一种携载抗黑热病药物两性霉素B控释系统的研制
作者：王雅静 李雄伟 曹伟民 刘佳林
单位：王雅静(华西医科大学寄生虫学教研室，成都 610041)；李雄伟(中国科学院成都有机化学研究所)；曹伟民(中国科学院成都有机化学研究所)；刘佳林(中国科学院成都有机化学研究所)
关键词：藻酸盐；毫微粒；两性霉素B；黑热病
实用寄生虫病杂志000102 摘要 采用天然高分子材料-阴离子聚多糖作为两性霉素B的载体基质，研制高分子材料两性霉素B控释系统。由离子凝胶作用所产生的阴离子多糖毫微粒，其粒径约30～100nm，并且对两性霉素B具有优良的携载性能，携载效率超过90%，载药量达35%。体外释放实验表明携载于海藻酸钠粒子上的两性霉素B可从粒子载体上逐渐释放出来，其释放规律几近于零级释放。本实验制得的海藻酸钠粒子两性霉素B可进一步用于治疗实验犬内脏利什曼病，并且为治疗黑热病提供动物实验依据。
, 百拇医药
中图分类号：R944.9；R978.61 文献标识码：B
文章编号：1005-2534(2000)01-0006-03
PREPARATION OF ALGINATE NANOPARTICLES LOADING
AMPHOTERICIN B AGAINST LEISHMANIASIS
Wang Yajing
(Laboratory of Parasitology, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610044)
Li Xiongwei
, 百拇医药 (Chengdu Institute of Organic Chemistry, Chinese Academy of Sciences)
Cao Weimin
(Chengdu Institute of Organic Chemistry, Chinese Academy of Sciences)
Liu Jialin
(Chengdu Institute of Organic Chemistry, Chinese Academy of Sciences)
ABSTRACT To develop controlled release formulation of amphotercin B, an alginate nanoparticles system has been studied. The alginate nanoparticles were prepared in a water system by an ionic gelation process. The particle size ranged from 30～100 nm according to the transission electronmicrogram.On alginate nanoparticle, the loading efficiency and content of amphotericin B reached above 90% and 35% respectively. In vitro release experiment showed that the release of amphotericin B loaded on alginate nanoparticle could be potentially controlled. The alginate amphotericin B obtained in the experiment would be applied in treatment of canine leishmaniasis.
, 百拇医药
Key words: alginate; nanoparticle; amphotericin B; leishmaniasis
在我国陇南、川北地区，患内脏利什曼病的犬是当地黑热病的主要传染源，但山区群众普遍有养犬看家、狩猎及保护农作物的习惯，一户养犬可多达数只，犬的数量愈来愈多。大范围灭犬措施难以被群众所接受[1]。因此，非常需要一种治疗犬内脏利什曼病的药物。可生物降解高分子用作药物载体具有生物相容、无毒、安全等优点[2]。本实验制得的海藻酸钠粒子两性霉素B可进一步用于治疗实验犬内脏利什曼病，并且为治疗黑热病提供动物实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 海藻酸钠 化学纯，上海化学试剂站。
, 百拇医药
1.1.2 氯化钙 分析纯，成都临江化工厂。
1.1.3 两性霉素B 上海先锋药业公司。
1.1.4 PBS 0.01mol/L，pH 7.3，Unipath Ltd. 英国。
1.2 阴离子多糖毫微粒的制备[3]
10ml 0.5%海藻酸钠溶液置于烧杯中，搅拌条件下，加入1ml 20mmol/L CaCl2溶液，搅拌30min，产物粒子用透射电镜检测其粒径及分布。
1.3 两性霉素B的携载
两性霉素B溶于蒸馏水中成5mg/ml浓度，1ml两性霉素B溶液加入10ml海藻酸钠溶液中，电磁搅拌1小时，加入1ml 20mmol/L CaCl2溶液，继续搅拌30分钟。离心分离海藻酸钠粒子(30 000g, 15min)，其上清液用可见分光光度计测试。海藻酸钠两性霉素B携载量由差减法算出。分离后的海藻酸钠粒子用1ml PBS重新悬浮。
, http://www.100md.com
1.4 两性霉素B校正曲线的制备
两性霉素B溶于PBS配成各种浓度的溶液，分别为0.05mg/ml，0.1mg/ml，0.2mg/ml，0.4mg/ml，0.6mg/ml。采用紫外分光光度计检测各种浓度溶液的吸收值。在水相中，两性霉素B的光谱吸收在390nm处有最大吸收值。在此特征吸收峰所处的波长，分别检测各浓度溶液的吸收值，作出浓度吸收校正曲线。
1.5 两性霉素B从海藻酸钠粒子上的释放
取2ml(25mg/ml)携载两性霉素B的海藻酸钠粒子于室温下间歇振荡，两周之内，每日通过离心分离收集上清液，并将粒子重新悬浮于2ml新鲜PBS之中。取1ml释放介质上清液加入2ml PBS中，在390nm检测分散介质的吸收值，对照标准曲线，算出释放介质中的两性霉素B含量，绘出两性霉素B的累积释放曲线。
2 结果
, 百拇医药
2.1 海藻酸钠粒子的制备及粒径
由于海藻酸钠中有大量的羧基存在，其聚合物为阴离子特性。当在其水溶液中加入多价阳离子后，正负离子间的凝胶作用使溶解在水中的海藻酸钠多糖直链形成粒子。透射电镜观察结果表明，由离子凝胶作用所产生的粒子，其粒径为30～100nm。
2.2 两性霉素B的载药量及携载效率
由于两性霉素B与海藻酸钠之间正负离子的相互作用以及分子之间亲、疏水性的相互作用，使药物分子缠结在海藻酸钠高分子链上，在海藻酸钠成粒过程中，药物被包裹起来。实验结果表明，阴离子多糖藻酸钠对两性霉素B具有优良的携载性能。携载效率超过90%，载药量达35%(附表)。优良的携载效率表明了两性霉素B与多糖的亲和性。
附表 两性霉素B的包封效率及海藻酸钠粒子对两性霉素B的携载能力 两性霉素B总量
, 百拇医药
(mg)
海藻酸钠重量
(mg)
两性霉素B浓度
(mg/ml)
包封效率
(%)
携载两性霉素B量
(%)
0.5
50
0.071
92.77
, 百拇医药
0.93
1.0
50
0.143
90.70
1.81
2.0
50
0.286
82.62
3.30
4.0
50
, http://www.100md.com
0.571
97.57
7.81
5.0
25
1.000
96.16
19.23
9.4
25
1.875
97.35
36.51
, http://www.100md.com
2.3 藻酸盐粒子对两性霉素B的控释作用
室温条件及磷酸盐缓冲液释放介质系统条件下的体外释放实验给出了藻酸盐纳米粒子对两性霉素B的释放数据 (图1)。携载于海藻酸钠纳米粒子上的两性霉素B可从粒子载体上逐步释放出来，其释放规律几近于零级释放。
图1 两性霉素B从两性霉素B-海藻酸钠粒子上释放-时间曲线，粒子量为50mg
3 讨论
两性霉素B对治疗黑热病有较好的疗效，但其较强的毒性限制了其在临床上的应用。我们采用了天然高分子材料—阴离子聚多糖作为两性霉素B的载体基质，研制高分子材料两性霉素B控释系统。由正负离子作用所产生的阴离子多糖毫微粒对两性霉素B具有优良的携载性能，而且携载于海藻酸钠粒子上的两性霉素B可从粒子载体上逐渐释放出来。该控释系统可延长两性霉素B的作用时间，对降低两性霉素B的生物毒性也具有重要作用。
, 百拇医药
目前临床上治疗黑热病人主要采用五价锑剂如葡萄糖酸锑钠或甲基葡萄糖胺锑，不但毒副作用大，失效率也较高，近年报道对锑剂产生抗药性病例明显增多。而且五价锑治疗病犬效果不好。海藻酸盐为从海藻中提取的1-4，β-D甘露糖醛酸和α-L右洛糖醛酸残基的共聚物，无毒、生物相容，与脂质体比较，对网状内皮系统具有较好的靶向作用[3,4]。其在生物医学及药学研究中有很多应用。现在大量的研究报道表明，高分子材料用作药物载体可产生期望的药理药效作用，如减少用药剂量，降低毒性，减少副作用[3]。在消灭病犬难以全面实施的情况下，本实验制得的海藻酸钠两性霉素B可用于治疗实验犬内脏利什曼病，并且可能为治疗黑热病人提供动物实验依据。
参考文献
1，胡孝素，吴远祥，林芳清，等. 用McAb—AST及骨髓涂片法对四川省汶川县犬感染利什曼原虫的调查研究〔J〕.中国人兽共患病杂志，1991;7(4)∶5
, 百拇医药
2，Chandra R,Rustgis R. Biodegradable polymers〔J〕. Prog Polym Sci，1998; 23∶1273
3，李雄伟，等. 一种高分子微球及其制法和用途〔P〕. 中国发明专利CN 1132758A
4，McDougall IR, et al. Distribution and fate of synthetic lipid vesicles in the mouse:A combined radionuclide and spin label study〔J〕. Proc Natl Acad Sci USA， 1974;71∶3487, 百拇医药
单位：王雅静(华西医科大学寄生虫学教研室，成都 610041)；李雄伟(中国科学院成都有机化学研究所)；曹伟民(中国科学院成都有机化学研究所)；刘佳林(中国科学院成都有机化学研究所)
关键词：藻酸盐；毫微粒；两性霉素B；黑热病
实用寄生虫病杂志000102 摘要 采用天然高分子材料-阴离子聚多糖作为两性霉素B的载体基质，研制高分子材料两性霉素B控释系统。由离子凝胶作用所产生的阴离子多糖毫微粒，其粒径约30～100nm，并且对两性霉素B具有优良的携载性能，携载效率超过90%，载药量达35%。体外释放实验表明携载于海藻酸钠粒子上的两性霉素B可从粒子载体上逐渐释放出来，其释放规律几近于零级释放。本实验制得的海藻酸钠粒子两性霉素B可进一步用于治疗实验犬内脏利什曼病，并且为治疗黑热病提供动物实验依据。
, 百拇医药
中图分类号：R944.9；R978.61 文献标识码：B
文章编号：1005-2534(2000)01-0006-03
PREPARATION OF ALGINATE NANOPARTICLES LOADING
AMPHOTERICIN B AGAINST LEISHMANIASIS
Wang Yajing
(Laboratory of Parasitology, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610044)
Li Xiongwei
, 百拇医药 (Chengdu Institute of Organic Chemistry, Chinese Academy of Sciences)
Cao Weimin
(Chengdu Institute of Organic Chemistry, Chinese Academy of Sciences)
Liu Jialin
(Chengdu Institute of Organic Chemistry, Chinese Academy of Sciences)
ABSTRACT To develop controlled release formulation of amphotercin B, an alginate nanoparticles system has been studied. The alginate nanoparticles were prepared in a water system by an ionic gelation process. The particle size ranged from 30～100 nm according to the transission electronmicrogram.On alginate nanoparticle, the loading efficiency and content of amphotericin B reached above 90% and 35% respectively. In vitro release experiment showed that the release of amphotericin B loaded on alginate nanoparticle could be potentially controlled. The alginate amphotericin B obtained in the experiment would be applied in treatment of canine leishmaniasis.
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Key words: alginate; nanoparticle; amphotericin B; leishmaniasis
在我国陇南、川北地区，患内脏利什曼病的犬是当地黑热病的主要传染源，但山区群众普遍有养犬看家、狩猎及保护农作物的习惯，一户养犬可多达数只，犬的数量愈来愈多。大范围灭犬措施难以被群众所接受[1]。因此，非常需要一种治疗犬内脏利什曼病的药物。可生物降解高分子用作药物载体具有生物相容、无毒、安全等优点[2]。本实验制得的海藻酸钠粒子两性霉素B可进一步用于治疗实验犬内脏利什曼病，并且为治疗黑热病提供动物实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 海藻酸钠 化学纯，上海化学试剂站。
, 百拇医药
1.1.2 氯化钙 分析纯，成都临江化工厂。
1.1.3 两性霉素B 上海先锋药业公司。
1.1.4 PBS 0.01mol/L，pH 7.3，Unipath Ltd. 英国。
1.2 阴离子多糖毫微粒的制备[3]
10ml 0.5%海藻酸钠溶液置于烧杯中，搅拌条件下，加入1ml 20mmol/L CaCl2溶液，搅拌30min，产物粒子用透射电镜检测其粒径及分布。
1.3 两性霉素B的携载
两性霉素B溶于蒸馏水中成5mg/ml浓度，1ml两性霉素B溶液加入10ml海藻酸钠溶液中，电磁搅拌1小时，加入1ml 20mmol/L CaCl2溶液，继续搅拌30分钟。离心分离海藻酸钠粒子(30 000g, 15min)，其上清液用可见分光光度计测试。海藻酸钠两性霉素B携载量由差减法算出。分离后的海藻酸钠粒子用1ml PBS重新悬浮。
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1.4 两性霉素B校正曲线的制备
两性霉素B溶于PBS配成各种浓度的溶液，分别为0.05mg/ml，0.1mg/ml，0.2mg/ml，0.4mg/ml，0.6mg/ml。采用紫外分光光度计检测各种浓度溶液的吸收值。在水相中，两性霉素B的光谱吸收在390nm处有最大吸收值。在此特征吸收峰所处的波长，分别检测各浓度溶液的吸收值，作出浓度吸收校正曲线。
1.5 两性霉素B从海藻酸钠粒子上的释放
取2ml(25mg/ml)携载两性霉素B的海藻酸钠粒子于室温下间歇振荡，两周之内，每日通过离心分离收集上清液，并将粒子重新悬浮于2ml新鲜PBS之中。取1ml释放介质上清液加入2ml PBS中，在390nm检测分散介质的吸收值，对照标准曲线，算出释放介质中的两性霉素B含量，绘出两性霉素B的累积释放曲线。
2 结果
, 百拇医药
2.1 海藻酸钠粒子的制备及粒径
由于海藻酸钠中有大量的羧基存在，其聚合物为阴离子特性。当在其水溶液中加入多价阳离子后，正负离子间的凝胶作用使溶解在水中的海藻酸钠多糖直链形成粒子。透射电镜观察结果表明，由离子凝胶作用所产生的粒子，其粒径为30～100nm。
2.2 两性霉素B的载药量及携载效率
由于两性霉素B与海藻酸钠之间正负离子的相互作用以及分子之间亲、疏水性的相互作用，使药物分子缠结在海藻酸钠高分子链上，在海藻酸钠成粒过程中，药物被包裹起来。实验结果表明，阴离子多糖藻酸钠对两性霉素B具有优良的携载性能。携载效率超过90%，载药量达35%(附表)。优良的携载效率表明了两性霉素B与多糖的亲和性。
附表 两性霉素B的包封效率及海藻酸钠粒子对两性霉素B的携载能力 两性霉素B总量
, 百拇医药
(mg)
海藻酸钠重量
(mg)
两性霉素B浓度
(mg/ml)
包封效率
(%)
携载两性霉素B量
(%)
0.5
50
0.071
92.77
, 百拇医药
0.93
1.0
50
0.143
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1.81
2.0
50
0.286
82.62
3.30
4.0
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0.571
97.57
7.81
5.0
25
1.000
96.16
19.23
9.4
25
1.875
97.35
36.51
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2.3 藻酸盐粒子对两性霉素B的控释作用
室温条件及磷酸盐缓冲液释放介质系统条件下的体外释放实验给出了藻酸盐纳米粒子对两性霉素B的释放数据 (图1)。携载于海藻酸钠纳米粒子上的两性霉素B可从粒子载体上逐步释放出来，其释放规律几近于零级释放。
图1 两性霉素B从两性霉素B-海藻酸钠粒子上释放-时间曲线，粒子量为50mg
3 讨论
两性霉素B对治疗黑热病有较好的疗效，但其较强的毒性限制了其在临床上的应用。我们采用了天然高分子材料—阴离子聚多糖作为两性霉素B的载体基质，研制高分子材料两性霉素B控释系统。由正负离子作用所产生的阴离子多糖毫微粒对两性霉素B具有优良的携载性能，而且携载于海藻酸钠粒子上的两性霉素B可从粒子载体上逐渐释放出来。该控释系统可延长两性霉素B的作用时间，对降低两性霉素B的生物毒性也具有重要作用。
, 百拇医药
目前临床上治疗黑热病人主要采用五价锑剂如葡萄糖酸锑钠或甲基葡萄糖胺锑，不但毒副作用大，失效率也较高，近年报道对锑剂产生抗药性病例明显增多。而且五价锑治疗病犬效果不好。海藻酸盐为从海藻中提取的1-4，β-D甘露糖醛酸和α-L右洛糖醛酸残基的共聚物，无毒、生物相容，与脂质体比较，对网状内皮系统具有较好的靶向作用[3,4]。其在生物医学及药学研究中有很多应用。现在大量的研究报道表明，高分子材料用作药物载体可产生期望的药理药效作用，如减少用药剂量，降低毒性，减少副作用[3]。在消灭病犬难以全面实施的情况下，本实验制得的海藻酸钠两性霉素B可用于治疗实验犬内脏利什曼病，并且可能为治疗黑热病人提供动物实验依据。
参考文献
1，胡孝素，吴远祥，林芳清，等. 用McAb—AST及骨髓涂片法对四川省汶川县犬感染利什曼原虫的调查研究〔J〕.中国人兽共患病杂志，1991;7(4)∶5
, 百拇医药
2，Chandra R,Rustgis R. Biodegradable polymers〔J〕. Prog Polym Sci，1998; 23∶1273
3，李雄伟，等. 一种高分子微球及其制法和用途〔P〕. 中国发明专利CN 1132758A
4，McDougall IR, et al. Distribution and fate of synthetic lipid vesicles in the mouse:A combined radionuclide and spin label study〔J〕. Proc Natl Acad Sci USA， 1974;71∶3487, 百拇医药