.
5 常正山，等.在患者脑脊液中同时查见广州管圆线虫第一期幼虫与发育性雌雄成虫.中国寄生虫学与寄生虫病杂志 1997；15(5)∶285.
6 伍金满，等.用PVC-ELISA法检测实验大鼠广州管圆线虫抗体.中国人兽共患病杂志 1991；7(4)∶15., 百拇医药
单位：温州医学院寄生虫学教研室 温州 325003
关键词：
实用寄生虫病杂志990108 1997年10-11月，温州市暴发流行以剧烈头痛、恶心、呕吐、低热等为主要症状的嗜酸性粒细胞增多性脑膜炎(简称“酸脑”)[1]。流行病学调查表明，其中有18例患者在发病前10-15天在温州某饭店聚餐，并生吃含有广州管圆线虫幼虫的福寿螺，另有7例也主诉有生吃福寿螺史。在排除其它病因后，临床高度怀疑此次“酸脑”系广州管圆线虫感染所致。但由于人体广州管圆线虫病系广州管圆线虫幼虫寄生于中枢神经系统(尤其是脑组织)而引起的组织损伤和炎症反应，因此临床较难从病人体内获取病原以确诊此病。该病的诊断除依靠临床表现外，尚须借助流行病学和免疫学诊断为依据。笔者等采用ELISA法检测广州管圆线虫病可疑患者血清抗体，结果表明此法具有较高的敏感性和特异性，可作为广州管圆线虫病的辅助诊断方法。现报告如下：
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1 材料和方法
1.1 材料 ①酶结合物 标记的羊抗人IgG。②底物 用3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)配制，临用时按每10ml底物溶液加3%H2O2 0.1ml。③固相载体 PVC凹孔薄膜。④试验血清 i.粪检虫卵阴性健康人血清；ii.疑似广州管圆线虫病患者血清；iii.经ELISA法检测猪囊虫抗体阳性、肺吸虫抗体阳性及旋毛线虫抗体阳性之血清。⑤抗原制备 取人工感染广州管圆线虫第三期幼虫8天的大白鼠解剖，于脑组织内分离得第四期幼虫。取感染40天的大白鼠采血后解剖，于肺动脉内分离得成虫。按文献[7]方法分别获得1%广州管圆线虫四期幼虫粗抗原和1%成虫粗抗原。
1.2 ELISA检测方法 于PVC载体内加入0.2ml 1∶8000包被液稀释的成虫粗抗原(或四期幼虫粗抗原)，37℃孵育2小时后置4℃湿盒内过夜。次日，甩去井内抗原溶液，洗涤液洗涤3次，在各井内加入1∶20稀释的试验血清，混匀37℃孵育10分钟，甩去血清，洗涤3次，加入1∶100稀释的酶结合物0.2ml混匀37℃孵育10分钟，甩去反应液，洗涤3次，加0.2ml TMB溶液反应10分钟后，再加2mol/L H2SO4终止反应，用DG3022型酶联检测仪(华东电子管厂)于450nm处测消光值(OD值)以(P/N2.0判为阳性。
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2 结果 ①成虫粗抗原ELISA法 10例健康人血清全部阴性，OD均值为0.10，OD值范围为0.06-0.13，25例疑似广州管圆线虫病患者血清21例为阳性，OD均值为3.35，范围为2.7-5.7。4例为阴性。猪囊虫抗体阳性和肺吸虫抗体阳性各5例，血清均为阴性。5例旋毛线虫抗体阳性血清中仅一例为阳性(OD值2.6)，其余4例均为阴性。②四期幼虫粗抗原ELISA法 检测10例健康人血清全部阴性，OD均值为0.09，OD值范围为0.04～0.13。25例疑似广州管圆线虫病患者血清，21例阳性，4例为阴性，与成虫抗原ELISA法检测结果一致。
3 讨论 在广州管圆线虫的各种免疫学检查方法中，以ELISA法效果最好[2]。我们用广州管圆线虫成虫粗抗原和四期幼虫粗抗原分别作ELISA法试验，结果无明显差异，可能是由于广州管圆线虫成虫与幼虫存在着较多的共同抗原成分。本试验结果同时结合患者的临床症状及各种流行病学调查，我们认为此21例“酸脑”系为广州管圆线虫病。
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广州管圆线虫病广泛存在于太平洋岛屿和东南亚国家，我国台湾也有较多病例发生，大陆也陆续有所报告[2-5]。温州此次暴发广州管圆线虫病实属罕见。所有患者皆因生吃含有广州管圆线虫幼虫的福寿螺而罹患该病。业已查明福寿螺已成为浙南地区广州管圆线虫的主要中间宿主[1]。福寿螺(Ampullaria gigas)又称大瓶螺，苹果蜗螺等，该螺适应性强，生长繁殖快，易饲养。我国大陆自1981年从台湾引进该螺并很快得以推广养殖。广州管圆线虫在我国的分布区域可能随福寿螺在各地的推广繁衍而得以扩散。当地居民如有生吃福寿螺则可能引发新的病例出现，因此，应引起有关部门高度重视。
致谢：承蒙四川省寄生虫病防治研究所王秀珍、黎世涛老师指导。
4 参考文献
1 潘长旺，等.温州广州管圆线虫宿主的调查研究.温州医学院学报.1998；28(1)∶8.
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2 赵慰先主编.人体寄生虫学.第2版.北京：人民卫生出版社，1994；785，777.
3 朱师晦.中国大陆人体广州管圆线虫病首例初步报告.广州医学院学报 1984；12(3)∶40.
4 何竞智.广州管圆线虫在我国大陆人群病例的脑脊液中首次发现和证实.广州医学院学报 1984；12(3)∶1.
5 常正山，等.在患者脑脊液中同时查见广州管圆线虫第一期幼虫与发育性雌雄成虫.中国寄生虫学与寄生虫病杂志 1997；15(5)∶285.
6 伍金满，等.用PVC-ELISA法检测实验大鼠广州管圆线虫抗体.中国人兽共患病杂志 1991；7(4)∶15., 百拇医药