快速Dot-ELISA检测弓形虫IgG初探
作者：曾明安 陈兴旺 徐亮 周春洪 吴霭玲 周煜民
单位：曾明安(四川省寄生虫病防治研究所， 四川 成都 610041)；陈兴旺(四川省寄生虫病防治研究所， 四川 成都 610041)；徐亮(四川省寄生虫病防治研究所， 四川 成都 610041)；周春洪(广东省江门市卫生防疫站， 广东 江门 529000)；吴霭玲(广东省江门市卫生防疫站， 广东 江门 529000)；周煜民(广东省江门市卫生防疫站， 广东 江门 529000)
关键词：
实用寄生虫病杂志000205 中图分类号：R382.5 文献标识码：B
文章编号：1005-2534(2000)02-0070-02
弓形虫病是一种人兽共患的寄生虫病，在我国平均感染率为5.84%[1]。弓形虫(下简称Toxo)是专性细胞内寄生虫，病原检出率较低，所以免疫学检测仍是诊断本病的一种主要手段。本文以集试验载体和试验容器合一的白色PVC为载体，以快速Dot-ELISA法[2]检测各类血清的Toxo-IgG，结果如下。
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1. 材料及方法
1.1 材料
1.1.1 抗原制备 用B36株弓形虫(中山医科大学陈观今教授惠赠)接种于小白鼠腹腔，3～4天处死小白鼠，以无菌生理盐水冲洗小白鼠腹腔，收集冲洗液，按文献[3]方法纯化速殖子及制备可溶性抗原(Toxo-Ag)，以考马斯亮兰G250法测蛋白含量，低温贮存备用。致敏白色PVC载体的蛋白含量为50μg/ml。每点抗原2μl。
1.1.2 载体 白色PVC系5×2孔平底凹孔板，孔径1cm，孔深0.5cm[2]。
1.1.3 试剂 抗原稀释液为pH 9.6碳酸盐缓冲液。血清、酶结合物稀释液及洗涤液为pH 7.4 PBS-NP40。HRP-羊抗人IgG按改良过碘酸钠法标记[4]，工作浓度1∶400。显色底物为4-氯-1-萘酚-H2O2。
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1.1.4 试验血清 PCR检测证实Toxo为阳性血清12份(四川省计划生育研究所惠赠)；病原学证实为阳性的血吸虫病、华支睾吸虫病和疟疾血清及B超或CT证实为包虫病和囊虫病血清共444份；其他疾病及未知人群血清986份。试验血清稀释度1∶20。
1.2 方法
取预致敏Toxo-Ag的白色PVC板，每孔加PBS 100μl及待测(或参考)血清5μl，混匀，置25℃以上室温或37℃温箱温育10min，倾去液体，加PBS快洗1次，自来水快洗5次，甩干水份，每孔滴 加酶结合物1～2滴，如上温育、洗涤，每孔滴加底物1～2滴，如上温度下显色3min，用自来水冲洗终止反应，判读结果。凡待测血清出现与参阳血清一致的兰紫色斑点者为阳性。无色或呈浅灰色斑点(环)者为阴性。
2 结果
2.1 最佳试验条件选择
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经方阵试验选定：致敏载体的Toxo-Ag蛋白量50μg/ml，血清稀释度1∶20，酶结合物工作浓度1∶400，温育时间为25℃以上室温或37℃温箱10min，显色时间为25℃以上温度下3min为本试验的最佳条件。
2.2 检测PCR阳性血清结果
共检测12份血清，Dot-ELISA全部为阳性，反应强度“+”5份，“++”7份。
2.3 不同人群血清检测结果
2.3.1 已知寄生虫病人血清 检测阳性率分别为：血吸虫病16.2%(53/328)，包虫病9.5%(4/42)，囊虫病4.0%(1/25)，华支睾吸虫病7.4%(2/27)，疟疾0/22。
2.3.2 乙肝标志物阳性血清及其他疾病血清 检测阳性率分别为：乙肝血清3.2%(3/93)，医院免疫室门诊血清2.8%(3/106)，肝癌血清1份阴性。
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2.3.3 未知人群血清 检测阳性率分别为： 儿童5.2%(4/77)，中学生3.5%(14/404)，成人3.3%(10/305)。
2.4 重现性及特异性证实
对首次检测Toxo-IgG阳性的48份血清及阴性的14份血清，相隔1周后重复检测，重现率均为100%。
为证实Dot-ELISA检测的特异性，我们用含蛋白量50μg/ml的Toxo-Ag-PBS对9份PCR及Dot-ELISA均为阳性的血清(“+”4份，“++”5份)作1∶20稀释后，置37℃水浴中和30min后试验，全部为阴性。用包虫抗原和Toxo-Ag同法中和Toxo-IgG阳性的4份包虫病人血清试验，前者Toxo-IgG 1份转阴，3份Toxo-IgG仍为阳性，后者全部转阴。
2.5 预致敏Toxo-Ag的白色PVC保存时效
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将致敏Toxo-Ag的白色PVC板密封于塑料袋中，放4℃8个月后试验，9份阴性血清反应仍为阴性，1份阳性血清为阳性，且反应强度与保存前一致。
2.6 Dot-ELISA与ELISA检测效果比较
ELISA试剂为兰州兽医研究所产品(广东江门市卫生防疫站提供)，按说明书操作。二法平行检测PCR证实为Toxo阳性的血清7份，Dot-ELISA阳性率7/7，商品ELISA试剂检测的阳性率5/7。用商品ELISA试剂检测Dot-ELISA-Toxo-IgG为阳性的血清，阳性率75.0%(15/20)。
3 讨论
本文以B36株Toxo速殖子制备的水溶性抗原为诊断抗原，以白色PVC为载体的Dot-ELISA法检测各类人群血清1 442份，Toxo-IgG平均阳性率7.4%。其中经PCR证实为Toxo阳性的血清，Dot-ELISA阳性率100%，未知人群及其它疾病血清，Toxo-IgG阳性率在2.8%～5.2%之间。5种已知寄生虫感染者血清，Toxo-IgG阳性率：血吸虫病16.2%，包虫病9.5%，华支睾吸虫病7.4%，囊虫病4.0%，22份疟疾血清全部阴性。据文献报告，Toxo与血吸虫成虫、虫卵抗原存在分子量为16kDa的共同抗原[5]，所以，Toxo与急性血吸虫病的交叉阳性率达75.0%，与慢性和晚期血吸虫病的交叉阳性率达6.7%[6]，与华支睾吸虫病的交叉阳性率达11.4%[7]。从这些结果和我们的试验表明，Toxo与蠕虫类寄生虫都有较高的交叉阳性，但从我们对4份Toxo-IgG阳性的包虫病血清中和试验又显示，用Toxo-Ag中和后Toxo-IgG全部转阴，用包虫抗原中和后Toxo-IgG仍有3/4血清呈阳性，这一结果又揭示，Toxo不仅与蠕虫类寄生虫存在共同抗原而导致交叉阳性，且Toxo与蠕虫混合感染的可能性不能排除。
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据蒋和柱等对我省7个县农村人群及动物Toxo感染的血清学调查，人群阳性率平均9.04%，个别县高达20.56%。动物中以羊(25.0%)，猪(20.56%)的阳性率最高，狗、兔的阳性率也在3%左右[8]。本文所检蠕虫病血清均来自我省农村和牧区，这些人群与动物接触十分密切，感染Toxo的可能相对较大，所以，我们认为Toxo除与多种蠕虫有共同抗原而导致交叉阳性外，Toxo与蠕虫混合感染的可能性不能完全排除。由于本文只对包虫病血清进行了中和试验，所以这一问题有待进一步试验去证实。
本次试验中，由于商品ELISA试剂数量较少，只对PCR证实Toxo为阳性和Dot-ELISA试验Toxo-IgG为阳性的部分血清，用商品ELISA试剂进行了检测，从初步结果看，似乎Dot-ELISA的敏感性优于商品ELISA试剂的结果，但由于未对大批量的血清进行平行比较检测，难以评价孰优孰劣，将在进一步的试验中去比较、评价。总之，从本次初步试验，可以肯定的认为以白色PVC为Dot-ELISA的载体检测Toxo-IgG是可行的，且有简便、快速，试剂用量少(尤其是抗原)不需特殊设备等优点，进一步完善和提高检测的敏感性和特异性，本法作为Toxo-IgG检测的一种方法是具有很好的实用价值的。
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参考文献：
[1] 吕元聪，崔君兆.我国部分地区弓形虫病流行病学监测[J].实用寄生虫病杂志，1994，2(3)：19.
[2] 曾明安，屈振麒，陈荣信，等.白色PVC新载体用于Dot-ELISA检测抗华支睾吸虫抗体的初步研究[J].上海免疫学杂志，1992，12(6)：379.
[3] 贾世玉，党 勃，钱云龙，等.应用斑点酶联免疫结合试验检测弓形虫血清抗体[J].中国人兽共患病杂志，1990，6(4)：19.
[4] 蒋成淦.酶免疫测定法[M].北京：人民卫生出版社，1984.45.
[5] 丁贞英，曾小军，袁建华，等.以免疫印迹法对弓形虫和日本血吸虫成虫、虫卵共同抗原的初步分析[J].中国人兽共患病杂志，1991，7(5)：52.
[6] 许雪萍，危仁民，丁贞英，等.弓形虫IHA和ELISA的一种非特异性交叉反应的初步报告[J].中国人兽共患病杂志，1991，7(5)：54.
[7] 危仁民，丁贞英，许雪萍，等.江西省特种人群弓形虫感染的情况调查[J].中国人兽共患病杂志，1991，7(5)：31.
[8] 蒋和柱，范云儒.四川省弓形虫病血清流行病学调查初析[J].中国人兽共患病杂志，1991，7(5)：35., http://www.100md.com
单位：曾明安(四川省寄生虫病防治研究所， 四川 成都 610041)；陈兴旺(四川省寄生虫病防治研究所， 四川 成都 610041)；徐亮(四川省寄生虫病防治研究所， 四川 成都 610041)；周春洪(广东省江门市卫生防疫站， 广东 江门 529000)；吴霭玲(广东省江门市卫生防疫站， 广东 江门 529000)；周煜民(广东省江门市卫生防疫站， 广东 江门 529000)
关键词：
实用寄生虫病杂志000205 中图分类号：R382.5 文献标识码：B
文章编号：1005-2534(2000)02-0070-02
弓形虫病是一种人兽共患的寄生虫病，在我国平均感染率为5.84%[1]。弓形虫(下简称Toxo)是专性细胞内寄生虫，病原检出率较低，所以免疫学检测仍是诊断本病的一种主要手段。本文以集试验载体和试验容器合一的白色PVC为载体，以快速Dot-ELISA法[2]检测各类血清的Toxo-IgG，结果如下。
, http://www.100md.com
1. 材料及方法
1.1 材料
1.1.1 抗原制备 用B36株弓形虫(中山医科大学陈观今教授惠赠)接种于小白鼠腹腔，3～4天处死小白鼠，以无菌生理盐水冲洗小白鼠腹腔，收集冲洗液，按文献[3]方法纯化速殖子及制备可溶性抗原(Toxo-Ag)，以考马斯亮兰G250法测蛋白含量，低温贮存备用。致敏白色PVC载体的蛋白含量为50μg/ml。每点抗原2μl。
1.1.2 载体 白色PVC系5×2孔平底凹孔板，孔径1cm，孔深0.5cm[2]。
1.1.3 试剂 抗原稀释液为pH 9.6碳酸盐缓冲液。血清、酶结合物稀释液及洗涤液为pH 7.4 PBS-NP40。HRP-羊抗人IgG按改良过碘酸钠法标记[4]，工作浓度1∶400。显色底物为4-氯-1-萘酚-H2O2。
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1.1.4 试验血清 PCR检测证实Toxo为阳性血清12份(四川省计划生育研究所惠赠)；病原学证实为阳性的血吸虫病、华支睾吸虫病和疟疾血清及B超或CT证实为包虫病和囊虫病血清共444份；其他疾病及未知人群血清986份。试验血清稀释度1∶20。
1.2 方法
取预致敏Toxo-Ag的白色PVC板，每孔加PBS 100μl及待测(或参考)血清5μl，混匀，置25℃以上室温或37℃温箱温育10min，倾去液体，加PBS快洗1次，自来水快洗5次，甩干水份，每孔滴 加酶结合物1～2滴，如上温育、洗涤，每孔滴加底物1～2滴，如上温度下显色3min，用自来水冲洗终止反应，判读结果。凡待测血清出现与参阳血清一致的兰紫色斑点者为阳性。无色或呈浅灰色斑点(环)者为阴性。
2 结果
2.1 最佳试验条件选择
, http://www.100md.com
经方阵试验选定：致敏载体的Toxo-Ag蛋白量50μg/ml，血清稀释度1∶20，酶结合物工作浓度1∶400，温育时间为25℃以上室温或37℃温箱10min，显色时间为25℃以上温度下3min为本试验的最佳条件。
2.2 检测PCR阳性血清结果
共检测12份血清，Dot-ELISA全部为阳性，反应强度“+”5份，“++”7份。
2.3 不同人群血清检测结果
2.3.1 已知寄生虫病人血清 检测阳性率分别为：血吸虫病16.2%(53/328)，包虫病9.5%(4/42)，囊虫病4.0%(1/25)，华支睾吸虫病7.4%(2/27)，疟疾0/22。
2.3.2 乙肝标志物阳性血清及其他疾病血清 检测阳性率分别为：乙肝血清3.2%(3/93)，医院免疫室门诊血清2.8%(3/106)，肝癌血清1份阴性。
, 百拇医药
2.3.3 未知人群血清 检测阳性率分别为： 儿童5.2%(4/77)，中学生3.5%(14/404)，成人3.3%(10/305)。
2.4 重现性及特异性证实
对首次检测Toxo-IgG阳性的48份血清及阴性的14份血清，相隔1周后重复检测，重现率均为100%。
为证实Dot-ELISA检测的特异性，我们用含蛋白量50μg/ml的Toxo-Ag-PBS对9份PCR及Dot-ELISA均为阳性的血清(“+”4份，“++”5份)作1∶20稀释后，置37℃水浴中和30min后试验，全部为阴性。用包虫抗原和Toxo-Ag同法中和Toxo-IgG阳性的4份包虫病人血清试验，前者Toxo-IgG 1份转阴，3份Toxo-IgG仍为阳性，后者全部转阴。
2.5 预致敏Toxo-Ag的白色PVC保存时效
, http://www.100md.com
将致敏Toxo-Ag的白色PVC板密封于塑料袋中，放4℃8个月后试验，9份阴性血清反应仍为阴性，1份阳性血清为阳性，且反应强度与保存前一致。
2.6 Dot-ELISA与ELISA检测效果比较
ELISA试剂为兰州兽医研究所产品(广东江门市卫生防疫站提供)，按说明书操作。二法平行检测PCR证实为Toxo阳性的血清7份，Dot-ELISA阳性率7/7，商品ELISA试剂检测的阳性率5/7。用商品ELISA试剂检测Dot-ELISA-Toxo-IgG为阳性的血清，阳性率75.0%(15/20)。
3 讨论
本文以B36株Toxo速殖子制备的水溶性抗原为诊断抗原，以白色PVC为载体的Dot-ELISA法检测各类人群血清1 442份，Toxo-IgG平均阳性率7.4%。其中经PCR证实为Toxo阳性的血清，Dot-ELISA阳性率100%，未知人群及其它疾病血清，Toxo-IgG阳性率在2.8%～5.2%之间。5种已知寄生虫感染者血清，Toxo-IgG阳性率：血吸虫病16.2%，包虫病9.5%，华支睾吸虫病7.4%，囊虫病4.0%，22份疟疾血清全部阴性。据文献报告，Toxo与血吸虫成虫、虫卵抗原存在分子量为16kDa的共同抗原[5]，所以，Toxo与急性血吸虫病的交叉阳性率达75.0%，与慢性和晚期血吸虫病的交叉阳性率达6.7%[6]，与华支睾吸虫病的交叉阳性率达11.4%[7]。从这些结果和我们的试验表明，Toxo与蠕虫类寄生虫都有较高的交叉阳性，但从我们对4份Toxo-IgG阳性的包虫病血清中和试验又显示，用Toxo-Ag中和后Toxo-IgG全部转阴，用包虫抗原中和后Toxo-IgG仍有3/4血清呈阳性，这一结果又揭示，Toxo不仅与蠕虫类寄生虫存在共同抗原而导致交叉阳性，且Toxo与蠕虫混合感染的可能性不能排除。
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据蒋和柱等对我省7个县农村人群及动物Toxo感染的血清学调查，人群阳性率平均9.04%，个别县高达20.56%。动物中以羊(25.0%)，猪(20.56%)的阳性率最高，狗、兔的阳性率也在3%左右[8]。本文所检蠕虫病血清均来自我省农村和牧区，这些人群与动物接触十分密切，感染Toxo的可能相对较大，所以，我们认为Toxo除与多种蠕虫有共同抗原而导致交叉阳性外，Toxo与蠕虫混合感染的可能性不能完全排除。由于本文只对包虫病血清进行了中和试验，所以这一问题有待进一步试验去证实。
本次试验中，由于商品ELISA试剂数量较少，只对PCR证实Toxo为阳性和Dot-ELISA试验Toxo-IgG为阳性的部分血清，用商品ELISA试剂进行了检测，从初步结果看，似乎Dot-ELISA的敏感性优于商品ELISA试剂的结果，但由于未对大批量的血清进行平行比较检测，难以评价孰优孰劣，将在进一步的试验中去比较、评价。总之，从本次初步试验，可以肯定的认为以白色PVC为Dot-ELISA的载体检测Toxo-IgG是可行的，且有简便、快速，试剂用量少(尤其是抗原)不需特殊设备等优点，进一步完善和提高检测的敏感性和特异性，本法作为Toxo-IgG检测的一种方法是具有很好的实用价值的。
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参考文献：
[1] 吕元聪，崔君兆.我国部分地区弓形虫病流行病学监测[J].实用寄生虫病杂志，1994，2(3)：19.
[2] 曾明安，屈振麒，陈荣信，等.白色PVC新载体用于Dot-ELISA检测抗华支睾吸虫抗体的初步研究[J].上海免疫学杂志，1992，12(6)：379.
[3] 贾世玉，党 勃，钱云龙，等.应用斑点酶联免疫结合试验检测弓形虫血清抗体[J].中国人兽共患病杂志，1990，6(4)：19.
[4] 蒋成淦.酶免疫测定法[M].北京：人民卫生出版社，1984.45.
[5] 丁贞英，曾小军，袁建华，等.以免疫印迹法对弓形虫和日本血吸虫成虫、虫卵共同抗原的初步分析[J].中国人兽共患病杂志，1991，7(5)：52.
[6] 许雪萍，危仁民，丁贞英，等.弓形虫IHA和ELISA的一种非特异性交叉反应的初步报告[J].中国人兽共患病杂志，1991，7(5)：54.
[7] 危仁民，丁贞英，许雪萍，等.江西省特种人群弓形虫感染的情况调查[J].中国人兽共患病杂志，1991，7(5)：31.
[8] 蒋和柱，范云儒.四川省弓形虫病血清流行病学调查初析[J].中国人兽共患病杂志，1991，7(5)：35., http://www.100md.com