D3S1358等7个DNA位点的荧光法在法医学中的应用
http://www.100md.com
法医学杂志 2000年第1期第16卷 论著
作者：阙庭志 严品华 林源 赵珍敏 李莉
单位：司法部司法鉴定科学技术研究所，上海 200063
关键词：D3S1358；D16S539；TH01；TPOX；CSF1PO；D7S820；Amelogenin；荧光检测
法医学杂志000106
[摘要]报道了D3S1358、D16S539等7个DNA位点的复合扩增和四色荧光分析技术。经310自动测序仪检测7个位点，实现了STR位点同步扩增和自动检测目的。同一性实验表明，同一个体肌肉、血液、唾液和头发等组织STR位点基因型完全一致。对2个四代家系、3个三代家系的调查结果表明，这些位点符合孟德尔遗传定律。D3S1358、D16S539等7个位点对陈旧、微量的检材适用性很强,灵敏度达75pg，在法医个人识别和亲子鉴定中有着重要意义。
, 百拇医药
[中图分类号]DF795.2 [文献标识码]A
[文章编号]1004-5619(2000)01-0014-02
Multiplex PCR fluorescent detection of DNA Loci and its application in forensic science
Que Tingzhi,et al.
(Institute of Forensic Sciences, Ministry of Justice, Shanghai 200063,P.R.China)
A method is reported using PCR multiplex amplification and fluorescent- labeled primers to genotype D3S1358、 D16S539、 TH01、 TPOX、 CSF1PO、 D7S820 and Amelogenin loci. It is simple,accurate,sensitive and very useful for personal identification and paternity testing.
, 百拇医药
Key words: D3S1358;D16S539;TH01; TPOX; CSF1PO;D7S820; amelogenin; fluorescence detection
短片断串联重复(Short tandem repeat简称STR)广泛存在于人体DNA编码区及非编码区，具有高度遗传多态性。由于STR位点扩增片断较短，其大小分布在100～400bp之间，等位基因片断长度差异小，且多个STR位点可以同时复合扩增，分型简便、灵敏，特别适用于陈旧、微量和降解的生物检材检验[1,2]。
本文报道了D3S1358、D16S539等7个位点复合扩增的四色荧光自动分析法及在法医物证学中的应用。
1 材料和方法
1.1 样本
, http://www.100md.com 血液、血痕、肌肉、羊水、毛根、唾液、精斑和混合斑等为本室日常工作中积累。
1.2 试剂
用于提取样品DNA的CHELEX(50～100目)购自Sigma公司；D3S1358、D16S539等7个位点DNA扩增试剂盒和GeneScan-500[ROX]均购自PE公司。
1.3 仪器及软件
PCR反应在9600扩增仪(PE公司)上进行；用310DNA自动测序仪(PE公司)对扩增产物进行电泳和收集信息；用GeneScan3.1和Genotyper2.1(PE公司)分析收集信息。
1.4 样本DNA提取
1.4.1 血液等组织DNA抽提
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血液、血痕、肌肉、毛根、唾液、精斑和混合斑中精子DNA的提取详见参考文献[3]。
1.4.2 羊水DNA抽提
取100μl羊水，10000r/min离心3min，去上清液，加10μlProteinK(10mg/ml)，200μl10%CHELEX(50～100目)，56℃保温30min后，10000r/min离心3min，上清液即可用于PCR扩增。
1.5 DNA复合扩增[3]
PCR反应总体积为15μl，其中含有模板DNA6μl(0.3～0.6ng)，金牌Tag(5U/μl)0.3μl和引物等。扩增参数为：95℃预变性11min后，接94℃1min，59℃1min，70℃1min，循环28次；最后60℃45min。
1.6 扩增产物的检测[3]
, http://www.100md.com
在0.5ml离心管中加入24μl去离子甲酰胺，1.5μlPCR扩增产物和1μlGeneScan-500(Rox)混匀，离心，95℃变性3～5min后将离心管放进冰浴至样品完全冷却。将离心管放入310DNA测序仪专用的48孔样品架上进行自动吸样和毛细管电泳，用Genescan3.1和Genotyper2.1对电泳片断进行分析。
2 结果
2.1 扩增灵敏度分析
本课题对不同DNA模板量进行PCR扩增，结果表明该方法灵敏度可达75pg，模板DNA量低于75pg时，会影响实验结果的可靠性。
2.2 同一性及稳定性分析
采取同一个体肌肉、血液、唾液和头发等组织进行PCR扩增和基因分析,D3S1358、D16S539等7个位点的检测结果完全一致。
, 百拇医药
对无血缘关系个体血样进行PCR扩增和基因分型，均得到理想检验结果，见图1。
图1 3个无血缘关系个体DNA位点基因型结果
2.3 家系调查
对2个四代家系、3个三代家系共29名成员进行家系分析，表明D3S1358、D16S539等7个位点符合孟德尔遗传定律，均没有基因突变。
2.4 各类检材的DNA检验结果
本文对血液、血痕、肌肉、唾液、羊水、毛根、精斑和混合斑进行基因检测，均获得成功。图2显示各类检材基因型检测结果。
, 百拇医药
图2 各类检材DNA检测结果
3 案例应用
案例1：张某怀孕4个月后指控奚某为强奸者，而奚某否认上述指控。抽取羊水及张某、奚某血样作基因分析，结果见表1。结合其它DNA位点检验结果，经计算奚某与张某所怀胎儿间的亲子关系概率(RCP)值可达99.99%以上，即存在着亲生血缘关系。
表1 案例1检验结果
D3S1358
D16S539
TH01
TPOX
CSF1PO
D7S820
, http://www.100md.com
Amelogenin
张某
15,16
9,12
6,7
8,11
12,12
11,12
X,X
羊水
15,16
11,12
6,9
, 百拇医药
11,11
12,12
11,12
X,Y
奚某
15,16
11,11
9,9
11,11
10,12
12,12
X,Y
案例2：张某与李某因故发生口角并撕打，张某持水果刀朝李某胸部等处猛刺数刀致李某死亡。为明确事实，需对水果刀上的血痕进行DNA分型，结果如表2。结合其它DNA位点检验结果分析，水果刀上的血痕与李某血衣上被检出的基因一致，认定为李某所遗留。
, 百拇医药
表2 案例2检验结果
D3S1358
D16S339
TH01
TPOX
CSF1PO
D7S820
Amelogenin
水果刀上的血痕
15,15
9,11
8,8
, 百拇医药
8,8
11,12
10,12
X,Y
被害人李某血痕
15,15
9,11
8,8
8,8
11,12
10,12
X,Y
4 讨论
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D3S1358、D16S539、TH01、TPOX、CSF1PO、D7S820和Amelogenin(性别)等7个位点扩增片断长度在100～350bp之间，位点核心序列重复片断长度为4bp，比VNTR位点扩增片断更短，更适用于陈旧的和微量的检材DNA分型。家系调查表明，D3S1358、D16S539等7个位点符合孟德尔遗传定律。
本文采用了复合扩增，即7对引物在同一反应管中同时扩增的方法，经四色荧光技术自动检测STR位点和性别位点基因型，提高了检材的利用率，方法简单，且鉴别能力强。
本研究在同一个泳道使用四色荧光和内标技术，对7个DNA位点扩增产物进行分析，避免了常规电泳边缘效应的影响；与基因梯度标准品进行比对，更能准确地判定位点基因型；使用GeneScan3.1和Genotyper2.1等软件对STR位点进行基因定型，分型结果客观、准确，且便于保存和管理。
结果表明，本方法稳定、可靠、灵敏，可成功地应用于血液、血痕、肌肉、羊水、毛根和混合斑等检材的法医学鉴定，在亲子鉴定和个人识别中具有重要作用。
, 百拇医药
参考文献:
[1]Oldroyd NJ, Urguhart AJ, kimpton CP, et al. A highly discriminating octoplex short tandem repeat polymerize chain reaction system suitable for human individual identification[J]. Electrophoresis, 1995, 16:334- 337.
[2]Urquhart A, Oldroyd NJ, kimpton CP, et al. Highly discriminating heptaplex short tandem repeat PCR system for forensic identification [J]. Biotechniques,1995， 18： 116- 121.
[3]PERKIN ELMER Corporation. AmpFe STR Profiler plusTM PCR Amplification Kit User′ s Manual[Z]. 1998, 3:1- 41.
(收稿日期：1999-09-25), http://www.100md.com
单位：司法部司法鉴定科学技术研究所，上海 200063
关键词：D3S1358；D16S539；TH01；TPOX；CSF1PO；D7S820；Amelogenin；荧光检测
法医学杂志000106
[摘要]报道了D3S1358、D16S539等7个DNA位点的复合扩增和四色荧光分析技术。经310自动测序仪检测7个位点，实现了STR位点同步扩增和自动检测目的。同一性实验表明，同一个体肌肉、血液、唾液和头发等组织STR位点基因型完全一致。对2个四代家系、3个三代家系的调查结果表明，这些位点符合孟德尔遗传定律。D3S1358、D16S539等7个位点对陈旧、微量的检材适用性很强,灵敏度达75pg，在法医个人识别和亲子鉴定中有着重要意义。
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[中图分类号]DF795.2 [文献标识码]A
[文章编号]1004-5619(2000)01-0014-02
Multiplex PCR fluorescent detection of DNA Loci and its application in forensic science
Que Tingzhi,et al.
(Institute of Forensic Sciences, Ministry of Justice, Shanghai 200063,P.R.China)
A method is reported using PCR multiplex amplification and fluorescent- labeled primers to genotype D3S1358、 D16S539、 TH01、 TPOX、 CSF1PO、 D7S820 and Amelogenin loci. It is simple,accurate,sensitive and very useful for personal identification and paternity testing.
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Key words: D3S1358;D16S539;TH01; TPOX; CSF1PO;D7S820; amelogenin; fluorescence detection
短片断串联重复(Short tandem repeat简称STR)广泛存在于人体DNA编码区及非编码区，具有高度遗传多态性。由于STR位点扩增片断较短，其大小分布在100～400bp之间，等位基因片断长度差异小，且多个STR位点可以同时复合扩增，分型简便、灵敏，特别适用于陈旧、微量和降解的生物检材检验[1,2]。
本文报道了D3S1358、D16S539等7个位点复合扩增的四色荧光自动分析法及在法医物证学中的应用。
1 材料和方法
1.1 样本
, http://www.100md.com 血液、血痕、肌肉、羊水、毛根、唾液、精斑和混合斑等为本室日常工作中积累。
1.2 试剂
用于提取样品DNA的CHELEX(50～100目)购自Sigma公司；D3S1358、D16S539等7个位点DNA扩增试剂盒和GeneScan-500[ROX]均购自PE公司。
1.3 仪器及软件
PCR反应在9600扩增仪(PE公司)上进行；用310DNA自动测序仪(PE公司)对扩增产物进行电泳和收集信息；用GeneScan3.1和Genotyper2.1(PE公司)分析收集信息。
1.4 样本DNA提取
1.4.1 血液等组织DNA抽提
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血液、血痕、肌肉、毛根、唾液、精斑和混合斑中精子DNA的提取详见参考文献[3]。
1.4.2 羊水DNA抽提
取100μl羊水，10000r/min离心3min，去上清液，加10μlProteinK(10mg/ml)，200μl10%CHELEX(50～100目)，56℃保温30min后，10000r/min离心3min，上清液即可用于PCR扩增。
1.5 DNA复合扩增[3]
PCR反应总体积为15μl，其中含有模板DNA6μl(0.3～0.6ng)，金牌Tag(5U/μl)0.3μl和引物等。扩增参数为：95℃预变性11min后，接94℃1min，59℃1min，70℃1min，循环28次；最后60℃45min。
1.6 扩增产物的检测[3]
, http://www.100md.com
在0.5ml离心管中加入24μl去离子甲酰胺，1.5μlPCR扩增产物和1μlGeneScan-500(Rox)混匀，离心，95℃变性3～5min后将离心管放进冰浴至样品完全冷却。将离心管放入310DNA测序仪专用的48孔样品架上进行自动吸样和毛细管电泳，用Genescan3.1和Genotyper2.1对电泳片断进行分析。
2 结果
2.1 扩增灵敏度分析
本课题对不同DNA模板量进行PCR扩增，结果表明该方法灵敏度可达75pg，模板DNA量低于75pg时，会影响实验结果的可靠性。
2.2 同一性及稳定性分析
采取同一个体肌肉、血液、唾液和头发等组织进行PCR扩增和基因分析,D3S1358、D16S539等7个位点的检测结果完全一致。
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对无血缘关系个体血样进行PCR扩增和基因分型，均得到理想检验结果，见图1。
图1 3个无血缘关系个体DNA位点基因型结果
2.3 家系调查
对2个四代家系、3个三代家系共29名成员进行家系分析，表明D3S1358、D16S539等7个位点符合孟德尔遗传定律，均没有基因突变。
2.4 各类检材的DNA检验结果
本文对血液、血痕、肌肉、唾液、羊水、毛根、精斑和混合斑进行基因检测，均获得成功。图2显示各类检材基因型检测结果。
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图2 各类检材DNA检测结果
3 案例应用
案例1：张某怀孕4个月后指控奚某为强奸者，而奚某否认上述指控。抽取羊水及张某、奚某血样作基因分析，结果见表1。结合其它DNA位点检验结果，经计算奚某与张某所怀胎儿间的亲子关系概率(RCP)值可达99.99%以上，即存在着亲生血缘关系。
表1 案例1检验结果
D3S1358
D16S539
TH01
TPOX
CSF1PO
D7S820
, http://www.100md.com
Amelogenin
张某
15,16
9,12
6,7
8,11
12,12
11,12
X,X
羊水
15,16
11,12
6,9
, 百拇医药
11,11
12,12
11,12
X,Y
奚某
15,16
11,11
9,9
11,11
10,12
12,12
X,Y
案例2：张某与李某因故发生口角并撕打，张某持水果刀朝李某胸部等处猛刺数刀致李某死亡。为明确事实，需对水果刀上的血痕进行DNA分型，结果如表2。结合其它DNA位点检验结果分析，水果刀上的血痕与李某血衣上被检出的基因一致，认定为李某所遗留。
, 百拇医药
表2 案例2检验结果
D3S1358
D16S339
TH01
TPOX
CSF1PO
D7S820
Amelogenin
水果刀上的血痕
15,15
9,11
8,8
, 百拇医药
8,8
11,12
10,12
X,Y
被害人李某血痕
15,15
9,11
8,8
8,8
11,12
10,12
X,Y
4 讨论
, http://www.100md.com
D3S1358、D16S539、TH01、TPOX、CSF1PO、D7S820和Amelogenin(性别)等7个位点扩增片断长度在100～350bp之间，位点核心序列重复片断长度为4bp，比VNTR位点扩增片断更短，更适用于陈旧的和微量的检材DNA分型。家系调查表明，D3S1358、D16S539等7个位点符合孟德尔遗传定律。
本文采用了复合扩增，即7对引物在同一反应管中同时扩增的方法，经四色荧光技术自动检测STR位点和性别位点基因型，提高了检材的利用率，方法简单，且鉴别能力强。
本研究在同一个泳道使用四色荧光和内标技术，对7个DNA位点扩增产物进行分析，避免了常规电泳边缘效应的影响；与基因梯度标准品进行比对，更能准确地判定位点基因型；使用GeneScan3.1和Genotyper2.1等软件对STR位点进行基因定型，分型结果客观、准确，且便于保存和管理。
结果表明，本方法稳定、可靠、灵敏，可成功地应用于血液、血痕、肌肉、羊水、毛根和混合斑等检材的法医学鉴定，在亲子鉴定和个人识别中具有重要作用。
, 百拇医药
参考文献:
[1]Oldroyd NJ, Urguhart AJ, kimpton CP, et al. A highly discriminating octoplex short tandem repeat polymerize chain reaction system suitable for human individual identification[J]. Electrophoresis, 1995, 16:334- 337.
[2]Urquhart A, Oldroyd NJ, kimpton CP, et al. Highly discriminating heptaplex short tandem repeat PCR system for forensic identification [J]. Biotechniques,1995， 18： 116- 121.
[3]PERKIN ELMER Corporation. AmpFe STR Profiler plusTM PCR Amplification Kit User′ s Manual[Z]. 1998, 3:1- 41.
(收稿日期：1999-09-25), http://www.100md.com