微卫星体简单重复序列锚定PCR扩增技术(SSR－PCR)及其在寄生虫基因研究中的应用
作者：冯友仁 牛安欧
单位：冯友仁(同济医科大学寄生虫学教研室，武汉 430030)；牛安欧(同济医科大学寄生虫学教研室，武汉 430030)
关键词：
实用寄生虫病杂志000123 中图分类号：R38 文献标识码：B
文章编号：1005-2534(2000)01-0033-02
寄生虫基因变异现象是普遍存在的，了解其变异情况有助于寄生虫的防治控制及疫苗研制。早期的限制性酶切片段长度多态性(RFLP)等分子生物学技术的运用极大地推动了寄生虫遗传变异研究的深入发展。由于这些方法复杂、费时且DNA需求量大，因而未广泛使用；特异性PCR检测DNA多态性，需预知靶基因核苷酸序列，设计合成特异性扩增引物，也限制了其广泛应用；90年代初报道的随机扩增多态性DNA技术(RAPD)，对DNA差异研究敏感有效，但重复稳定性差。新近出现的基于微卫星体DNA的简单重复序列锚定PCR扩增技术(simple sequence repeat-anchored PCR,SSR-PCR)，具有简便、快速、敏感及较好重复稳定性的特点。本文就SSR-PCR有关原理及应用作一简要概述。
, 百拇医药
1 微卫星体DNA及其特点
在部分微生物及人和动物等基因组中，存在一些由寡核苷酸串联、重复排列而成的DNA序列，称为“数量可变的串联重复序列”(variable number of tandem repeat,VNTR)。其中重复序列为6～70bp的称为小卫星体DNA(minisatellite DNA)；在基因组的间隔顺序和内含子等非编码区内，广泛存在与小卫星体DNA类似的另一类短串联重复序列，由1～6bp作核心单位，在多串联拷贝上重复而成，称为微卫星体DNA(microsatellite DNA)，或称简单重复序列(SSR),如GACA、GATA、TCC、CA、CT等。
小卫星体DNA和微卫星体DNA都属于自私DNA(selfish DNA)，它们的存在是其自主复制形成的。DNA复制过程中的“链滑”(strand slippage)作用可能是造成微卫星体DNA多态性的主要原因。微卫星体DNA与小卫星体DNA相比，除重复单位长度不同外，微卫星体DNA还具有不同特点。微卫星体DNA存在于染色体任何部位，重复次数达10～60次，总序列长度从几十到几百bp，一般不超过300bp，存在数目很多，可达10万个，重复单位变异程度低约1/104～106；而小卫星体DNA只存在于染色体近端粒和着丝粒区，重复次数可达几百次，总长度远比微卫星体DNA长，可达30kb，存在数目有限，有些染色体尚未发现，重复单位可发生单个碱基的变异。从符合遗传标记的高度多态，杂合性高，突变率低的标准来看，微卫星体DNA比小卫星体DNA更优越。
, 百拇医药
微卫星体在真核生物基因组中富含(CA)n.(GT)n二聚体，而又以CA序列重复频率最高。微卫星体DNA作为一种新的遗传标记，具有种类多，分布广，高度多态，重组率低，容易筛选，并且顺序化，呈孟德尔显性遗传。微卫星体DNA已广泛应用于基因作图，法医、遗传疾病及种群研究。与小卫星体DNA相比，微卫星体DNA长度较短，更适合于PCR研究基因多态性差异。
2 SSR-PCR基本原理
由于真核生物中富含CA重复序列，SSR-PCR就是针对高度密集的CA微卫星体简单重复序列，设计与之互补的重复CA碱基作单引物扩增其重复片段，从而揭示其多态性。但是由于重复CA引物针对高度重复的靶位点，容易形成扩增条带的涂布现象(smear)，使扩增产物难以辩认。在重复CA引物的3′端或5′端锚定引物，从而减少引物的作用位点，增加特异性，克服涂布现象。这种简单重复序列锚定引物PCR扩增技术(SSR-PCR)，就是在严格条件下，用(CA)8RY作为引物，即在3′端或5′端锚定一分子嘌呤和-分子嘧啶的8个CA重复序列引物，进行PCR反应，扩增产物在丙烯酰胺凝胶中电泳，染色观察结果。SSR-PCR不是检测靶微卫星体序列的长度变异，而是检测CA重复区域间有无碱基插入，缺失及突变等多态性变异。
, 百拇医药
SSR-PCR反应条件基本同一般PCR，只是引物为单引物(CA)8RY。一般循环温度为94℃变性30秒，退火温度为52℃45秒，延伸温度为72℃60秒。产物用6%丙烯酰胺凝胶电泳，银染观察结果。
3 SSR-PCR的方法学评价
SSR-PCR技术除了具有一般PCR的简便、安全和快速的优点外，还具有DNA用量少，敏感及重复稳定性好的特点。10pg～10ng之间的模板DNA，1.6～25.6pmoles引物浓度，扩增的产物结果相同；不同时间，不同厂家的Taq DNA聚合酶及扩增仪，不同的循环温度，SSR-PCR结果的重复性仍较好。同DNA指纹技术相比，SSR-PCR不但操作简便，而且DNA用量少。与RAPD方法比较，SSR-PCR有两个主要优点：一是只需一个引物就可对不同种株进行多态分析，而RAPD则需对多个引物进行筛选；另一是SSR-PCR在高严谨度的扩增条件下反应，从而避免引物竞争引起的低重复性及假扩增条带。相反、RAPD在退火温度较低的低严谨度的扩增条件下，容易出现假扩增条带及低重复性。另外，影响RAPD结果的Taq酶、循环仪、时间温度及模板引物浓度等因素，对SSR-PCR结果影响较小。SSR-PCR用于基因差异分析优于DNA指纹技术和RAPD方法。
, 百拇医药
4 SSR-PCR在基因研究中的应用
SSR-PCR是基于微卫星体简单重复序列的新技术，该技术用于人、动、植物及寄生虫的研究是近年开始的。现就该技术最近的应用情况举例说明。
Zietkiewicz等首先用锚定的微卫星体简单重复序列作引物进行SSR-PCR扩增。同时对不同的哺乳动物，鸟、爬行类、鱼及植物等真核生物进行扩增，产生易于分辩的条带40～60条，片段长度在200～2000bp之间。大豆等植物扩增条带数少于哺乳动物，这和基因库中植物微卫星体CA重复序列不如哺乳动物丰富相符。而细菌只产生1条独带。对同一物种的不同个体进行扩增也产生较好效果。
Oliveira等用(CA)8RY引物对16株枯氏锥虫基因组进行SSR-PCR分析，结果显示3000bp以下可见的高度多态性条带26.8±3.3个。将扩增结果与RAPD和DNA指纹技术进行比较，SSR-PCR平均共享片段为23%，RAPD为25%，DAN指纹技术为12%。用表型图象拓扑学分析这三种方法也获得相同的结果。用SSR-PCR对两株曼氏血吸虫及3株巴西利什曼原虫进行多态分析，均获得复杂条带。利什曼原虫之间显示高度多态性，而曼氏血吸虫虫株之间显示较小的多态性，这和RAPD和DNA指纹技术相类似。
, 百拇医药
Gomes等从巴西慢性锥虫病患者分离30株枯氏锥虫，用RAPD和SSR-PCR同时进行遗传学分析。RAPD平均共享度S为71%，而SSR-PCR为59%。根据基因距离差异系数D=1-S，按UPGMA聚类分析法，利用MEGA软件构建表型分类树。结果两种方法所建表型树的拓扑结构差异较小。
5 结语
SSR-PCR技术具有简便、快速及重复稳定性好的优点，用于真核生物基因的遗传变异研究是十分有效的。应用此技术研究种群遗传，分子分类，基因作图及体细胞突变筛选等方面具极大潜力。SSR-PCR可望成为寄生虫分子流行病学中十分有用的工具。
(参考文献略), 百拇医药
单位：冯友仁(同济医科大学寄生虫学教研室，武汉 430030)；牛安欧(同济医科大学寄生虫学教研室，武汉 430030)
关键词：
实用寄生虫病杂志000123 中图分类号：R38 文献标识码：B
文章编号：1005-2534(2000)01-0033-02
寄生虫基因变异现象是普遍存在的，了解其变异情况有助于寄生虫的防治控制及疫苗研制。早期的限制性酶切片段长度多态性(RFLP)等分子生物学技术的运用极大地推动了寄生虫遗传变异研究的深入发展。由于这些方法复杂、费时且DNA需求量大，因而未广泛使用；特异性PCR检测DNA多态性，需预知靶基因核苷酸序列，设计合成特异性扩增引物，也限制了其广泛应用；90年代初报道的随机扩增多态性DNA技术(RAPD)，对DNA差异研究敏感有效，但重复稳定性差。新近出现的基于微卫星体DNA的简单重复序列锚定PCR扩增技术(simple sequence repeat-anchored PCR,SSR-PCR)，具有简便、快速、敏感及较好重复稳定性的特点。本文就SSR-PCR有关原理及应用作一简要概述。
, 百拇医药
1 微卫星体DNA及其特点
在部分微生物及人和动物等基因组中，存在一些由寡核苷酸串联、重复排列而成的DNA序列，称为“数量可变的串联重复序列”(variable number of tandem repeat,VNTR)。其中重复序列为6～70bp的称为小卫星体DNA(minisatellite DNA)；在基因组的间隔顺序和内含子等非编码区内，广泛存在与小卫星体DNA类似的另一类短串联重复序列，由1～6bp作核心单位，在多串联拷贝上重复而成，称为微卫星体DNA(microsatellite DNA)，或称简单重复序列(SSR),如GACA、GATA、TCC、CA、CT等。
小卫星体DNA和微卫星体DNA都属于自私DNA(selfish DNA)，它们的存在是其自主复制形成的。DNA复制过程中的“链滑”(strand slippage)作用可能是造成微卫星体DNA多态性的主要原因。微卫星体DNA与小卫星体DNA相比，除重复单位长度不同外，微卫星体DNA还具有不同特点。微卫星体DNA存在于染色体任何部位，重复次数达10～60次，总序列长度从几十到几百bp，一般不超过300bp，存在数目很多，可达10万个，重复单位变异程度低约1/104～106；而小卫星体DNA只存在于染色体近端粒和着丝粒区，重复次数可达几百次，总长度远比微卫星体DNA长，可达30kb，存在数目有限，有些染色体尚未发现，重复单位可发生单个碱基的变异。从符合遗传标记的高度多态，杂合性高，突变率低的标准来看，微卫星体DNA比小卫星体DNA更优越。
, 百拇医药
微卫星体在真核生物基因组中富含(CA)n.(GT)n二聚体，而又以CA序列重复频率最高。微卫星体DNA作为一种新的遗传标记，具有种类多，分布广，高度多态，重组率低，容易筛选，并且顺序化，呈孟德尔显性遗传。微卫星体DNA已广泛应用于基因作图，法医、遗传疾病及种群研究。与小卫星体DNA相比，微卫星体DNA长度较短，更适合于PCR研究基因多态性差异。
2 SSR-PCR基本原理
由于真核生物中富含CA重复序列，SSR-PCR就是针对高度密集的CA微卫星体简单重复序列，设计与之互补的重复CA碱基作单引物扩增其重复片段，从而揭示其多态性。但是由于重复CA引物针对高度重复的靶位点，容易形成扩增条带的涂布现象(smear)，使扩增产物难以辩认。在重复CA引物的3′端或5′端锚定引物，从而减少引物的作用位点，增加特异性，克服涂布现象。这种简单重复序列锚定引物PCR扩增技术(SSR-PCR)，就是在严格条件下，用(CA)8RY作为引物，即在3′端或5′端锚定一分子嘌呤和-分子嘧啶的8个CA重复序列引物，进行PCR反应，扩增产物在丙烯酰胺凝胶中电泳，染色观察结果。SSR-PCR不是检测靶微卫星体序列的长度变异，而是检测CA重复区域间有无碱基插入，缺失及突变等多态性变异。
, 百拇医药
SSR-PCR反应条件基本同一般PCR，只是引物为单引物(CA)8RY。一般循环温度为94℃变性30秒，退火温度为52℃45秒，延伸温度为72℃60秒。产物用6%丙烯酰胺凝胶电泳，银染观察结果。
3 SSR-PCR的方法学评价
SSR-PCR技术除了具有一般PCR的简便、安全和快速的优点外，还具有DNA用量少，敏感及重复稳定性好的特点。10pg～10ng之间的模板DNA，1.6～25.6pmoles引物浓度，扩增的产物结果相同；不同时间，不同厂家的Taq DNA聚合酶及扩增仪，不同的循环温度，SSR-PCR结果的重复性仍较好。同DNA指纹技术相比，SSR-PCR不但操作简便，而且DNA用量少。与RAPD方法比较，SSR-PCR有两个主要优点：一是只需一个引物就可对不同种株进行多态分析，而RAPD则需对多个引物进行筛选；另一是SSR-PCR在高严谨度的扩增条件下反应，从而避免引物竞争引起的低重复性及假扩增条带。相反、RAPD在退火温度较低的低严谨度的扩增条件下，容易出现假扩增条带及低重复性。另外，影响RAPD结果的Taq酶、循环仪、时间温度及模板引物浓度等因素，对SSR-PCR结果影响较小。SSR-PCR用于基因差异分析优于DNA指纹技术和RAPD方法。
, 百拇医药
4 SSR-PCR在基因研究中的应用
SSR-PCR是基于微卫星体简单重复序列的新技术，该技术用于人、动、植物及寄生虫的研究是近年开始的。现就该技术最近的应用情况举例说明。
Zietkiewicz等首先用锚定的微卫星体简单重复序列作引物进行SSR-PCR扩增。同时对不同的哺乳动物，鸟、爬行类、鱼及植物等真核生物进行扩增，产生易于分辩的条带40～60条，片段长度在200～2000bp之间。大豆等植物扩增条带数少于哺乳动物，这和基因库中植物微卫星体CA重复序列不如哺乳动物丰富相符。而细菌只产生1条独带。对同一物种的不同个体进行扩增也产生较好效果。
Oliveira等用(CA)8RY引物对16株枯氏锥虫基因组进行SSR-PCR分析，结果显示3000bp以下可见的高度多态性条带26.8±3.3个。将扩增结果与RAPD和DNA指纹技术进行比较，SSR-PCR平均共享片段为23%，RAPD为25%，DAN指纹技术为12%。用表型图象拓扑学分析这三种方法也获得相同的结果。用SSR-PCR对两株曼氏血吸虫及3株巴西利什曼原虫进行多态分析，均获得复杂条带。利什曼原虫之间显示高度多态性，而曼氏血吸虫虫株之间显示较小的多态性，这和RAPD和DNA指纹技术相类似。
, 百拇医药
Gomes等从巴西慢性锥虫病患者分离30株枯氏锥虫，用RAPD和SSR-PCR同时进行遗传学分析。RAPD平均共享度S为71%，而SSR-PCR为59%。根据基因距离差异系数D=1-S，按UPGMA聚类分析法，利用MEGA软件构建表型分类树。结果两种方法所建表型树的拓扑结构差异较小。
5 结语
SSR-PCR技术具有简便、快速及重复稳定性好的优点，用于真核生物基因的遗传变异研究是十分有效的。应用此技术研究种群遗传，分子分类，基因作图及体细胞突变筛选等方面具极大潜力。SSR-PCR可望成为寄生虫分子流行病学中十分有用的工具。
(参考文献略), 百拇医药