16S～23S rDNA间隔区序列PCR和RFLP分析对分枝杆菌复合菌群鉴定的研究
作者：张灵霞 庄玉辉
单位：100091 北京，解放军309医院结核病研究室
关键词：分枝杆菌复合菌群；PCR；RFLP
中华微生物学和免疫学杂志000410 【 摘要 】 目的 对结核分枝杆菌复合菌群、鸟-胞内分枝杆菌复合菌群以及龟分枝杆菌龟亚种及脓肿亚种等几种快速生长分枝杆菌进行鉴定。 方法 应用通用引物a及结核分枝杆菌特异的引物b，对受试菌种的16S～23S rDNA间隔区序列进行PCR扩增，并对引物a扩增产物进行限制性内切酶HaeⅢ、MSPⅠ消化反应。 结果 应用引物a PCR扩增及RFLP分析能将除结核分枝杆菌复合菌群外的受试的其它菌群中的各菌种区别开；而引物b对受试各菌进行扩增，只有结核分枝杆菌有扩增条带出现，可将结核分枝杆菌与结核分枝杆菌复合菌群的其它菌区别开，达到菌种鉴定目的。 结论 应用16S～23S rDNA间隔区序列PCR和RFLP分析能将结核分枝杆菌复合菌群等几组常规方法难鉴定的菌群加以区别。
, 百拇医药
The study of differentiation of several mycobacterium complex by PCR and RELP analysis of 16S-23S rDNA spacer sequence
ZHANG Lingxia, ZHUANG Yuhui
(Mycobacterium Tuberculosis Research Laboratory, 309 Hospital, Beijing 100091,P.R.China)
【 Abstract 】 Objective To evaluate the value of differentiation of several mycobacterium complex by amplifying 16S-23S rDNA spacer sequence and by restriction enzyme analysis of PCR products at gene level. Method
, 百拇医药
The conservative primer a and special primer b were used to amplify 16S-23S rDNA spacer sequence M. tuberculosis complex, M. avium-M. intracellulare complex and several species of fast-growing mycobacterium such as M. chelonae subsp. chelonae, M. chelonae subsp. abscessus et al. Results The results of PCR and restriction enzyme of PCR products showed that this method was able to differentiate the species tested at species level except M.tuberculosis complex, using special primer b can differentiate M. tuberculosis from other species of the same complex. Conclusion PCR and RFLP analysis of 16S-23S rDNA spacer sequence can differentiate several mycobacterium complex quickly.
, 百拇医药
【 Subject words 】 Mycobacterium complex; PCR; RFLP
分枝杆菌有几组复合菌群，以细菌学反应方法等表型特性往往难以鉴别开，且耗时长。我们应用16S～23S rDNA间隔区序列PCR扩增和RFLP对结核杆菌复合菌群、鸟-胞内分枝杆菌复合群及几种临床致病的快速生长分枝杆菌进行了鉴定，结果报告如下。
材料和方法
菌种来源：如表1 。
引物：a: 5′-GAAGTCGTAACAAGG-3′；5′-CAAGGC
ATCCACCAT-3′。根据文献报道设计，由生工生物工程公司合成。b: 5′-CGGCAGCGTATCCATTGATG-3′；5′-CACGAAAACGCCCCAACTG-3′。根据测序结果，选择碱基的差异性而设计，由赛百胜生物工程公司合成和纯化。
, 百拇医药
仪器及试剂：扩增仪为PETe-1型；电泳系统购自北京六一仪器厂；结核杆菌PCR诊断试剂盒由本室提供；限制性核酸内切酶为Promega公司产品。
分枝杆菌菌种基因组DNA提取：按《分子克隆》一书介绍方法进行。
PCR操作：参照本室设计的25μl扩增体系并稍作改进。引物a以94℃变性1min，45℃退火3min，72℃延伸1min，循环30次后，再延伸7min。引物b以94℃变性1min，65℃退火1min，72℃延伸1min，循环30次后再延伸7min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，紫外检测。
限制性内切酶消化反应：40μl扩增产物用酚-氯仿抽提后，沉淀物用10μl 1×TE溶解，取5μl在10μl反应体系中加入3个单位的限制性核酸内切酶，37℃反应2～3h，取消化产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外检测，判定结果。
, 百拇医药
表1 试验菌种及来源
Table 1. Strains and its sources No of strains
Strains
(n)
Sources
M.tuberculosis H37Rv
1
National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products
Clinical strains of M.tuberculosis
, 百拇医药
58
Hebei Chest Hospital、Henan Chest Hospital
93302
M.bovis
1
National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products
93303
BCG
1
National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products
, http://www.100md.com
93315
M.avium
1
National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products
93314
M.intracellulare
1
National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products
93323
, 百拇医药
M.fortuitum
1
National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products
Clinical strains of M.fortuitum
1
Hebei Chest Hospital
M.chelonae subsp.Chelonae
1
National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products
, http://www.100md.com
Clinical strains of M.chelonae subsp.chelonae
1
Hebei Chest Hospital
93326
M.chelonae subsp.abscessus
1
National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products
Clinical strains of M.chelonae subsp.abscussus
, 百拇医药
50
Shenzhen Sanitary & Anti-Epidemic Station
图1 引物a对结核杆菌复合菌群鉴定结果
Fig 1. The differentiation of M.tuberculosis complex by primer a
1a. The PCR results of 16S-23S rDNA spacer sequence of M.tuberculosis complex by primer a
1b. The HaeⅢ digest result of PCR products of 16S-23S rDNA spacer sequence of M.tuberculosis complex
, http://www.100md.com
1c. The MspI digest result of PCR products of 16S-23S rDNA spacer sequence of M.tuberculosis complex
1. Marker; 2. M.tuberculosis H37Rv; 3. M.bovis; 4. BCG
结果
1.16S～23S rDNA间隔区序列PCR扩增和RFLP分析对结核杆菌复合群进行鉴定：用引物a对结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、BCG进行扩增。扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果表明，3种菌扩增条带数目和大小均完全相同，都只扩出1条相对分子质量(Mr)在340bp左右的带(如图1a)。它们扩增产物的限制性内切酶消化结果也完全相同(图1b,1c)，都被HaeⅢ切成200、100、50bp左右的3条带，被MSPⅠ切成Mr很近的2条带。16S～23S rDNA间隔区序列PCR扩增及扩增产物的限制性片段长度多态性均无法将结核杆菌复合菌群分开。但是根据测序结果，选择碱基差异设计的引物b对它们进行扩增，只有结核分枝杆菌H37Rv扩增出1条250bp的带(图2)，牛分枝杆菌和BCG均无扩增带出现，可将它们鉴定开。对58株结核分枝杆菌临床分离株(38株耐药株，20株敏感株)受试结果与上述结果一致。
, 百拇医药
2.鸟-胞内分枝杆菌复合菌群16S～23S rDNA间隔区序列PCR扩增和RFLP分析：用引物a对鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌进行扩增。结果表明，鸟分枝杆菌扩出2条带，Mr在450、350bp左右，胞内分枝杆菌扩增出1条Mr在350bp左右的条带。扩增产物经限制性核酸内切酶HaeⅢ、MspⅠ酶切后琼脂糖凝胶电泳表明，鸟分枝杆菌被HaeⅢ切成220、200、140、100、50bp左右的5条带，被MspⅠ切成
图2 引物b对结核杆菌复合菌群鉴定结果
Fig 2. The differentiation of M.tuberculosis complex by primer b
1. Marker; 2. M.tuberculosis H37Rv; 3. M.bovis; 4. BCG
, 百拇医药
图3 引物a对鸟-胞内分枝杆菌复合菌群鉴定结果
Fig 3. The differentiation of M.avium-M.intracellulare complex by primer a
a. The PCR results of 16S-23S rDNA spacer sequence of M.avium-M.intracellulare complex by primer a
b. The HaeⅢ digest result of PCR products of 16S-23S rNDA spacer sequence of M.avium-M.intracellulare complex
c. The MspI digest result of PCR products of 16S-23S rDNA spacer sequence of M.avium-M.intracellulare complex
, 百拇医药
1. Marker; 2. M.avium; 3. M.intracellulare340、310、105、50bp左右的4条带，而胞内分枝杆菌被HaeⅢ切成205、140bp左右的2条带，被MspⅠ切成240、105bp左右的2条带。由上可见，无论是单纯的16S～23S rDNA间隔区序列PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳还是RFLP分析都能将鸟-胞内分枝杆菌复合菌群区分开(图3a、b、c)。
3.16S～23S rDNA间隔区序列PCR扩增和RFLP分析对几种快速生长分枝杆菌的鉴定：用引物a对偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌龟亚种、龟分枝杆菌脓肿亚种的16S～23S rDNA间隔区序列进行PCR扩增。扩增产物琼脂糖凝胶电泳表明，偶然分枝杆菌扩增出1条470bp左右的带，龟分枝杆菌龟亚种扩出470，350bp的2条带，龟分枝杆菌脓肿亚种则能扩出380bp左右的1条带。仅靠PCR扩增就能将这3种快速生长的分枝杆菌鉴别开。扩增产物的限制性核酸内切酶HaeⅢ酶切图谱表明：龟分枝杆菌龟亚种PCR扩增产物被切成340、250、180、100、75bp的5条带，龟分枝杆菌脓肿亚种PCR扩增产物不能被切开，偶然分枝杆菌被切成210、160、100bp左右的3条带。扩增产物的限制性内切酶MspⅠ酶切图谱表明：偶然分枝杆菌被切成190、154、100bp的3条带，龟分枝杆菌龟亚种被切成470、140、100、70bp的4条带，龟分枝杆菌脓肿亚种仍不能被切开。50株龟分枝杆菌脓肿亚种临床分离株结果与上述相同。由此可见，应用PCR扩增和RFLP对16S～23S rDNA间隔区序列进行分析能将这几种受试菌鉴定列种或亚种的水平。
, 百拇医药
讨论
结核菌群是引起人类结核病的主要原因，它们之间生物学特征、临床表现都很相似，临床上很难区分。近年来，随着PCR技术的飞速发展，已可快速有效地检测临床标本中的分枝杆菌，但大多数检测结核分枝杆菌的引物只能将结核杆菌复合菌群与其它非结核分枝杆菌区别开来，而不能区分其所包含的各菌种，Portillo等〔1〕报道的引物仅扩增结核分枝杆菌，不扩增其它分枝杆菌DNA。这是目前已知的结核分枝杆菌最特异的片段，可有效地将结核分枝杆菌引起的疾病区分开。Patel〔2〕设计的引物可区别牛分枝杆菌和结核菌群的其它分枝杆菌。De Wit等〔3〕设计的引物可区别结核分枝杆菌和BCG。我们通过保守性引物a对结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和BCG进行PCR扩增以及扩增产物的限制性内切酶HaeⅢ、MspⅠ消化反应。受试的3种菌这三项结果完全相同，不能区分。而根据我们测序结果设计的引物b，则只能扩出结核分枝杆菌，能将结核分枝杆菌复合菌群彼此区分开。
, 百拇医药
对于人类而言，鸟-胞内分枝杆菌复合菌群的感染并非经常发生。它们主要是以机会感染的方式多在儿童和免疫缺陷病人中发生。由于AIDS的流行，鸟-胞内分枝杆菌复合菌群的感染也日趋引起人们的重视。鸟-胞内分枝杆菌复合菌群包括鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、副结核分枝杆菌以及鸟分枝杆菌Siwoticum，其中鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌表型上难以区分。现在通过16S rDNA序列分析表明，一些原来通过其表型鉴定为胞内分枝杆菌的(血清型4,6,8,11)实际上是鸟分枝杆菌。Johanna等〔4〕报道，应用PCR扩增和DNA探针可以将鸟分枝杆菌和菌群的其它分枝杆菌区分开。Andres等〔5〕报道，二者16S～23S rDNA间隔区序列相差25个碱基，差异可以将二者区分开。而我们16S～23S rDNA间隔区序列扩增及酶切结果相差很大，原因待查。
偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌龟亚种、龟分枝杆菌脓肿亚种属快速生长分枝杆菌，它们多引起手术后感染，慢性肉芽肿等疾病。培养和生化实验可以将它们区分开，但工作量大，我们通过16S～23S rDNA间隔区序列PCR扩增及酶切分析，可快速有效地将它们区分开。
, http://www.100md.com
16S～23S rDNA间隔区序列由于具有普遍性及高变性，用于菌种鉴定具有优越性。我们的研究结果表明，16S～23S rDNA间隔区序列PCR扩增及扩增产物酶切分析可以将分枝杆菌鉴定到种的水平。
参考文献
1，Portillo PD, Bodding B, Marga H, et al. Amplification of a species-specific DNA fragment of M. tuberculosis and its possible use in diagnosis. J Chin Microbiol, 1991, 29:2126-2129.
2，Patel RJ, Hermans PW. Sequence analysis and amplification by polymerase chain reaction of a cloned DNA fragment for identification of M.tuberculosis. J Clin Microbiol, 1990, 28:513-516.
, 百拇医药
3，De Wit MYL, Sankor P, Fries J, et al. Application of a polymerase chain reaction for the detection of M. Leprae in skin tissue. J Clin Microbiol,1991, 29:906-911.
4，Johanna WB, Van dor G, Rene M, et al. Comparison of the 23s ribosomal DNA genes and the spacer region between the 16s and 23s rDNA genes of the closely related M. avium and M. paratuberculosis and fast-growing M. phlei. J Microbiol, 1994, 140:1103-1108.
5，Andres R, Marga F, Mohamed E, et al. Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16s-23s rDNA gene internal transcribed spacer sequence. J Clin Microbiol, 1998, 36:139-148.
(收稿日期：1999-03-11), 百拇医药
单位：100091 北京，解放军309医院结核病研究室
关键词：分枝杆菌复合菌群；PCR；RFLP
中华微生物学和免疫学杂志000410 【 摘要 】 目的 对结核分枝杆菌复合菌群、鸟-胞内分枝杆菌复合菌群以及龟分枝杆菌龟亚种及脓肿亚种等几种快速生长分枝杆菌进行鉴定。 方法 应用通用引物a及结核分枝杆菌特异的引物b，对受试菌种的16S～23S rDNA间隔区序列进行PCR扩增，并对引物a扩增产物进行限制性内切酶HaeⅢ、MSPⅠ消化反应。 结果 应用引物a PCR扩增及RFLP分析能将除结核分枝杆菌复合菌群外的受试的其它菌群中的各菌种区别开；而引物b对受试各菌进行扩增，只有结核分枝杆菌有扩增条带出现，可将结核分枝杆菌与结核分枝杆菌复合菌群的其它菌区别开，达到菌种鉴定目的。 结论 应用16S～23S rDNA间隔区序列PCR和RFLP分析能将结核分枝杆菌复合菌群等几组常规方法难鉴定的菌群加以区别。
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The study of differentiation of several mycobacterium complex by PCR and RELP analysis of 16S-23S rDNA spacer sequence
ZHANG Lingxia, ZHUANG Yuhui
(Mycobacterium Tuberculosis Research Laboratory, 309 Hospital, Beijing 100091,P.R.China)
【 Abstract 】 Objective To evaluate the value of differentiation of several mycobacterium complex by amplifying 16S-23S rDNA spacer sequence and by restriction enzyme analysis of PCR products at gene level. Method
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The conservative primer a and special primer b were used to amplify 16S-23S rDNA spacer sequence M. tuberculosis complex, M. avium-M. intracellulare complex and several species of fast-growing mycobacterium such as M. chelonae subsp. chelonae, M. chelonae subsp. abscessus et al. Results The results of PCR and restriction enzyme of PCR products showed that this method was able to differentiate the species tested at species level except M.tuberculosis complex, using special primer b can differentiate M. tuberculosis from other species of the same complex. Conclusion PCR and RFLP analysis of 16S-23S rDNA spacer sequence can differentiate several mycobacterium complex quickly.
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【 Subject words 】 Mycobacterium complex; PCR; RFLP
分枝杆菌有几组复合菌群，以细菌学反应方法等表型特性往往难以鉴别开，且耗时长。我们应用16S～23S rDNA间隔区序列PCR扩增和RFLP对结核杆菌复合菌群、鸟-胞内分枝杆菌复合群及几种临床致病的快速生长分枝杆菌进行了鉴定，结果报告如下。
材料和方法
菌种来源：如表1 。
引物：a: 5′-GAAGTCGTAACAAGG-3′；5′-CAAGGC
ATCCACCAT-3′。根据文献报道设计，由生工生物工程公司合成。b: 5′-CGGCAGCGTATCCATTGATG-3′；5′-CACGAAAACGCCCCAACTG-3′。根据测序结果，选择碱基的差异性而设计，由赛百胜生物工程公司合成和纯化。
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仪器及试剂：扩增仪为PETe-1型；电泳系统购自北京六一仪器厂；结核杆菌PCR诊断试剂盒由本室提供；限制性核酸内切酶为Promega公司产品。
分枝杆菌菌种基因组DNA提取：按《分子克隆》一书介绍方法进行。
PCR操作：参照本室设计的25μl扩增体系并稍作改进。引物a以94℃变性1min，45℃退火3min，72℃延伸1min，循环30次后，再延伸7min。引物b以94℃变性1min，65℃退火1min，72℃延伸1min，循环30次后再延伸7min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，紫外检测。
限制性内切酶消化反应：40μl扩增产物用酚-氯仿抽提后，沉淀物用10μl 1×TE溶解，取5μl在10μl反应体系中加入3个单位的限制性核酸内切酶，37℃反应2～3h，取消化产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外检测，判定结果。
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表1 试验菌种及来源
Table 1. Strains and its sources No of strains
Strains
(n)
Sources
M.tuberculosis H37Rv
1
National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products
Clinical strains of M.tuberculosis
, 百拇医药
58
Hebei Chest Hospital、Henan Chest Hospital
93302
M.bovis
1
National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products
93303
BCG
1
National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products
, http://www.100md.com
93315
M.avium
1
National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products
93314
M.intracellulare
1
National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products
93323
, 百拇医药
M.fortuitum
1
National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products
Clinical strains of M.fortuitum
1
Hebei Chest Hospital
M.chelonae subsp.Chelonae
1
National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products
, http://www.100md.com
Clinical strains of M.chelonae subsp.chelonae
1
Hebei Chest Hospital
93326
M.chelonae subsp.abscessus
1
National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products
Clinical strains of M.chelonae subsp.abscussus
, 百拇医药
50
Shenzhen Sanitary & Anti-Epidemic Station
图1 引物a对结核杆菌复合菌群鉴定结果
Fig 1. The differentiation of M.tuberculosis complex by primer a
1a. The PCR results of 16S-23S rDNA spacer sequence of M.tuberculosis complex by primer a
1b. The HaeⅢ digest result of PCR products of 16S-23S rDNA spacer sequence of M.tuberculosis complex
, http://www.100md.com
1c. The MspI digest result of PCR products of 16S-23S rDNA spacer sequence of M.tuberculosis complex
1. Marker; 2. M.tuberculosis H37Rv; 3. M.bovis; 4. BCG
结果
1.16S～23S rDNA间隔区序列PCR扩增和RFLP分析对结核杆菌复合群进行鉴定：用引物a对结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、BCG进行扩增。扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果表明，3种菌扩增条带数目和大小均完全相同，都只扩出1条相对分子质量(Mr)在340bp左右的带(如图1a)。它们扩增产物的限制性内切酶消化结果也完全相同(图1b,1c)，都被HaeⅢ切成200、100、50bp左右的3条带，被MSPⅠ切成Mr很近的2条带。16S～23S rDNA间隔区序列PCR扩增及扩增产物的限制性片段长度多态性均无法将结核杆菌复合菌群分开。但是根据测序结果，选择碱基差异设计的引物b对它们进行扩增，只有结核分枝杆菌H37Rv扩增出1条250bp的带(图2)，牛分枝杆菌和BCG均无扩增带出现，可将它们鉴定开。对58株结核分枝杆菌临床分离株(38株耐药株，20株敏感株)受试结果与上述结果一致。
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2.鸟-胞内分枝杆菌复合菌群16S～23S rDNA间隔区序列PCR扩增和RFLP分析：用引物a对鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌进行扩增。结果表明，鸟分枝杆菌扩出2条带，Mr在450、350bp左右，胞内分枝杆菌扩增出1条Mr在350bp左右的条带。扩增产物经限制性核酸内切酶HaeⅢ、MspⅠ酶切后琼脂糖凝胶电泳表明，鸟分枝杆菌被HaeⅢ切成220、200、140、100、50bp左右的5条带，被MspⅠ切成
图2 引物b对结核杆菌复合菌群鉴定结果
Fig 2. The differentiation of M.tuberculosis complex by primer b
1. Marker; 2. M.tuberculosis H37Rv; 3. M.bovis; 4. BCG
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图3 引物a对鸟-胞内分枝杆菌复合菌群鉴定结果
Fig 3. The differentiation of M.avium-M.intracellulare complex by primer a
a. The PCR results of 16S-23S rDNA spacer sequence of M.avium-M.intracellulare complex by primer a
b. The HaeⅢ digest result of PCR products of 16S-23S rNDA spacer sequence of M.avium-M.intracellulare complex
c. The MspI digest result of PCR products of 16S-23S rDNA spacer sequence of M.avium-M.intracellulare complex
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1. Marker; 2. M.avium; 3. M.intracellulare340、310、105、50bp左右的4条带，而胞内分枝杆菌被HaeⅢ切成205、140bp左右的2条带，被MspⅠ切成240、105bp左右的2条带。由上可见，无论是单纯的16S～23S rDNA间隔区序列PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳还是RFLP分析都能将鸟-胞内分枝杆菌复合菌群区分开(图3a、b、c)。
3.16S～23S rDNA间隔区序列PCR扩增和RFLP分析对几种快速生长分枝杆菌的鉴定：用引物a对偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌龟亚种、龟分枝杆菌脓肿亚种的16S～23S rDNA间隔区序列进行PCR扩增。扩增产物琼脂糖凝胶电泳表明，偶然分枝杆菌扩增出1条470bp左右的带，龟分枝杆菌龟亚种扩出470，350bp的2条带，龟分枝杆菌脓肿亚种则能扩出380bp左右的1条带。仅靠PCR扩增就能将这3种快速生长的分枝杆菌鉴别开。扩增产物的限制性核酸内切酶HaeⅢ酶切图谱表明：龟分枝杆菌龟亚种PCR扩增产物被切成340、250、180、100、75bp的5条带，龟分枝杆菌脓肿亚种PCR扩增产物不能被切开，偶然分枝杆菌被切成210、160、100bp左右的3条带。扩增产物的限制性内切酶MspⅠ酶切图谱表明：偶然分枝杆菌被切成190、154、100bp的3条带，龟分枝杆菌龟亚种被切成470、140、100、70bp的4条带，龟分枝杆菌脓肿亚种仍不能被切开。50株龟分枝杆菌脓肿亚种临床分离株结果与上述相同。由此可见，应用PCR扩增和RFLP对16S～23S rDNA间隔区序列进行分析能将这几种受试菌鉴定列种或亚种的水平。
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讨论
结核菌群是引起人类结核病的主要原因，它们之间生物学特征、临床表现都很相似，临床上很难区分。近年来，随着PCR技术的飞速发展，已可快速有效地检测临床标本中的分枝杆菌，但大多数检测结核分枝杆菌的引物只能将结核杆菌复合菌群与其它非结核分枝杆菌区别开来，而不能区分其所包含的各菌种，Portillo等〔1〕报道的引物仅扩增结核分枝杆菌，不扩增其它分枝杆菌DNA。这是目前已知的结核分枝杆菌最特异的片段，可有效地将结核分枝杆菌引起的疾病区分开。Patel〔2〕设计的引物可区别牛分枝杆菌和结核菌群的其它分枝杆菌。De Wit等〔3〕设计的引物可区别结核分枝杆菌和BCG。我们通过保守性引物a对结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和BCG进行PCR扩增以及扩增产物的限制性内切酶HaeⅢ、MspⅠ消化反应。受试的3种菌这三项结果完全相同，不能区分。而根据我们测序结果设计的引物b，则只能扩出结核分枝杆菌，能将结核分枝杆菌复合菌群彼此区分开。
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对于人类而言，鸟-胞内分枝杆菌复合菌群的感染并非经常发生。它们主要是以机会感染的方式多在儿童和免疫缺陷病人中发生。由于AIDS的流行，鸟-胞内分枝杆菌复合菌群的感染也日趋引起人们的重视。鸟-胞内分枝杆菌复合菌群包括鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、副结核分枝杆菌以及鸟分枝杆菌Siwoticum，其中鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌表型上难以区分。现在通过16S rDNA序列分析表明，一些原来通过其表型鉴定为胞内分枝杆菌的(血清型4,6,8,11)实际上是鸟分枝杆菌。Johanna等〔4〕报道，应用PCR扩增和DNA探针可以将鸟分枝杆菌和菌群的其它分枝杆菌区分开。Andres等〔5〕报道，二者16S～23S rDNA间隔区序列相差25个碱基，差异可以将二者区分开。而我们16S～23S rDNA间隔区序列扩增及酶切结果相差很大，原因待查。
偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌龟亚种、龟分枝杆菌脓肿亚种属快速生长分枝杆菌，它们多引起手术后感染，慢性肉芽肿等疾病。培养和生化实验可以将它们区分开，但工作量大，我们通过16S～23S rDNA间隔区序列PCR扩增及酶切分析，可快速有效地将它们区分开。
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16S～23S rDNA间隔区序列由于具有普遍性及高变性，用于菌种鉴定具有优越性。我们的研究结果表明，16S～23S rDNA间隔区序列PCR扩增及扩增产物酶切分析可以将分枝杆菌鉴定到种的水平。
参考文献
1，Portillo PD, Bodding B, Marga H, et al. Amplification of a species-specific DNA fragment of M. tuberculosis and its possible use in diagnosis. J Chin Microbiol, 1991, 29:2126-2129.
2，Patel RJ, Hermans PW. Sequence analysis and amplification by polymerase chain reaction of a cloned DNA fragment for identification of M.tuberculosis. J Clin Microbiol, 1990, 28:513-516.
, 百拇医药
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(收稿日期：1999-03-11), 百拇医药